一种白假丝酵母菌及其在发酵饲料中的应用的制作方法

1.本发明涉及一种微生物技术领域，具体涉及一种白假丝酵母菌及其在发酵饲料中的应用。


背景技术：

2.白假丝酵母是属于半知菌纲(fungi imperficti)的球壳目(xylariaceae)假丝酵母属(candida)的单细胞酵母。白假丝酵母(candida albicans)，又称白念珠菌或者白色念珠菌，是单细胞真菌。菌体呈圆形或卵圆形，革兰氏染色阳性，着色不均，以芽生方式繁殖。在组织内易形成芽生孢子及假菌丝，芽生孢子多集中在假菌丝的连接部位，假菌丝中间或顶端常有较大、壁薄的圆形或梨形厚膜孢子，是本菌特征之一。
3.白假丝酵母在普通的琼脂、血琼脂与沙保培养基上均生长良好，菌落呈类酵母型。在玉米粉培养基上可长出厚膜孢子。白假丝酵母的假菌丝和厚膜孢子有助于鉴定。
4.白假丝酵母属条件致病菌，通常存在于人体表与腔道中，当正常菌群失调或抵抗力降低时，白假丝酵母则可侵犯人体许多部位，如皮肤、粘膜、肺、肠、肾和脑，引起皮肤粘膜感染(常见鹅口疮、外阴炎及阴道炎)、内脏感染和中枢神经系统感染等，粘膜感染以鹅口疮最多。
5.现有技术中记载的白假丝酵母是条件致病菌，不具有饲料发酵的应用价值；目前尚没有将白假丝酵母用于制备发酵饲料的报道。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种白假丝酵母菌及其在发酵饲料中的应用。
7.为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：
8.发明提供的白假丝酵母菌(candida albicans)gl1，该菌株gl1保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为cgmcc no.22844。
9.白假丝酵母菌(candida albicans)gl1的分离纯化和鉴定，包括下述步骤：
10.(1)将橄榄果渣样品10倍系列稀释后，吸取适宜稀释度样液涂布于pda 培养基平板，26
‑
30℃培养70
‑
74h后，挑取具有酵母菌典型菌落特征的菌落进行多次平板划线纯化，得到初筛菌体，转接种至斜面培养基4℃保存备用；
11.(2)用无菌生理盐水调整步骤(1)初筛菌体浓度为108cfu/ml，以体积百分比4％
‑
6％的接种量接种至pdb培养基中，26
‑
30℃培养70
‑
74h后，以 8000r/min 4℃离心5min，去除上清液，生理盐水清洗菌体沉淀，然后将菌体烘至恒重，检测菌体的蛋白含量，菌体蛋白含量达到41％，编号此菌株为gl1；菌株gl1经过生理生化和分子生物学鉴定为白假丝酵母菌(candida albicans)，白假丝酵母菌(candida albicans)gl1菌落呈奶酪状、乳白色，表面光滑，返光，边缘流苏状。
12.本发明提供的白假丝酵母菌gl1在发酵饲料中的应用。
13.本发明提供的利用上述的白假丝酵母菌gl1生产发酵饲料的方法，包括下述步骤：
14.(1)种子液的制备
15.将白假丝酵母菌gl1培养后制成酵母菌种子液；
16.(2)接种发酵
17.以橄榄果渣、麸皮和纤维素酶为原料制备出橄榄果渣
‑
麸皮培养基，将步骤 (1)中的酵母菌种子液接种至橄榄果渣
‑
麸皮培养基中，发酵后得到发酵饲料。
18.进一步的，所述步骤(1)中，种子液的制备具体包括下述步骤：
19.a1、将白假丝酵母菌gl1接种于斜面培养基上，28
‑
32℃静置培养2.0d，然后转接种到pdb培养基中，于28
‑
32℃摇床培养2.5
‑
3.5d；然后按体积百分比以5％
‑
15％的接种量接种到pdb培养基中，于28
‑
32℃摇床培养2.0
‑
3.0d，得到培养菌液；
20.a2、将培养菌液离心，收集菌体；将收集的菌体洗涤后重悬，得到酵母菌种子液。
21.进一步的，所述步骤a1中，所述斜面培养基中：马铃薯浸出粉的浓度为 4
‑
8g/l，葡萄糖的浓度为15
‑
