一种甲基丙二酸血症相关基因mmachc突变位点及其检测方法
技术领域：
：1.本发明关于生物
技术领域：
：，涉及一种甲基丙二酸血症相关基因mmachc突变位点及其检测方法。
背景技术：
：：2.甲基丙二酸血症(methylmalonicaciduria,mma)属常染色体隐性遗传遗传病，是致命的，严重的异质性丙二酸甲酯和钴胺素代谢异常，预后不良所致。mma患者的发病率和死亡率很高，长期生存的预后很差。其发作期从新生儿期到成年期不等，患病的儿童通常表现出厌食症，肌张力低下，发育迟缓，进行性肾衰竭，功能性免疫功能减退，视神经萎缩和血液学异常。严重者可引起酮症酸中毒、低血糖、高血氨、高甘氨酸血症，在新生儿、婴幼儿期病死率较高。造成这样后果的一个重要原因是mma的致病突变还未完全清楚，导致患者在未发病时通过基因筛查不能尽早的发现患病风险，因此不能尽早进行干预。3.目前临床上主要检测方法为临床症状结合尿气相色谱质谱检测、血串联质谱检测，需要反复检测或基因检测才能诊断或排除此病。对于检测胎儿是否患病是通过妊娠过程中羊水穿刺进行甲基丙二酸血症(mma)的产前筛查，它是一项侵入性的操作技术，对于操作人员，环境，孕周等有严格的要求限制。而由于基因检测中现有致病位点的不全面，即现有致病位点大多为发病率较高的致病位点，某些发病率较低或其它导致mma的突变位点目前不明确，因此会导致假阴性结果。4.目前在临床诊断中检测基因致病位点的方法主要为一代测序，即sanger测序，此种方法成本高通量低，所需时间较长，检测效率低下。技术实现要素：5.本发明的目的在于克服现有mma基因突变位点的不完整，提供新的13种mmachc基因突变，使mma的基因检测更加准确，检测出mma的相关的基因突变后，尽早进行干预和治疗。6.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：7.一种甲基丙二酸血症相关基因mmachc突变位点，所述突变位点为：c.2t>g、c.2t>c、c.81 1g>a、c.395g>a、c.426c>a、c.427c>t、c.429 1g>c、c.481c>g、c.481c>a、c.616del、c.616c>t、c.617g>c或c.626_627deltg；8.上述突变点的起始位置和基因序列为：[0009][0010][0011]一种上述甲基丙二酸血症相关基因突变位点的检测方法，采用二代靶向测序检测。所述的二代靶向测序检测采用二代靶向测序ions5tm测序仪[0012]有益效果[0013](1)本发明通过二代靶基因测序技术检测遗传物质是否为突变基因携带者，来评估患甲基丙二酸血症的风险，通过提取出患病新生儿血液中的dna，利用二代靶基因测序技术检测患者的dna序列，与健康人的基因进行比对，得出新的13种mmachc基因位点突变与甲基丙二酸血症相关与甲基丙二酸血症相关。本发明扩大mma了产前筛查的范围，能够在婚前、产前评估mma患病风险，在最大程度上防止mma胎儿的出生，具有非常重要的临床意义和社会意义。[0014](2)本发明所述mmachc基因致病位点均为本发明首次发现，所述突变位点在甲基丙二酸血症的筛查和基因诊断中具有潜在的应用前景，上述都基因突变点的发现，为扩大mma产前筛查的范围，提高检测准确率，为临床资料效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。具体实施方式[0015]下面结合具体实施实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：[0016]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0017]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。[0018]实施例1[0019]取济南市妇幼保健院68例已确诊mma的新生儿外周血2ml，加入抗凝剂采血管中，低温保存送检。[0020]对于采集的68例血液样本进行检查，低温低速离心后检查是否出现溶血现象。合格的血液样本离心后分层，呈清晰的血浆、中间层和红细胞层。将血浆、中间层和红细胞分别转移至冻存管中，‑20℃保存。