一种睡莲花细胞水的制备方法以及睡莲花细胞水的应用与流程

1.本发明涉及农产品处理技术领域，特别是涉及一种睡莲花细胞水的制备方法以及睡莲花细胞水的应用。


背景技术：

2.睡莲，多年生水生草本，根状茎肥厚，从东北至云南，西至新疆皆有分布，朝鲜，日本，印度，俄罗斯，北美等。生于池沼、湖泊等静水水体中。许多公园水体栽培作为观赏植物，根状茎食用或酿酒，又入药，能治小儿慢惊风；全草可作绿肥。实验研究表明，睡莲对重金属具有吸附作用。睡莲浸出液对铜绿微囊藻的生长有一定的抑制作用，表现为明显的低促高抑现象。根据对睡莲的营养成分分析，结果表明睡莲富含17种氨基酸，睡莲蛋白属优质蛋白。分析结果还表明睡莲含有丰富的vc、黄酮甙、微量元素锌，这二者配合具有很强的排铅功能。动物急性毒性实验、微核试验及精子畸变实验都表明睡莲是一种安全可靠无任何毒副作用物质。睡莲花粉营养丰富，具有完全性、均衡性、浓缩性等特点，是具有开发利用前景的天然营养源。
3.现阶段睡莲花的主要提取方法有蒸馏法、浸提法、超临界二氧化碳萃取法，蒸馏法耗费时间较长、且能耗较大，而其他两种方法而加入了其他溶剂，限制了睡莲花提取物的保存和使用。
4.酶解法也常用于植物细胞液的提取中。中国专利申请cn109730948a公开了一种采用超声低温旋蒸法和酶法相结合制备牡丹鲜花细胞水的方法：首先通过压榨法得到榨汁和残渣1，再将残渣1旋蒸得到细胞水1和残渣2，最后将残渣2进行酶解再旋蒸得到细胞水3。将榨汁、细胞水1/2混合后得到高收率牡丹花细胞水。该方法具有较高的提取效率，但是具有如下缺陷：(1)采用压榨法，后与真空提取法得到的液体混合，这样会带入多糖、色素和刺激气味，导致防腐和脱色问题；(2)工艺后期配合其他植物一起蒸馏，解决防腐问题，但是容易改变原有的牡丹花细胞水成分和气味！后期生产也无法控制品质。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于，克服上述技术缺陷，提供一种睡莲花细胞水的提取方法，得到的睡莲花细胞水具有70多种挥发性活性成分，具有清爽怡人的甜香味，性状为无色透明液体。
6.本发明是通过以下技术方案实现的：
7.一种睡莲花细胞水的制备方法，包括以下步骤：不加入溶剂，将睡莲花在30℃-55℃、压力-70kpa～-101kpa下初步提取，睡莲花细胞水形成蒸气并冷凝收集液体，提取1-3小时，得到初提细胞水和初提睡莲花残渣；在初提细胞水中加入初始睡莲花总质量为基准的0.2-0.4％的纤维素酶和0-0.1％果胶酶，再将初提细胞水加入初提睡莲花残渣中，在35℃-50℃、压力-80kpa～-101kpa条件下再次提取，3-7小时提取结束，收集得到睡莲花细胞水。
8.初步提取时间是关键参数之一，如果时间太短，提取出的睡莲花细胞水过少，加入
酶后细胞水很难湿润睡莲花表面，导致酶解不能正常进行。如果初步提取时间过长，细胞水流出过多，降低了后续提取效率，也增加了酶解时间带来过度酶解的风险。本发明通过在初提细胞水中加入一定量的酶，再次投入容器中对睡莲花残渣进行提取，具有如下有益优点。第一、初提细胞水表面张力低，渗透性好；第二、初提细胞水ph为3-7，无需额外调节ph，有利于提高酶活性；第三、酶解能够加速破壁；第四、低温真空技术。通过四种效应的协同，能够在较低温度(35-50℃)下控制酶解速度，加快细胞液流出速度。再次提取步骤中的前1小时左右会蒸除掉倒回容器内的初提细胞水，加快酶解速度，缩短酶解的时长(此时初提液体的多少就至关重要，多了会延长酶解时间，少了会缩短酶解时间)，也避免了传统酶解法需要加入大量的水稀释细胞液以及酶解过度带来的刺激气味。
9.关于初提液体的渗透性，通过实验发现，当采用细胞液作为溶剂法的溶剂提取睡莲花残渣时，能够带出大量的黄酮和多糖等大分子物质以及易挥发活性成分。相比采用纯水作为溶剂，细胞水作为溶剂能够提取出更多的黄酮和多糖等活性成分。
10.优选的，所述的初提阶段的温度为40℃-50℃，压力为-80kpa～-101kpa。
11.优选的，再次提取时间为3.5小时-5小时。
12.由于睡莲花瓣较薄，因此将再次提取时间可以压缩至5小时以内。
13.在提取过程中进行搅拌，搅拌速度为1-150转/分钟。
14.收集过程中进行冷凝，温度为-10～8℃。
15.所述的睡莲花选自睡莲花花瓣，采用新鲜无霉变、无腐烂的。可以是新鲜的广西横县睡莲花，鲜嫩多汁，水洗过后无附着杂质。一般的，睡莲花采摘后7天内还可以保证新鲜，或者是经过冷冻等防腐处理的睡莲花可以保存长达数月时间。
16.通过本发明方法得到的睡莲花细胞水应用，用于护肤品、食品、保健品等。细胞水中含有70多种挥发性活性成分(主要通过气质联用gc-ms)，高品质适用于高端、高附加值应用。