25g/l，氯霉素的浓度为0.05
‑
0.15g/l；琼脂粉18
‑
22 g/l。
22.进一步的，所述步骤a1中，pdb培养基中，马铃薯浸出粉的浓度为4
‑
8g /l，葡萄糖的浓度为15
‑
25g/l，氯霉素的浓度为0.05
‑
0.15g/l。
23.进一步的，所述步骤a1中，所述pdb培养基的初始ph为5.4
‑
5.8。
24.进一步的，所述步骤a2中，收集菌体是以6000
‑
10000r/min在3
‑
5℃离心培养菌液；洗涤菌体是以3000
‑
7000r/min在3
‑
5℃离心3
‑
7min。
25.进一步的，所述步骤(2)中，接种发酵具体包括下述步骤：
26.b1、制备橄榄果渣
‑
麸皮培养基：
27.以橄榄果渣、麸皮和纤维素酶为原料，所述麸皮的添加量为橄榄果渣重量的7％，所述纤维素酶的添加量为橄榄果渣和麸皮总重量的0.01％
‑
0.03％；其制备是先将橄榄果渣和麸皮混合均匀在121℃灭菌20min，然后加入纤维素酶混合均匀后，于43
‑
47℃静止培养11
‑
13h；最后，添加无菌水保证培养基终水分含量为50％
‑
60％，得到橄榄果渣
‑
麸皮培养基；
28.b2、按体积百分比5％
‑
15％的接种量将酵母种子液接种至步骤b1中的橄榄果渣
‑
麸皮培养基中，于25
‑
32℃静置发酵4
‑
10d，得到发酵饲料，采用 gb/t6432
‑
2018检测蛋白含量。
29.进一步的，所述b2中，按体积百分比10％的接种量将酵母种子液接种至步骤b1中的橄榄果渣
‑
麸皮培养基。
30.基于上述技术方案，本发明实施例至少可以产生如下技术效果：
31.本发明提供的白假丝酵母菌，是从橄榄果渣中提取的一种白假丝酵母的新型菌株，能够应用于发酵饲料中，通过本发明中白假丝酵母菌发酵后能使橄榄果渣
‑
麸皮(发酵饲料)中蛋白含量增加78％左右，蛋白含量增加明显，且发酵条件简单，在发酵饲料的应用中具有明显的优势，当然也可以将其应用于苹果渣等水果渣中进行发酵。
附图说明
32.图1是本发明中白假丝酵母菌gl1的菌落形态图；
33.图2是本发明中白假丝酵母菌gl1的显微形态图。
具体实施方式
34.一、培养基说明：
35.斜面培养基：将马铃薯浸出粉6.0g、葡萄糖20.0g、氯霉素0.1g和琼脂粉 20.0g，溶解于1000ml蒸馏水中，然后调整ph为5.4
‑
5.8，最后在121℃灭菌 20min，即得斜面培养基。
36.pdb培养基：将马铃薯浸出粉6.0g、葡萄糖20.0g和氯霉素0.1g，溶解于 1000ml蒸馏水中，然后调整ph为5.4
‑
5.8，最后在121℃灭菌20min，即得 pdb培养基。
37.pda培养基：将马铃薯浸出粉6.0g、葡萄糖20.0g、氯霉素0.1g和琼脂粉 20.0g，溶解于1000ml蒸馏水中，然后调整ph为5.4
‑
5.8，最后在121℃灭菌 20min，即得pda培养基。
38.二、实施例
39.实施例1：
40.白假丝酵母菌(candida albicans)gl1的分离纯化和鉴定，包括下述步骤：
41.(1)将橄榄果渣样品10倍系列稀释后，吸取100μl释度样液涂布于pda 培养基平板，28℃培养72h后，挑取具有酵母菌典型菌落特征的菌落进行多次平板划线纯化，得到初筛菌体，转接种至斜面培养基4℃保存备用；
42.(2)用无菌生理盐水调整步骤(1)初筛菌体浓度为108cfu/ml，以体积百分比5％的接种量接种至pdb培养基中，28℃培养72h后，以8000r/min4℃离心5min，去除上清液，生理盐水清洗菌体沉淀3次，105℃将菌体烘至恒重，检测菌体的蛋白含量(检测标准为gb/t 6432
‑
2018)，菌体蛋白含量达到41％，编号此菌株为gl1(如图1和图2所示)；菌株gl1经过生理生化和分子生物学鉴定为白假丝酵母菌(candida albicans)，白假丝酵母菌(candida albicans) gl1菌落呈奶酪状、乳白色，表面光滑，返光，边缘流苏状。