[0021]从血液中间层样本中提取dna试剂盒：tianampblooddnakit试剂盒。[0022]dna文库构建使试剂盒：ionampliseqtmlibrarykitplus试剂盒。具体过程如下：[0023](1)dna稀释[0024]1)dna定量：使用qubittmdsdnahsassay试剂盒进行dna定量。[0025]a.将10μl标准品1和2分别加入到2个0.5ml的assay管中，并加入190μl稀释后的dsdnahs试剂补足200μl，涡旋2～3s，注意不要产生气泡。[0026]b.取1‑20μl待测dna加入assay管中，并加入相应体积稀释后的dsdnahs试剂补足200ul，涡旋2～3s，注意不要产生气泡。[0027]c.室温孵育2min。[0028]d.使用qubit3荧光计测定浓度并记录。[0029]2)dna稀释：根据所测得浓度的最小值和最大值，确定pcr体系所需dna浓度，体系总体积为6μl，dna含量为1‑100ng。根据计算结果取适量dna加无核酸酶水稀释至6μl。[0030](2)dna靶向扩增[0031]1)准备0.2ml灭菌无酶pcr管，按照表1加入试剂，并吹打混匀。[0032]表1.dna靶向扩增组分[0033][0034]2)按照表2程序进行pcr扩增[0035]表2.pcr扩增程序[0036][0037]扩增后产物可在10℃过夜保存，长期保存需在‑20℃保存。[0038](3)部分消化扩增子[0039]1)将上述20μl体系短暂离心。加入2μlfupa酶，短暂涡旋、离心。[0040]2)按照表3程序进行pcr反应。[0041]表3.fupa酶消化pcr程序[0042][0043]可在10℃存放1h，长期保存需存放在‑20℃。[0044](4)连接接头到扩增子[0045]1)配置接头反应液[0046]按表4将各组分混合。[0047]表4.接头反应液组分[0048][0049]2)进行连接反应[0050]a.switchsolutin在室温下化冻溶解。[0051]b.将步骤(3)的pcr产物短暂离心。[0052]c.按照表5将下列试剂加入到步骤(3)的pcr产物中[0053]表5.连接反应组分[0054]table5.componentofligation[0055][0056]d.短暂涡旋后短暂离心。[0057]e.按照表6程序进行pcr反应。[0058]表6.连接反应pcr程序[0059][0060]反应结束则文库构建完成，文库可在10℃保存24h，长期保存需存放在‑20℃文库构建后，需进行纯化文库，具体步骤如下：[0061](1)首先将agencourttmampuretmxp试剂室温平衡30min。[0062](2)短暂离心步骤(4)完成连接反应的文库，转移到1.5ml无菌吸附ep管中。[0063](3)向文库中加入45μlagencourttmampuretmxpreagent，小心吹打5次，于室温放置5min。[0064](4)把ep管放到dynamag‑2架上，等待2min，然后小心地吸去上清。[0065](5)取150μl新鲜配制的70％乙醇至ep管中，180°旋转ep管两次以洗涤磁珠，然后小心地移除上清。[0066](6)重复步骤5)。[0067](7)ep管敞口，室温下在dynamag‑2架上静置以干燥磁珠，时间≤5min，以免干燥过度。[0068](8)洗脱文库[0069]1)把ep管从dynamag‑2架移走，加50μllowte使磁珠分散。[0070]2)吸取te吹打干燥磁珠使其混匀，室温孵育2min。[0071]3)放置于dynamag‑2架上室温孵育5min。[0072]带溶液澄清后取20μl上清，得到纯化文库。[0073]文库定量，具体步骤如下：[0074](1)稀释文库：取2μl文库，加入198μl无核酸酶水。[0075](2)将e.colidh10b对照文库(～68pm)稀释至3个10倍浓度梯度，分别为6.8pm、0.68pm和0.068pm,作为标准品。[0076](3)准备反应混合液。按照每个样本、对照和标准品都准备20μl2xionlibraryqpcrmastermix和2μl20xionlibraryquantitationassay，将它们混合，没管加入11μl混合液。