一种NADH的纯化方法与流程

一种nadh的纯化方法
技术领域
1.本发明属于生物制药领域，具体涉及一种绿色高效低成本的还原型辅酶i纯化方法。


背景技术：

2.nadh(nicotinamide adenine dinucleotide)是一种化学物质，是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的还原态，还原型辅酶ⅰ。n指烟酰胺，a指腺嘌呤，d是二核苷酸。因nadh主要在细胞中参与物质和能量代谢，产生于糖酵解和细胞呼吸作用中的柠檬酸循环，并作为生物氢的载体和电子供体，在线粒体内膜上通过氧化磷酸化过程，转移能量供给atp合成，所以nadh又被称为线粒体素。理论上，1分子nadh释放的能量，可以合成3分子atp。
3.nadh不仅作为有氧呼吸作用中重要的辅酶，nadh的[h]也携带大量能量，研究已经证实，细胞外使用nadh能促进细胞内atp水平的上升，表明nadh能穿透细胞膜并提升细胞内的能量水平。nadh能与自由基反应从而抑制脂质的过氧化反应，保护线粒体膜和线粒体功能。研究表明nadh显著促进神经递质多巴胺的产生，临床实验数据表明nadh有助于改善帕金森病的症状，nadh还能促进甲肾上腺素和血清素的生物合成，对于缓解抑郁症和老年痴呆症显示出良好的应用潜力。nadh在维持细胞生长和分化、能量代谢、细胞保护以及促进神经递质产生方面起着重要作用。


技术实现要素：

[0004]
目前，现有文献报道nadh的纯化方法主要为离子交换树脂法、色谱纯化法(cn104892710a)。该类方法虽然能获得高纯度的nadh，但其操作繁琐、填料昂贵且寿命短、纯化成本高、收率低、产能低、废水量大、难放大工业化生产。
[0005]
本发明为克服现有nadh纯化技术的缺陷，提供一种绿色高效低成本的还原型辅酶i纯化方法。其工艺简单易操作、成本低、产物收率高，满足工业生产的需求。
[0006]
本发明的目的是这样实现的：
[0007]
在一个实施例中，提供了一种nadh的纯化方法，所述方法包括步骤如下：
[0008]
(1)对含nadh酶促反应液进行过滤，收集得到上清液；
[0009]
(2)对步骤(1)收集得到的上清液进行脱色处理；
[0010]
(3)对步骤(2)中完成脱色处理后的反应液进行过滤，再依次进行超滤和纳滤处理；
[0011]
(4)将步骤(3)中纳滤处理后得到的滤液在减压浓缩后，得浓缩液，进行降温结晶处理，降温结晶时采用梯度降温，析出晶体，过滤、干燥，得到nadh。
[0012]
优选地，所述步骤(1)中用陶瓷膜进行过滤；和/或
[0013]
步骤(2)中利用活性炭对步骤(1)收集得到的上清液进行脱色处理；和/或
[0014]
步骤(3)中对步骤(2)中完成脱色处理后的反应液进行过滤除去活性炭。
[0015]
优选地，所述步骤(1)中上清液中nadh的浓度为30
‑
60g/l；和/或
[0016]
所述陶瓷膜孔径为30nm
‑
100nm，过滤温度为20
‑
30℃，过膜压力为0.1
‑
0.2mpa。
[0017]
优选地，在利用活性炭对步骤(1)收集得到的上清液进行脱色处理前，先将上清液ph值调节至5
‑
7.0；优选地，ph为6.0。
[0018]
优选地，所述步骤(2)中活性炭与上清液重量体积比为5
‑
25g:1l，进行脱色处理的温度为20
‑
80℃，进行脱色处理的时间为20
‑
70min；优选地，进行脱色处理的温度为50℃，进行脱色处理的时间为50min。
[0019]
优选地，对步骤(2)中完成脱色处理后的反应液进行过滤除去活性炭，将滤液的ph值调节至7
‑
8后，再依次进行超滤和纳滤处理。
[0020]
优选地，所述超滤膜为截留分子量1000da的卷式膜，过滤温度20
‑
30℃，过膜压力为1
‑
2mpa。
[0021]
优选地，所述纳滤膜为截留分子量300da的卷式膜，过滤温度20
‑
30℃，过膜压力为1
‑
3mpa；优选地，过膜压力为2.0mpa。
[0022]
优选地，将步骤(3)中纳滤处理后得到的滤液在20
‑
70℃下减压浓缩后，得浓缩液；优选为，在30
‑
50℃下减压浓缩后，得浓缩液；优选地，浓缩倍数为4倍。
[0023]
优选地，所述步骤(4)进行降温结晶时采用梯度降温，先以2
‑