17.本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：
18.本发明先通过低温真空提取技术，先提取一定量的细胞液，然后利用初提细胞液的高渗透性，加入酶后再次提取睡莲花残渣。能够加速细胞水的提取效率，避免了传统酶解法带来的酶解过度问题，相比于低温真空提取技术能够得到更多的活性成分以及更多的睡莲花细胞液。通过本发明得到的睡莲花细胞水品质高：澄清透明、纯度高、清爽怡人的甜香味(70多种活性成分)，具有抗氧化、抗炎功效，无需添加任何外来防腐剂，也能起到自身防腐作用。并且睡莲花细胞水中不含有多糖和黄酮，稳定性好。
附图说明
19.图1：实施例1人睡莲花细胞水安全性测试结果图。
具体实施方式
20.下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
21.本发明实施例和对比例所用睡莲花花瓣为新鲜无霉变的，将睡莲花花瓣洗净沥干水分后进行提取实验。
22.实施例1：将50kg睡莲花花瓣投入容器中，不加入任何溶剂，在50℃、-100kpa下初步提取，睡莲花细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，提取2小时，得到初提细胞水和初提睡莲花残渣；在初提细胞水中加入100g纤维素酶和50g果胶酶，再将初提细胞水加入初提睡莲花残渣中，在40℃、压力-90kpa条件下再次提取，全程搅拌为60转/分，4.5小时提取结束，收集得到睡莲花细胞水。重量36kg，细胞液澄清透明，清爽怡人的甜香味。
23.实施例2：将50kg睡莲花花瓣投入容器中，不加入任何溶剂，在35℃、-90kpa下初步提取，睡莲花细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，提取2.5小时，得到初提细胞水和初提睡莲花残渣；在初提细胞水中加入150g纤维素酶和30g果胶酶，再将初提细胞水加入初提睡莲花残渣中，在40℃、压力-90kpa条件下再次提取，全程搅拌为60转/分，5小时提取结束，收集得到睡莲花细胞水。重量36.8kg，细胞液澄清透明，清爽怡人的甜香味。
24.实施例3：将50kg睡莲花花瓣投入容器中，不加入任何溶剂，在45℃、-95kpa下初步提取，睡莲花细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，提取3小时，得到初提细胞水和初提睡莲花残渣；在初提细胞水中加入120g纤维素酶和40g果胶酶，再将初提细胞水加入初提睡莲花残渣中，在45℃、压力-90kpa条件下再次提取，全程搅拌为60转/分，6小时提取结束，收集得到睡莲花细胞水。重量38.1kg，细胞液澄清透明，清爽怡人的甜香味。
25.对比例1：将50kg睡莲花花瓣投入容器中，不加入任何溶剂，在55℃、-80kpa下提取，细胞水形成蒸气后冷凝收集液体，全程搅拌为60转/分，提取6.5小时，得到睡莲花细胞水。35.4kg，澄清透明，甜香味清淡。
26.对比例2：将50kg睡莲花花瓣投入容器中，与5kg水、120g纤维素酶和40g果胶酶混合后在50℃搅拌45分钟，后在50℃、压力-100kpa下提取，睡莲花细胞水形成蒸气后冷凝收集液体(冷凝温度为-5℃)，全程搅拌为60转/分，提取6小时，收集得到42.5kg睡莲花细胞水含细胞液中有5kg水)，液体浅色透明，清淡的甜香味混有少许异味。
27.对比例3：将50kg睡莲花花瓣投入容器中，与5kg水、200g纤维素酶和80g果胶酶混合后在50℃下提取，全程搅拌为60转/分，提取6小时，过滤(双重过滤：先离心机过滤，在采用0.22um滤膜过滤)后收集得到44.1kg睡莲花细胞水(细胞液中含有5kg水)，细胞液中悬浮有少量细小物体并且异味重。
28.实施例和对比例工艺结果分析：
29.由对比例1可知，仅采用低温真空提取技术，提取到的细胞液重量低，而且成分较少，气味较淡。由对比例2可知，相比于对比例1中加入一定量的酶与水，增加了酶解时间，不仅实际提取量需要减去5kg，而且会导致细胞液浓度降低，如需得到更高浓度则需要蒸馏提纯，这样会导致其他易挥发有机物的损失。由对比例3可知，由现有技术的酶提取法，得到的睡莲花细胞水中含有大量的多糖和黄酮以及其它有色杂质，含有较重的异味，同时由于额外加入了5kg水倒在细胞液浓度低，价值不高。
30.表1：实施例和对比例所提取睡莲花细胞液检测结果
[0031][0032]
各项测试方法：
[0033]