[0077](4)加入9μl稀释后的ionampliseqtm文库或9μl对照溶液，得到总体系20μl。[0078](5)按照表7程序进行qpcr。[0079]表7.文库定量pcr程序[0080][0081](6)根据qpcr结果计算原文库浓度：检测到的浓度乘以100，取平均值，到原文库浓度。[0082](7)将文库稀释至100pm，并合并文库。[0083]利用二代靶向测序精准快速测得序列，具体步骤如下：[0084]1.模板准备[0085](1)装配并启动iononetouchtm2仪器[0086](2)准备扩增溶液[0087]1)准备isps：高速涡旋1min，离心2s，吹打混合均匀。[0088]2)按照表8将下列组分加至一管2ml的ions5tmreagentmix中，用移液器小心地吹打混合均匀。[0089]表8.扩增溶液组分[0090][0091]3)将扩增溶液填充入反应过滤器组件，并将其安装到iononetouchtm2上，运行iononetouchtm2，开始反应。反应结束后离心。[0092](3)清洗带有模板的isps[0093]1)从iononetouchtm2取下iononetouchtmrecovery管，小心吸取上清液但不要完全移除，留下～100μl上清液。[0094]2)小心地吹打使带有模板的isps重悬。[0095]3)将所有悬液合并到新的1.5ml低吸附无菌ep管里。[0096]4)取～100μl无核酸酶水至iononetouchtmrecovery管里，小心地吹打混合均匀，将剩余的isps转到步骤3)的ep管里。[0097]5)加无核酸酶水至1ml。涡旋30s，15,000×g离心8min。[0098]6)小心移除上清，留下～20μl。[0099]7)加无核酸酶水至100μl，涡旋30s，短暂离心。[0100]2.富集带有模板的isps[0101](1)准备melt‑offsolution：按照表9配制melt‑offsolution。[0102]表9.洗脱液组分[0103][0104](2)清洗重悬dynabeadstmmyonetmstreptavidinc1beads。[0105]1)dynabeadstmmyonetmstreptavidinc1beads涡旋30s，使其重悬。[0106]2)立即取100μldynabeadstmmyonetmstreptavidinc1beads加入到一个新的1.5ml低吸附无菌ep管中[0107]3)1.5mlep管在dynamag‑2架放置2min，小心地吸去上清。[0108]4)加入1mliononetouchtmwashsolution。将ep管从dynamag‑2架上移走，涡旋30s，离心2s。[0109]5)把离心管在dynamag‑2架上等待2min，小心地吸去上清。[0110]6)加入130μlmyonetmbeadscapturesolution。将ep管从dynamag‑2架上移走，涡旋30s，离心2s。[0111](3)用移液器小心地吹打重悬清洗完成的带有模板的isps。[0112](4)准备一个八联排pcr管，按照表10将下列试剂从左至右依次加入管中。[0113]表10.八联排pcr管加入试剂[0114][0115](5)准备一个0.2ml的pcr管作为收集管。[0116](6)将八联排pcr管和0.2ml的pcr管安装到iononetouchtmes仪器上，启动仪器，开始反应。[0117](7)反应结束后，富集后的带有模板的isps被收集到0.2mlpcr管中。[0118](8)清洗富集后的isps。[0119]1)15,500×g离心5min。[0120]2)小心地移除上清但留10μl，加200μl无酶水，轻轻吹打以重悬isps。[0121]3)15,500×g离心5min。[0122]4)离心结束后检查是否可以在管底看到棕色颗粒，根据是否可以看到棕色颗粒来进行下面的步骤。[0123]i.若无棕色颗粒则进行如下操作:移除上清但留10μl，加入无核酸酶水至100μl，轻轻吹打重悬isps。[0124]ii.若有棕色颗粒则进行如下操作:[0125]a.轻轻吹打以重悬颗粒[0126]b.放于磁力架上静置4min。[0127]c.