43.白假丝酵母菌(candida albicans)gl1可以用来发酵橄榄果渣
‑
麸皮，生产高蛋白饲料。发酵后的橄榄果渣
‑
麸皮的蛋白含量比初始橄榄果渣
‑
麸皮的蛋白含量可以提高78％以上。
44.实施例2：
45.本发明提供的一种利用实施例1中获得的白假丝酵母菌gl1发酵生产发酵饲料的方法，包括下述步骤：
46.(1)种子液制备
47.a1、将白假丝酵母菌gl1接种于斜面培养基上，30℃静置培养2.0d；然后将白假丝酵母菌从斜面培养基上挑去一环接种到5ml pdb培养基中，于30℃摇床培养3d；然后按体积百分比以10％的接种量接种到pdb培养基中，于30℃摇床培养2.5d，得到培养菌液；
48.a2、将40ml培养菌液以8000r/min在4℃离心5min，收集菌体；将收集的菌体用无菌生理盐水清洗菌体1次，以5000r/min在4℃离心5min进行洗涤，洗涤后的菌体用40ml生理盐水重悬，得到酵母菌种子液。
49.(2)接种发酵
50.b1、制备橄榄果渣
‑
麸皮培养基：
51.以橄榄果渣、麸皮和纤维素酶为原料，所述麸皮的添加量为橄榄果渣重量的7％，所述纤维素酶的添加量为橄榄果渣和麸皮总重量的0.02％；其制备是先将橄榄果渣和麸皮混合均匀在121℃灭菌20min，然后加入纤维素酶混合均匀后，于45℃静止培养12h；最后，添加无菌水保证培养基终水分含量为55％，得到橄榄果渣
‑
麸皮培养基；
52.b2、按体积百分比10％的接种量将酵母种子液接种至步骤b1中的橄榄果渣
‑
麸皮培养基中，于27℃静置发酵6d，得到发酵饲料。
53.实施例3：
54.本发明提供的一种利用实施例1中获得的白假丝酵母菌gl1发酵生产发酵饲料的方法，包括下述步骤：
55.(1)种子液制备
56.a1、将白假丝酵母菌gl1接种于斜面培养基上，32℃静置培养1.5d；然后将白假丝酵母菌从斜面培养基上挑去一环接种到5ml pdb培养基中，于32℃摇床培养2.5d；然后按体积百分比以5％的接种量接种到pdb培养基中，于32℃摇床培养2.0d，得到培养菌液；
57.a2、将40ml培养菌液以10000r/min在5℃离心3min，收集菌体；将收集的菌体用无菌生理盐水清洗菌体1次，以7000r/min在5℃离心3min进行洗涤，洗涤后的菌体用40ml生理盐水重悬，得到酵母菌种子液。
58.(2)接种发酵
59.b1、制备橄榄果渣
‑
麸皮培养基：
60.以橄榄果渣、麸皮和纤维素酶为原料，所述麸皮的添加量为橄榄果渣重量的7％，所述纤维素酶的添加量为橄榄果渣和麸皮总重量的0.03％；其制备是先将橄榄果渣和麸皮混合均匀在121℃灭菌20min，然后加入纤维素酶混合均匀后，于47℃静止培养11h；最后，添加无菌水保证培养基终水分含量为60％，得到橄榄果渣
‑
麸皮培养基；
61.b2、按体积百分比15％的接种量将酵母种子液接种至步骤b1中的橄榄果渣
‑
麸皮培养基中，于32℃静置发酵4d，得到发酵饲料。
62.实施例4：
63.本发明提供的一种利用实施例1中获得的白假丝酵母菌gl1发酵生产发酵饲料的方法，包括下述步骤：
64.(1)种子液制备
65.a1、将白假丝酵母菌gl1接种于斜面培养基上，28℃静置培养2.5d；然后将白假丝酵母菌从斜面培养基上挑去一环接种到5ml pdb培养基中，于28℃摇床培养3.5d；然后按体积百分比以5％的接种量接种到pdb培养基中，于28℃摇床培养3.0d，得到培养菌液；
66.a2、将40ml培养菌液以6000r/min在3℃离心7min，收集菌体；将收集的菌体用无菌生理盐水清洗菌体1次，以3000r/min在3℃离心7min进行洗涤，洗涤后的菌体用40ml生理盐水重悬，得到酵母菌种子液。
67.(2)接种发酵
68.b1、制备橄榄果渣
‑
麸皮培养基：
69.以橄榄果渣、麸皮和纤维素酶为原料，所述麸皮的添加量为橄榄果渣重量的7％，所述纤维素酶的添加量为橄榄果渣和麸皮总重量的0.01％％；其制备是先将橄榄果渣和麸皮混合均匀在121℃灭菌20min，然后加入纤维素酶混合均匀后，于43℃静止培养13h；最后，添加无菌水保证培养基终水分含量为50％，得到橄榄果渣