3℃/h的降温速率将温度降至有晶体析出，再以6
‑
9℃/h的降温速率将温度降至10℃；和/或所述步骤(4)中干燥方式为真空干燥，干燥温度为30
‑
60℃。
[0024]
本发明提供的一种绿色高效低成本的还原型辅酶i纯化方法，工艺简单，操作方便，提纯过程依次利用活性炭和膜系统对转化液进行处理，能减少物料损失，保证收率，且处理过程中不会用到其它试剂，减少对转化液的污染，不会产生污染性废液，环保安全，成本低廉，得到的nadh收率高、纯度高，满足工业化生产得需求。
附图说明
[0025]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些图获得其他的附图。
[0026]
图1活性炭添加量对nadh脱色效果的影响
[0027]
图2溶液ph对脱色效果的影响
[0028]
图3脱色温度对nadh脱色效果的影响
[0029]
图4脱色时间对nadh脱色效果的影响
[0030]
图5 nadh纯化工艺流程图
具体实施方式
[0031]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0032]
本发明的技术方案：一种绿色高效低成本的还原型辅酶i纯化方法，其步骤如下：
[0033]
a、对酶催化反应所得酶促反应液进行陶瓷膜过滤实现固液分离收集上清液，上清液中nadh的浓度为30
‑
60g/l；所用陶瓷膜孔径为30nm
‑
100nm，过滤温度为20
‑
30℃，过膜压力为0.1
‑
0.2mpa。
[0034]
b、将a步骤中的上清液ph值调节至5.0
‑
7.0，利用活性炭粉末对其进行脱色处理，在这一ph值条件下，活性炭粉末对色素、杂质的吸附作用可大幅度提高，从而使得活性炭脱色处理的效果有显著的提升，所述活性炭与上清液重量体积比为10
‑
25g:1l，进行脱色处理的温度为20
‑
80℃，进行脱色处理的时间为20
‑
70min，使活性炭充分吸附上清液中残留的色素和胞内杂质等，进而通过过滤去除，实现nadh的初步纯化。
[0035]
c、对步骤b中完成脱色处理后的反应液进行过滤除去活性炭，将滤液的ph值调节至7
‑
8后，再依次进行超滤和纳滤处理；所用超滤膜为截留分子量1000da的卷式膜，过滤温度20
‑
30℃，过膜压力为1
‑
2mpa；纳滤膜为截留分子量100da
‑
500da的卷式膜，过滤温度20
‑
30℃，过膜压力为1
‑
3mpa。
[0036]
d、将步骤c中纳滤处理后得到的滤液在30
‑
50℃下减压浓缩后，得浓缩液，降温结晶处理，进行降温结晶时采用梯度降温，先以2
‑
3℃/h的降温速率将温度降至有晶体析出，再以6
‑
9℃/h的降温速率将温度降至10℃，在这一过程中，先慢速降温至晶体析出，再进一步匀速降温，可使得晶核成型的更为均匀，有利于提高晶体的均匀性。析出晶体过滤后，50℃真空干燥处理，得高含量、高纯度nadh。
[0037]
所述nadh酶促反应液制备方法为：β
‑
d葡萄糖和nad在葡萄糖脱氢酶(gdh，cas：9028
‑
53
‑
9)催化下生成葡萄糖酸内酯和nadh。催化反应如下：
[0038][0039]
酶促反应体系为：nad 100g/l，β
‑
d葡萄糖30g/l，葡萄糖脱氢酶1500u/l，mgso4·
7h2o 0.05mol/l，pbs缓冲液(ph＝7.0)定溶，在温度30℃、转速250r/min下反应3h。定溶的体积根据实际需要执行。
[0040]
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案进行详细说明。
[0041]
实施例1活性炭添加量对nadh脱色效果的影响
[0042]
取1l陶瓷膜过滤后的含nadh上清液，活性炭添加量分别为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％，在ph为5.5，温度为50℃下，搅拌处理50分钟后，取样检测吸光度和nadh的含量，计算色素去除率和nadh收率，结果见图1。实验结果表明，随着活性炭添加量的增加色素去除率随之增加，当添加量达到1.5％时，再增大添加量对色素去除率影响不大，反而此时的nadh收率急剧下降。因此活性炭添加量选择为1.5％。
[0043]
实施例2溶液ph对脱色效果的影响