小心地移除上清，15,500×g离心5min。[0128]d.移除上清但留10μl，加无核酸酶水至100μl，轻轻吹打以重悬isps。[0129]3.测序[0130](1)初始化ions5tm测序仪[0131](2)向富集后isps中加入controlionspheretmparticles：涡旋controlionspheretmparticles5s，离心2s，取5μl加入到富集后isps中，轻轻吹打以混匀。[0132](3)向富集后isps中加入ions5tm测序引物并退火。[0133]1)15,500×g离心富集后isps5min，小心地移除上清但留10μl。[0134]2)加入15μl未稀释的ions5tmannealingbuffer至总体积为25μl。[0135]3)加入20μlions5tm测序引物至总体积为45μl。短暂涡旋、离心。[0136]4)使用pcr仪进行退火反应：95℃，2min；37℃，2min。[0137]5)反应结束后，加入6μlions5tmsequencingpolymerase和10μlions5tmloadingbuffer，短暂涡旋、离心。[0138]6)室温孵育5min。[0139](4)将测序样本负载到芯片上[0140]1)将芯片放置于平整、稳定的平面上。缓慢注入测序样本。[0141]2)将芯片在ionchiptmminifuge上离心5min。[0142]3)配制发泡剂：900μl50％annealingbuffer和100μlfoamingsolution。剧烈震荡以产生泡沫。[0143]4)向芯片注入100μl发泡剂。[0144]5)重复步骤4)3次。[0145]6)向芯片注入100μl50％annealingbuffer。[0146]7)重复步骤6)3次。[0147](5)ions5tm测序仪初始化后，将芯片上机开始测序。[0148]5.结果分析[0149]样本上机结束后，得到具体序列，与正常人序列目前已知序列比对后，新发现13个mmachc突变与mma相关。[0150]表11甲基丙二酸血症相关基因mmachc突变位点[0151][0152][0153]以上研究所发现的与甲基丙二酸血症辅助诊断相关的突变位点均位于1号染色体mmachc基因上，mmachc在ncbi参考数据库grch37.p13中的编号为nc_000001.10(45,964,664‑45,980,362)，这里列出在该数据库中包含有本位点野生型的部分碱基序列供参考，如seqidno：1所示，mmachc基因突变相对应的序列如seqidno：2‑seqidno：14所示。[0154]上述致病位点均为本发明首次在不同甲基丙二酸血症患者中发现，所述突变位点在甲基丙二酸血症的筛查和基因诊断中具有潜在的应用前景。上述都基因突变点的发现，为扩大mma产前筛查的范围，提高检测准确率，为临床资料效果评价奠定基础，并为发现具有潜在资料夹子的新型小分子药物靶标提供帮助。[0155]在本实施例中，通过对68例患有mma的新生儿1号染色体mmachc基因基因进行二代靶向测序，发现了在mmachc基因上存在13种新的致病位点，即c.2t>g、c.2t>c、c.81 1g>a、c.395g>a、c.426c>a、c.427c>t、c.429 1g>c、c.481c>g、c.481c>a、c.616del、c.616c>t、c.617g>c或c.626_627deltg；将上述致病位点在ncbi数据库中基因数据比对，发现上述变异在正常情况下均不存在，说明上述突变位点均增加mma患病风险。[0156]我们收集了116例mma新生儿患者父母的外周血样本和200例正常新生儿父母的外周血样本，发现116例mma新生儿患者父母的外周血样本中有17例血液样本mma阳性，其中15例患者的突变在mmachc基因上，15例病例中，2例携带c.481c>a突变，1例携带c.626_627deltg突变，1例c.395g>a突变。而上述变异在200例正常新生儿父母的外周血样本中均没有出现，由此可以说明，上述突变点增加mma的患病风险。上述突变点在mma患者中发生频率显著高于正常对照，说明上述变异位点与mma密切相关。当前第1页12当前第1页12
技术领域：
：1.本发明关于生物