(1)睡莲花细胞水活性成分分析：在80℃进样温度下进行顶空气质检测。
[0034]
1.仪器信息：
[0035]
agilent 7980a gc；
[0036]
ms:5975c；
[0037]
50/30μm car/pdms/dvb萃取纤维头，美国supelco公司。
[0038]
2.gc-ms条件：
[0039]
色谱柱为hp-innowax毛细管柱子(30m
×
0.25mm
×
0.25μm)；载气为he，流速1ml/min，分离比5:1；进样温度为250℃；升温程序为起始温度为40℃，保持5min，以8℃/min，升至250℃，保持5min。
[0040]
质谱条件：ei电离源，能量70ev；离子源温度230℃，四极杆温度150℃，接口温度250℃，扫描范围30-400m/z。
[0041]
3.样品前处理：
[0042]
将5ml样品、1g nacl置于20ml顶空瓶中，拧紧瓶盖。于搅拌模式80℃下平衡5min后，用固相微萃取针80℃下萃取5min，然后于进样口解析5min。
[0043]
表2：实施例1睡莲花细胞水活性成分表(相对含量少并且匹配度低的组分不列举)
[0044]
[0045]
[0046][0047]
(2)睡莲花细胞水安全性测
[0048]
hacat细胞为人永生表皮细胞系，对hacat细胞的细胞毒性，可作为对皮肤安全性的参考数据。正常细胞代谢旺盛，其线粒体内的琥珀酸脱氢酶，可将四唑盐类物质还原为带颜色的结晶状物质，沉积在细胞周围，该变化可通过酶标仪读取od值，通过od值与空白对照组的比较，可以得知细胞的相对生长情况。
[0049]
实施例1睡莲花细胞水安全性测试结果见附图1。
[0050]
(3)实施例1睡莲花细胞水抗氧化性能
[0051]
采用dpph自由基清除法，根据dpph分子中存在的稳定氮自由基，其醇溶液呈深紫色，且在517nm附近有强吸收。当有自由基清除剂存在时，分子中的单电子因配对而使其吸收逐渐消失，其褪色程度与其接受的电子数量成定量关系，因此，可通过测定其最大吸收波长517nm处的吸光度的减少来定量分析自由基清除能力测定样品的抗氧化功效。结果如下表所示。
[0052]
睡莲花细胞水浓度(％)dpph清除率/％2015402150266030804610051
[0053]
通过上表中的数据可以看出，睡莲花细胞水具有良好的抗氧化功效。
[0054]
(4)实施例1睡莲花细胞水抗炎功效
[0055]
睡莲花细胞水中活性成分较多，其中具有抗菌消炎成分比较明显，如苯甲醇、水杨酸甲酯等，因此对其进行抗炎功效的测试。
[0056]
脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分,它可以激活巨噬细胞释放多种炎性细胞因子，因此利用脂多糖(lps)刺激小鼠单核-巨噬细胞建立体外炎症反应模型，样品进行干预，以及采用地塞米松为阳性对照，采用酶联免疫法(elisa)测定炎症因子il-6和tnf-α的水平变化，从而探讨样品的体外抗炎作用。
[0057]
将睡莲花细胞水原液配制成不同的浓度进行测试，测试结果如下表。
[0058]
睡莲花细胞水浓度il-6(pg/ml)tnf-α(pg/ml)100％2615080％2615540％3116515％3917010％421745％47196空白25150lps刺激50260地塞米松45206
[0059]
从上表中可得知，80％浓度的睡莲花细胞水可使皮肤受lps刺激后，il-6表达因子降到正常范围，具有明显抗炎的作用；而100％浓度的睡莲花细胞水可使受lps刺激后的皮肤的tnf-α表达因子下降到正常范围内。
[0060]
(5)实施例1睡莲花细胞水保存条件测试
[0061]
睡莲花细胞水中活性成分较多，为防止其中菌类繁殖导致产品质量下降，因此如何保存十分重要。本文对实施例1睡莲花细胞水中加入一定量防腐剂苯氧乙醇在室温、4℃，两种种保存条件下的理化值和菌类繁殖情况进行了为期一个月的检测。
[0062]
1)室温不加防腐剂
[0063][0064]
2)4℃不加防腐剂
[0065][0066]
3)室温加防腐剂
[0067]
[0068]
4)4℃加防腐剂
[0069][0070]
由以上数据得知，室温不加防腐剂的睡莲花细胞水较容易生长细菌，4℃不加防腐剂的睡莲花细胞水，电导率稍增大，但微检在标准范围内，加入一定量防腐剂的睡莲花细胞水在室温、4℃下存放，理化数据稳定，微生物菌落总数达标。综上，4℃不加防腐剂、室温加防腐剂、4℃加防腐剂三种条件皆适合睡莲花细胞水的保存，为保险起见，建议4℃、室温下加入一定量防腐剂条件下保存较为稳妥。