一种古DNA文库构建的方法与流程

一种古dna文库构建的方法
技术领域
1.本发明涉及dna文库构建技术领域，具体涉及一种古dna文库构建的方法。


背景技术：

2.由于近年来高通量测序技术的迅速发展，使得古代化石中获取dna并进行全基因组测序成为可能并大大增进了我们对人类起源，进化的认识。尽管dna测序技术的不断进步，但由于天然的化学损伤和高度降解的特性，古dna回收和测序仍然面临这极大的挑战。特别是在dna文库制作过程中的酶促反应和dna纯化步骤会导致dna模板的丢失和测序偏差，会极大的影响下游dna测序以及数据分析。因此，开发高效率的dna文库制备方法是古dna获得能否成功的关键环节。


技术实现要素：

3.针对现有技术不足，本发明提供一种古dna文库构建的方法，弥补了现有商用dna建库试剂盒中超低浓度dna文库构建的空白，通过对dna单链进行建库能够有效对古dna以及其他高度降解的dna序列进行高效的文库构建，适宜在痕量dna测序，以及法医学中的应用。
4.为实现以上目的，本发明的技术方案通过以下技术方案予以实现：
5.一种古dna文库构建的方法，其特征在于，所述古dna文库构建新方法包括以下步骤：
6.(1)脱氨基位点的dna切割：将样品混合circligase bufferii、mncl2和endonucleaseviii进行孵育处理，获得样品dna；
7.(2)去磷酸化和热变性：dna用热不稳定的磷酸酶处理以去除dna链5'和3'末端的残留磷酸基团，否则会导致自环化或阻止接头连接，在这个阶段，来自胞嘧啶脱氨基的脱氧尿嘧啶也可以从dna链中去除；
8.(3)连接第一个接头：使用circligase ii将一个由10个核苷酸和一个长的3'
‑
生物素化间隔臂组成的5'
‑
磷酸化接头寡核苷酸连接到dna链的3'末端，得到连接产物备用；
9.(4)固定连接产物到磁珠：连接接头的分子以及多余的接头分子固定在链霉素亲和磁珠上，并使用与接头互补的5'尾引物复制模板链，并对磁珠进行洗涤，该反应使用bst聚合酶2.0进行，bst聚合酶2.0是嗜热脂肪芽孢杆菌dna聚合酶i的截短同源物，由于缺乏3'
–
5'核酸外切酶活性，会留下3'粘性末端；
10.(5)平末端修复：将上述洗涤后的磁珠悬浮后添加t4 dna聚合酶混合后再次纯化，由于引物和接头仅微弱杂交，在高于室温的环境下洗涤足以去除多余的引物，包括与未连接的接头分子结合的引物，否则这些引物会参与后面的连接步骤并导致接头二聚体的形成；
11.(6)连接第二个接头以及文库的洗脱：使用t4 dna聚合酶去除3'粘性末端后，通过使用t4 dna连接酶进行平端连接，将第二个接头连接到新合成的链上，为了防止接头之间
ii之前通过涡旋混合管中的内容物，之后用手指轻弹试管剧烈混合，在微量离心机中短暂旋转管子。
29.6、在带有加热盖的热循环仪中将上述步骤5中的反应混合物在60℃下孵育1h。
30.7、向每个反应混合物中加入2μl终止液，通过涡旋混合内容物并在微量离心机中旋转管。
31.固定连接产物到磁珠上：
32.8、涡旋重悬myone c1磁珠：对于每个样品，将20μl珠悬浮液转移到1.5ml管中。使用磁力架将磁珠压成颗粒，弃去上清液，用500μl磁珠结合缓冲液清洗磁珠两次，将磁珠重新悬浮在与样品数乘以250μl相对应的磁珠结合缓冲液中，每个样品，将250μl珠悬浮液的等分试样转移到1.5ml管中。
33.9、在带有加热盖的热循环仪中，将步骤7中的连接反应在95℃下孵育1min，当热循环仪仍处于95℃时，快速将管子转移到冰水浴中，让反应混合物冷却至少1min，在微量离心机中短暂旋转管子，并将连接反应添加到步骤8中制备的磁珠悬浮液中。
34.10、在室温下旋转试管20min。
35.11、在微量离心机中短暂旋转试管，使用磁力架吸附磁珠并丢弃上清液，用200μl洗涤缓冲液a洗涤磁珠一次，用200μl洗涤缓冲液b洗涤一次。
36.12、为所需的反应次数准备第一预混液(每个反应47μl)，每47μl的第一预混液包括5μl的lsothermal amplificationbuffer(10x)、0.5μl的dntp mix(25mm each)、1μl的extensionprimer cl9(100μm)和40.5μl的水。