技术领域：
：，涉及一种甲基丙二酸血症相关基因mmachc突变位点及其检测方法。
背景技术：
：：2.甲基丙二酸血症(methylmalonicaciduria,mma)属常染色体隐性遗传遗传病，是致命的，严重的异质性丙二酸甲酯和钴胺素代谢异常，预后不良所致。mma患者的发病率和死亡率很高，长期生存的预后很差。其发作期从新生儿期到成年期不等，患病的儿童通常表现出厌食症，肌张力低下，发育迟缓，进行性肾衰竭，功能性免疫功能减退，视神经萎缩和血液学异常。严重者可引起酮症酸中毒、低血糖、高血氨、高甘氨酸血症，在新生儿、婴幼儿期病死率较高。造成这样后果的一个重要原因是mma的致病突变还未完全清楚，导致患者在未发病时通过基因筛查不能尽早的发现患病风险，因此不能尽早进行干预。3.目前临床上主要检测方法为临床症状结合尿气相色谱质谱检测、血串联质谱检测，需要反复检测或基因检测才能诊断或排除此病。对于检测胎儿是否患病是通过妊娠过程中羊水穿刺进行甲基丙二酸血症(mma)的产前筛查，它是一项侵入性的操作技术，对于操作人员，环境，孕周等有严格的要求限制。而由于基因检测中现有致病位点的不全面，即现有致病位点大多为发病率较高的致病位点，某些发病率较低或其它导致mma的突变位点目前不明确，因此会导致假阴性结果。4.目前在临床诊断中检测基因致病位点的方法主要为一代测序，即sanger测序，此种方法成本高通量低，所需时间较长，检测效率低下。技术实现要素：5.本发明的目的在于克服现有mma基因突变位点的不完整，提供新的13种mmachc基因突变，使mma的基因检测更加准确，检测出mma的相关的基因突变后，尽早进行干预和治疗。6.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：7.一种甲基丙二酸血症相关基因mmachc突变位点，所述突变位点为：c.2t>g、c.2t>c、c.81 1g>a、c.395g>a、c.426c>a、c.427c>t、c.429 1g>c、c.481c>g、c.481c>a、c.616del、c.616c>t、c.617g>c或c.626_627deltg；8.上述突变点的起始位置和基因序列为：[0009][0010][0011]一种上述甲基丙二酸血症相关基因突变位点的检测方法，采用二代靶向测序检测。所述的二代靶向测序检测采用二代靶向测序ions5tm测序仪[0012]有益效果[0013](1)本发明通过二代靶基因测序技术检测遗传物质是否为突变基因携带者，来评估患甲基丙二酸血症的风险，通过提取出患病新生儿血液中的dna，利用二代靶基因测序技术检测患者的dna序列，与健康人的基因进行比对，得出新的13种mmachc基因位点突变与甲基丙二酸血症相关与甲基丙二酸血症相关。本发明扩大mma了产前筛查的范围，能够在婚前、产前评估mma患病风险，在最大程度上防止mma胎儿的出生，具有非常重要的临床意义和社会意义。[0014](2)本发明所述mmachc基因致病位点均为本发明首次发现，所述突变位点在甲基丙二酸血症的筛查和基因诊断中具有潜在的应用前景，上述都基因突变点的发现，为扩大mma产前筛查的范围，提高检测准确率，为临床资料效果评价奠定基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。具体实施方式[0015]下面结合具体实施实例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：[0016]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0017]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。[0018]实施例1[0019]取济南市妇幼保健院68例已确诊mma的新生儿外周血2ml，加入抗凝剂采血管中，低温保存送检。[0020]对于采集的68例血液样本进行检查，低温低速离心后检查是否出现溶血现象。合格的血液样本离心后分层，呈清晰的血浆、中间层和红细胞层。将血浆、中间层和红细胞分别转移至冻存管中，‑20℃保存。[0021]从血液中间层样本中提取dna试剂盒：tianampblooddnakit试剂盒。