‑
麸皮培养基；
70.b2、按体积百分比5％的接种量将酵母种子液接种至步骤b1中的橄榄果渣
ꢀ‑
麸皮培养基中，于25℃静置发酵10d，得到发酵饲料。
71.实施例5：
72.本发明提供的一种利用实施例1中获得的白假丝酵母菌gl1发酵生产发酵饲料的方法，包括下述步骤：
73.(1)种子液制备
74.a1、将白假丝酵母菌gl1接种于斜面培养基上，30℃静置培养2.0d；然后将白假丝酵母菌从斜面培养基上挑去一环接种到5ml pdb培养基中，于30℃摇床培养3d；然后按体积百分比以12％的接种量接种到pdb培养基中，于30℃摇床培养3.0d，得到培养菌液；
75.a2、将40ml培养菌液以8000r/min在4℃离心5min，收集菌体；将收集的菌体用无菌生理盐水清洗菌体1次，以6000r/min在5℃离心5min进行洗涤，洗涤后的菌体用40ml生理盐水重悬，得到酵母菌种子液。
76.(2)接种发酵
77.b1、制备橄榄果渣
‑
麸皮培养基：
78.以橄榄果渣、麸皮和纤维素酶为原料，所述麸皮的添加量为橄榄果渣重量的7％，所述纤维素酶的添加量为橄榄果渣和麸皮总重量的0.015％；其制备是先将橄榄果渣和麸皮混合均匀在121℃灭菌20min，然后加入纤维素酶混合均匀后，于46℃静止培养12h；最后，添加无菌水保证培养基终水分含量为50％
‑
60％，得到橄榄果渣
‑
麸皮培养基；
79.b2、按体积百分比12％的接种量将酵母种子液接种至步骤b1中的橄榄果渣
‑
麸皮培养基中，于30℃静置发酵7d，得到发酵饲料。
80.实施例6：
81.本发明提供的一种利用实施例1中获得的白假丝酵母菌gl1发酵生产发酵饲料的方法，包括下述步骤：
82.(1)种子液制备
83.a1、将白假丝酵母菌gl1接种于斜面培养基上，29℃静置培养2.0d；然后将白假丝酵母菌从斜面培养基上挑去一环接种到5ml pdb培养基中，于31℃摇床培养3.2d；然后按体积百分比以8％的接种量接种到pdb培养基中，于30℃摇床培养2.0d，得到培养菌液；
84.a2、将40ml培养菌液以7000r/min在4℃离心5min，收集菌体；将收集的菌体用无菌生理盐水清洗菌体1次，以5000r/min在4℃离心5min进行洗涤，洗涤后的菌体用40ml生理盐水重悬，得到酵母菌种子液。
85.(2)接种发酵
86.b1、制备橄榄果渣
‑
麸皮培养基：
87.以橄榄果渣、麸皮和纤维素酶为原料，所述麸皮的添加量为橄榄果渣重量的7％，所述纤维素酶的添加量为橄榄果渣和麸皮总重量的0.02％；其制备是先将橄榄果渣和麸皮混合均匀在121℃灭菌20min，然后加入纤维素酶混合均匀后，于45℃静止培养12h；最后，添加无菌水保证培养基终水分含量为55％，得到橄榄果渣
‑
麸皮培养基；
88.b2、按体积百分比10％的接种量将酵母种子液接种至步骤b1中的橄榄果渣
‑
麸皮培养基中，于28℃静置发酵9d，得到发酵饲料。
89.三、发酵结果：
90.实施例2
‑
6中，检测橄榄果渣
‑
麸皮培养基发酵前和发酵后(发酵饲料)的蛋白含量变化，检测标准为gb/t 6432
‑
2018，并计算蛋白含量提高率，结果如下表1所示：
91.表1蛋白含量
[0092] 橄榄果渣
‑
麸皮培养基发酵饲料蛋白含量提高率实施例29.1％16.2％78.02％实施例38.8％12.5％42.05％实施例48.9％15.0％68.54％实施例59.1％16.1％76.92％实施例68.9％15.4％73.03％
[0093]
由表1
‑
表5可知，在橄榄果渣
‑
麸皮培养基发酵4
‑
10d后，蛋白含量得到的明显提高，发酵4天蛋白含量能提高42.05％，发酵6天，蛋白含量能提高78.02％，而随着发酵时间的继续延长，蛋白含量的提高率逐渐降低，说明发酵6天左右蛋白含量的提高率为最高。