[0044]
取1l陶瓷膜过滤后的含nadh上清液，分别将其ph调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，在分别向其中加入1.5％的活性炭，在50℃下，搅拌处理50分钟后，取样检测吸光度和nadh的含量，计算色素去除率和nadh收率。结果见图2。实验结果表明，随着ph值的增加，nadh收率先升后降。综合考虑，ph值选择为6.0。
[0045]
实施例3脱色温度对nadh脱色效果的影响
[0046]
取1l陶瓷膜过滤后的含nadh上清液，将其ph调至6.0，向其中加入1.5％的活性炭，
分别在20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃下，搅拌处理50分钟后，取样检测吸光度和nadh的含量，计算色素去除率和nadh收率。结果见图3，综合考虑，脱色温度选择为50℃。
[0047]
实施例4脱色时间对nadh脱色效果的影响
[0048]
取1l陶瓷膜过滤后的含nadh上清液，将其ph调至6.0，向其中加入1.5％的活性炭，在50℃下，分别搅拌处理20、30、40、50、60、70分钟后，取样检测吸光度和nadh的含量，计算色素去除率和nadh收率。结果见图4。实验结果表明，随着脱色时间的增加，色素去除率逐渐上升；而nadh收率逐渐下降，可能原因是活性炭在一定脱色时间内以达到吸附饱和，而继续延长脱色时间，nadh活性降低，导致收率急剧下降。综合考虑，脱色时间选择为50min。
[0049]
实施例5膜孔径对nadh收率的影响
[0050]
对含nadh酶促反应液进行过滤，收集得到上清液；对上述步骤收集得到的上清液进行脱色处理；对完成脱色处理后的反应液进行过滤，再依次进行超滤和纳滤处理。其中，关于纳滤，分别选取100da、300da、500da三种不同规格的pes膜，在操作压力为2.0mpa下，将样品浓缩4倍，检测nadh的含量，计算nadh收率，结果见表1。从表1中可以看出，100da的回收率达98％，但膜通量很小；500da的膜通量相对较高，但由于其与nadh分子量接近，部分nadh穿透过去导致收率较低。综合考虑，选择300da的pes膜。
[0051]
表1不同膜孔径对nadh收率的影响
[0052]
膜孔径(da)浓缩倍数膜通量(l/m2·
h)nadh收率(％)10044953004128850041763
[0053]
实施例6操作压力对nadh收率的影响
[0054]
对含nadh酶促反应液进行过滤，收集得到上清液；对上述步骤收集得到的上清液进行脱色处理；对完成脱色处理后的反应液进行过滤，再依次进行超滤和纳滤处理。关于纳滤，选取300da的pes膜，操作压力分别选为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mpa下，将样品浓缩4倍，检测nadh的含量，计算nadh收率，结果见表2。从表2中可以看出，随着操作压的增大，膜通量逐渐增大，而nadh受到较大压力的作用，在膜中的透过率增大，导致收率逐渐降低，综合考虑，选择操作压力为2.0mpa。
[0055]
表2不同操作压对nadh收率的影响
[0056]
操作压(mpa)膜通量(l/m2·
h)nadh收率(％)1.06941.59902.012862.515803.01770
[0057]
实施例7浓缩倍数对nadh收率的影响
[0058]
对含nadh酶促反应液进行过滤，收集得到上清液；对上述步骤收集得到的上清液进行脱色处理；对完成脱色处理后的反应液进行过滤，再依次进行超滤和纳滤处理。关于纳滤，选取300da的pes膜，操作压力为2.0mpa，将样品分别浓缩1、2、3、4、5、6倍，检测nadh的含量，计算nadh收率，结果见表3。从表3中可以看出，随着浓缩倍数的递增，膜通量及nadh收率
都递减，但从下游处理来说，希望浓缩的倍数越大越好。因此，综合考虑选择浓缩倍数4倍。
[0059]
表3不同浓缩倍数对nadh收率的影响
[0060]
浓缩倍数膜通量(l/m2·
h)nadh收率(％)12593.422290.131887.341384.55876.76464.2
[0061]
实施例8
[0062]
一种绿色高效低成本的还原型辅酶i纯化方法，包括如下步骤：