[0022]dna文库构建使试剂盒：ionampliseqtmlibrarykitplus试剂盒。具体过程如下：[0023](1)dna稀释[0024]1)dna定量：使用qubittmdsdnahsassay试剂盒进行dna定量。[0025]a.将10μl标准品1和2分别加入到2个0.5ml的assay管中，并加入190μl稀释后的dsdnahs试剂补足200μl，涡旋2～3s，注意不要产生气泡。[0026]b.取1‑20μl待测dna加入assay管中，并加入相应体积稀释后的dsdnahs试剂补足200ul，涡旋2～3s，注意不要产生气泡。[0027]c.室温孵育2min。[0028]d.使用qubit3荧光计测定浓度并记录。[0029]2)dna稀释：根据所测得浓度的最小值和最大值，确定pcr体系所需dna浓度，体系总体积为6μl，dna含量为1‑100ng。根据计算结果取适量dna加无核酸酶水稀释至6μl。[0030](2)dna靶向扩增[0031]1)准备0.2ml灭菌无酶pcr管，按照表1加入试剂，并吹打混匀。[0032]表1.dna靶向扩增组分[0033][0034]2)按照表2程序进行pcr扩增[0035]表2.pcr扩增程序[0036][0037]扩增后产物可在10℃过夜保存，长期保存需在‑20℃保存。[0038](3)部分消化扩增子[0039]1)将上述20μl体系短暂离心。加入2μlfupa酶，短暂涡旋、离心。[0040]2)按照表3程序进行pcr反应。[0041]表3.fupa酶消化pcr程序[0042][0043]可在10℃存放1h，长期保存需存放在‑20℃。[0044](4)连接接头到扩增子[0045]1)配置接头反应液[0046]按表4将各组分混合。[0047]表4.接头反应液组分[0048][0049]2)进行连接反应[0050]a.switchsolutin在室温下化冻溶解。[0051]b.将步骤(3)的pcr产物短暂离心。[0052]c.按照表5将下列试剂加入到步骤(3)的pcr产物中[0053]表5.连接反应组分[0054]table5.componentofligation[0055][0056]d.短暂涡旋后短暂离心。[0057]e.按照表6程序进行pcr反应。[0058]表6.连接反应pcr程序[0059][0060]反应结束则文库构建完成，文库可在10℃保存24h，长期保存需存放在‑20℃文库构建后，需进行纯化文库，具体步骤如下：[0061](1)首先将agencourttmampuretmxp试剂室温平衡30min。[0062](2)短暂离心步骤(4)完成连接反应的文库，转移到1.5ml无菌吸附ep管中。[0063](3)向文库中加入45μlagencourttmampuretmxpreagent，小心吹打5次，于室温放置5min。[0064](4)把ep管放到dynamag‑2架上，等待2min，然后小心地吸去上清。[0065](5)取150μl新鲜配制的70％乙醇至ep管中，180°旋转ep管两次以洗涤磁珠，然后小心地移除上清。[0066](6)重复步骤5)。[0067](7)ep管敞口，室温下在dynamag‑2架上静置以干燥磁珠，时间≤5min，以免干燥过度。[0068](8)洗脱文库[0069]1)把ep管从dynamag‑2架移走，加50μllowte使磁珠分散。[0070]2)吸取te吹打干燥磁珠使其混匀，室温孵育2min。[0071]3)放置于dynamag‑2架上室温孵育5min。[0072]带溶液澄清后取20μl上清，得到纯化文库。[0073]文库定量，具体步骤如下：[0074](1)稀释文库：取2μl文库，加入198μl无核酸酶水。[0075](2)将e.colidh10b对照文库(～68pm)稀释至3个10倍浓度梯度，分别为6.8pm、0.68pm和0.068pm,作为标准品。[0076](3)准备反应混合液。按照每个样本、对照和标准品都准备20μl2xionlibraryqpcrmastermix和2μl20xionlibraryquantitationassay，将它们混合，没管加入11μl混合液。[0077](4)加入9μl稀释后的ionampliseqtm文库或9μl对照溶液，得到总体系20μl。[0078](5)按照表7程序进行qpcr。[0079]表7.文库定量pcr程序[0080][0081](6)根据qpcr结果计算原文库浓度：检测到的浓度乘以100，取平均值，到原文库浓度。[0082](7)将文库稀释至100pm，并合并文库。[0083]利用二代靶向测序精准快速测得序列，具体步骤如下：[0084]1.模板准备[0085](1)装配并启动iononetouchtm2仪器[0086](2)准备扩增溶液[0087]1)准备isps：高速涡旋1min，离心2s，吹打混合均匀。[0088]2)按照表8将下列组分加至一管2ml的ions5tmreagentmix中，用移液器小心地吹打混合均匀。[0089]表8.扩增溶液组分[0090][0091]3)将扩增溶液填充入反应过滤器组件，并将其安装到iononetouchtm2上，运行iononetouchtm2，开始反应。反应结束后离心。[0092](3)清洗带有模板的isps[0093]1)从iononetouchtm2取下iononetouchtmrecovery管，小心吸取上清液但不要完全移除，留下～100μl上清液。[0094]2)小心地吹打使带有模板的isps重悬。[0095]3)将所有悬液合并到新的1.5ml低吸附无菌ep管里。[0096]4)取～100μl无核酸酶水至iononetouchtmrecovery管里，小心地吹打混合均匀，将剩余的isps转到步骤3)的ep管里。[0097]5)加无核酸酶水至1ml。涡旋30s，15,000×g离心8min。[0098]6)小心移除上清，留下～20μl。[0099]7)加无核酸酶水至100μl，涡旋30s，短暂离心。[0100]2.富集带有模板的isps[0101](1)准备melt‑offsolution：按照表9配制melt‑offsolution。[0102]表9.洗脱液组分[0103][0104](2)清洗重悬dynabeadstmmyonetmstreptavidinc1beads。[0105]1)dynabeadstmmyonetmstreptavidinc1beads涡旋30s，使其重悬。[0106]2)立即取100μldynabeadstmmyonetmstreptavidinc1beads加入到一个新的1.5ml低吸附无菌ep管中[0107]3)1.5mlep管在dynamag‑2架放置2min，小心地吸去上清。[0108]4)加入1mliononetouchtmwashsolution。将ep管从dynamag‑2架上移走，涡旋30s，离心2s。[0109]5)把离心管在dynamag‑2架上等待2min，小心地吸去上清。[0110]6)加入130μlmyonetmbeadscapturesolution。将ep管从dynamag‑2架上移走，涡旋30s，离心2s。[0111](3)用移液器小心地吹打重悬清洗完成的带有模板的isps。[0112](4)准备一个八联排pcr管，按照表10将下列试剂从左至右依次加入管中。[0113]表10.八联排pcr管加入试剂[0114][0115](5)准备一个0.2ml的pcr管作为收集管。[0116](6)将八联排pcr管和0.2ml的pcr管安装到iononetouchtmes仪器上，启动仪器，开始反应。[0117](7)反应结束后，富集后的带有模板的isps被收集到0.2mlpcr管中。[0118](8)清洗富集后的isps。[0119]1)15,500×g离心5min。[0120]2)小心地移除上清但留10μl，加200μl无酶水，轻轻吹打以重悬isps。[0121]3)15,500×g离心5min。[0122]4)离心结束后检查是否可以在管底看到棕色颗粒，根据是否可以看到棕色颗粒来进行下面的步骤。[0123]i.若无棕色颗粒则进行如下操作:移除上清但留10μl，加入无核酸酶水至100μl，轻轻吹打重悬isps。[0124]ii.若有棕色颗粒则进行如下操作:[0125]a.轻轻吹打以重悬颗粒[0126]b.放于磁力架上静置4min。[0127]c.小心地移除上清，15,500×g离心5min。[0128]d.