[0063]
(1)将nadh含量为40g/l的5l酶促反应液，用50nm孔径陶瓷膜，过滤温度为25℃，过膜压力为0.1mpa，过滤收集流出清液为6l，nadh浓度为32.6g/l。
[0064]
(2)将6l清液用稀盐酸将ph值调至6.0，添加90g活性炭，50℃脱色处理50min，过滤，得到5.9l含nadh的滤液。
[0065]
(3)将5.9l含nadh滤液用稀氢氧化钠将ph调至7.2，在过滤温度为25℃，过膜压力为2mpa下通过超滤膜过滤，收集清液8l，再通过300da的纳滤膜在过滤温度为25℃，过膜压力为2.0mpa下浓缩4倍，收集浓液2l。
[0066]
(4)将2l含nadh的浓液，在45℃下减压浓缩，先以2℃/h的降温速率将温度降至有晶体析出，再以7℃/h的降温速率将温度降至10℃，过滤收集晶体，50℃真空干燥，得186g nadh，纯度97％，总收率93％左右。处理过程中各步骤数据见表4所示。
[0067]
表4处理过程中物料变化
[0068][0069]
实施例9
[0070]
一种绿色高效低成本的还原型辅酶i纯化方法，包括如下步骤：
[0071]
(1)将nadh含量为45g/l的5l酶促反应液，用50nm孔径陶瓷膜，过滤温度为25℃，过膜压力为0.1mpa，过滤收集流出清液为6l，nadh浓度为36.75g/l。
[0072]
(2)将6l清液用稀盐酸将ph值调至6.0，添加90g活性炭，50℃脱色处理50min，过滤，得到5.9l含nadh的滤液。
[0073]
(3)将5.8l含nadh滤液用稀氢氧化钠将ph调至7.2，在过滤温度为25℃，过膜压力为2mpa下通过超滤膜过滤，收集清液8l，再通过300da的纳滤膜在过滤温度为25℃，过膜压力为2.0mpa下浓缩4倍，收集浓液2l。
[0074]
(4)将2l含nadh的浓液，在45℃下减压浓缩，先以3℃/h的降温速率将温度降至有晶体析出，再以8℃/h的降温速率将温度降至10℃，过滤收集晶体，50℃真空干燥，得204.75g nadh，纯度98.5％，总收率91％左右。处理过程中各步骤数据见表5所示。
[0075]
表5处理过程中物料变化
[0076][0077]
实施例10
[0078]
一种绿色高效低成本的还原型辅酶i纯化方法，包括如下步骤：
[0079]
(1)将nadh含量为48g/l的10l酶促反应液，用50nm孔径陶瓷膜，过滤温度为25℃，过膜压力为0.1mpa，过滤收集流出清液为15l，nadh浓度为31.3g/l。
[0080]
(2)将15l清液用稀盐酸将ph值调至6.0，添加225g活性炭，50℃脱色处理50min，过滤，得到14.8l含nadh的滤液。
[0081]
(3)将14.8l含nadh滤液用稀氢氧化钠将ph调至7.2，在过滤温度为25℃，过膜压力为2mpa下通过超滤膜过滤，收集清液20l，再通过300da的纳滤膜在过滤温度为25℃，过膜压力为2.0mpa下浓缩4倍，收集浓液5l。
[0082]
(4)将5l含nadh的浓液，在45℃下减压浓缩，先以3℃/h的降温速率将温度降至有晶体析出，再以9℃/h的降温速率将温度降至10℃，过滤收集晶体，50℃真空干燥，得458g nadh，纯度97％，总收率95％左右。处理过程中各步骤数据见表6所示。
[0083]
表6处理过程中物料变化
[0084][0085]
由以上数据可知，本发明所提供的纯化方法工艺简单，操作方便，提纯过程，能减少物料损失，保证收率，环保安全，得到的nadh，收率高，含量高，纯度高。
[0086]
相对于现有技术，本发明提供的一种绿色高效低成本的还原型辅酶i纯化方法，工艺简单，操作方便，提纯过程依次利用活性炭和膜系统对转化液进行处理，能减少物料损失，保证收率，且处理过程中不会用到其它试剂，减少对转化液的污染，不会产生污染性废液，环保安全，成本低廉，得到的nadh收率高、纯度高，满足工业化生产得需求。
[0087]
本发明的说明书中，说明了大量具体细节。然而，能够理解，本发明的实施例可以在没有这些具体细节的情况下实践。在一些实例中，并未详细示出公知的方法、结构和技术，以便不模糊对本说明书的理解。
[0088]
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。