移除上清但留10μl，加无核酸酶水至100μl，轻轻吹打以重悬isps。[0129]3.测序[0130](1)初始化ions5tm测序仪[0131](2)向富集后isps中加入controlionspheretmparticles：涡旋controlionspheretmparticles5s，离心2s，取5μl加入到富集后isps中，轻轻吹打以混匀。[0132](3)向富集后isps中加入ions5tm测序引物并退火。[0133]1)15,500×g离心富集后isps5min，小心地移除上清但留10μl。[0134]2)加入15μl未稀释的ions5tmannealingbuffer至总体积为25μl。[0135]3)加入20μlions5tm测序引物至总体积为45μl。短暂涡旋、离心。[0136]4)使用pcr仪进行退火反应：95℃，2min；37℃，2min。[0137]5)反应结束后，加入6μlions5tmsequencingpolymerase和10μlions5tmloadingbuffer，短暂涡旋、离心。[0138]6)室温孵育5min。[0139](4)将测序样本负载到芯片上[0140]1)将芯片放置于平整、稳定的平面上。缓慢注入测序样本。[0141]2)将芯片在ionchiptmminifuge上离心5min。[0142]3)配制发泡剂：900μl50％annealingbuffer和100μlfoamingsolution。剧烈震荡以产生泡沫。[0143]4)向芯片注入100μl发泡剂。[0144]5)重复步骤4)3次。[0145]6)向芯片注入100μl50％annealingbuffer。[0146]7)重复步骤6)3次。[0147](5)ions5tm测序仪初始化后，将芯片上机开始测序。[0148]5.结果分析[0149]样本上机结束后，得到具体序列，与正常人序列目前已知序列比对后，新发现13个mmachc突变与mma相关。[0150]表11甲基丙二酸血症相关基因mmachc突变位点[0151][0152][0153]以上研究所发现的与甲基丙二酸血症辅助诊断相关的突变位点均位于1号染色体mmachc基因上，mmachc在ncbi参考数据库grch37.p13中的编号为nc_000001.10(45,964,664‑45,980,362)，这里列出在该数据库中包含有本位点野生型的部分碱基序列供参考，如seqidno：1所示，mmachc基因突变相对应的序列如seqidno：2‑seqidno：14所示。[0154]上述致病位点均为本发明首次在不同甲基丙二酸血症患者中发现，所述突变位点在甲基丙二酸血症的筛查和基因诊断中具有潜在的应用前景。上述都基因突变点的发现，为扩大mma产前筛查的范围，提高检测准确率，为临床资料效果评价奠定基础，并为发现具有潜在资料夹子的新型小分子药物靶标提供帮助。[0155]在本实施例中，通过对68例患有mma的新生儿1号染色体mmachc基因基因进行二代靶向测序，发现了在mmachc基因上存在13种新的致病位点，即c.2t>g、c.2t>c、c.81 1g>a、c.395g>a、c.426c>a、c.427c>t、c.429 1g>c、c.481c>g、c.481c>a、c.616del、c.616c>t、c.617g>c或c.626_627deltg；将上述致病位点在ncbi数据库中基因数据比对，发现上述变异在正常情况下均不存在，说明上述突变位点均增加mma患病风险。[0156]我们收集了116例mma新生儿患者父母的外周血样本和200例正常新生儿父母的外周血样本，发现116例mma新生儿患者父母的外周血样本中有17例血液样本mma阳性，其中15例患者的突变在mmachc基因上，15例病例中，2例携带c.481c>a突变，1例携带c.626_627deltg突变，1例c.395g>a突变。而上述变异在200例正常新生儿父母的外周血样本中均没有出现，由此可以说明，上述突变点增加mma的患病风险。上述突变点在mma患者中发生频率显著高于正常对照，说明上述变异位点与mma密切相关。当前第1页12当前第1页12
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