37.13、使用磁力架将珠粒沉淀并丢弃洗涤缓冲液，将47μl的第一预混液加入沉淀的磁珠中，并通过涡旋重新悬浮磁珠，在65℃温度下将管子在热振荡器中孵育2min，将管子放在冰水浴中1min，然后立即将管子转移到预冷至15℃的热循环仪(打开盖子)，将试管置于热循环仪上时，向每个反应混合物中加入3μl的bst 2.0聚合酶(24u)，通过涡旋短暂混合管并将它们返回到热循环仪。
38.14、以每分钟1℃的速度升高温度，从15℃上升到37℃，从而孵育反应混合物，在37℃下执行5min的最终孵育步骤。
39.15、在微量离心机中短暂旋转试管，使用磁力架将磁珠粒化并丢弃上清液，用200μl洗涤缓冲液a洗涤磁珠一次，将磁珠重新悬浮在100μl严格洗涤缓冲液中，并在45℃的热振荡器中孵育磁珠悬浮液3min，使用磁力架将磁珠粒化并丢弃上清液，用200μl洗涤缓冲液b洗涤磁珠一次。
40.平末端修复：
41.16、为所需的反应次数准备第二预混液(每个反应99μl)，每99μl的第二预混液包括10μl的buffertango(10x)、2.5μl的tween 20(1％)、0.4μl的dntp(25mm each)和86.1μl的水。
42.17、使用磁力架将珠粒沉淀并丢弃洗涤缓冲液，将99μl的第二预混液添加到沉淀的磁珠中，并通过涡旋重新悬浮磁珠，添加1μl t4dna聚合酶(5u)，通过涡旋短暂混合。
43.18、将反应混合物在热振荡器中于25℃孵育15min，在孵化过程中保持磁珠悬浮。
44.19、向每个反应混合物中加入10μl edta(0.5m)并涡旋混合，使用磁力架将磁珠粒化并丢弃上清液，用洗涤缓冲液a、严格洗涤缓冲液(在45℃下孵育)和洗涤缓冲液b按照步
骤15清洗磁珠。
45.连接第二个接头以及文库的洗脱：
46.20、为所需的反应次数准备第三预混液(每个反应98μl)，每98μl的第三预混液包括10μl的t4 dna ligase buffer(10
×
)、2.5μl的tween 20(1％)、10μl的peg
‑
4000(50％)、2μl的double
‑
stranded adapter(100um)和73.5μl的水
47.21、使用磁力架将磁珠沉淀并丢弃洗涤缓冲液，将98μl的第三预混液添加到沉淀的磁珠中，并通过涡旋重新悬浮磁珠，添加2μl t4dna连接酶(10u)，通过涡旋短暂混合内容物。
48.22、将反应混合物在室温下孵育1h，在孵化过程中保持磁珠悬浮。
49.23、使用磁力架将珠粒沉淀并弃去上清液，完全按照步骤15中的描述，用洗涤缓冲液a、严格洗涤缓冲液(在45℃下孵育)和洗涤缓冲液b清洗磁珠。
50.24、使用磁力架将珠粒沉淀并弃去上清液，将25μl的tet缓冲液添加到沉淀的磁珠中，通过涡旋重悬磁珠并将磁珠悬浮液转移到0.2毫升pcr试管中，在微量离心机中短暂旋转管子。
51.25、在带有加热盖的热循环仪中，将磁珠悬浮液在95℃下孵育1min，立即将pcr带管转移到96孔磁架上，将含有文库分子的上清液转移到新的0.5ml管中。
52.确定文库制备效率和文库数量：
53.26、在单独的试管中，用19μl的tet缓冲液稀释1μl每个dna文库，此外，在tet缓冲液中从0.1μm cl104制备1:500稀释液。
54.27、为两个分析(a和b)准备两个qpcr主混合物，其中qpcr主混合物包括：12.5μl的maxima sybr green qpcr mastermix(2
×
)、0.5μl的either ls7(for assaya)or cl107(for assay b)(both 10um)、0.5μl的either ls8(for assaya)or cl108(for assay b)(both 10um)、1μl的sample，加水补足25μl；检测a应包括qpcr标准稀释度(109至102)、所有文库稀释度和水对照的重复测量，检测b应包括qpcr标准稀释液、cl104稀释液和水对照的重复测量，对于每次测量，将24μl主混合物移液到96孔pcr板的孔中并添加1μl样品，用光学条帽关闭孔，并通过涡旋短暂混合。
55.28、室温下，将pcr板在离心机中以2000g离心1min，将板放入qpcr循环仪中，并使用由95℃下的初始激活步骤10min组成的配置文件开始循环，然后在95℃下进行30s、60℃下30s和72℃下的40个循环30s，在每个扩展步骤结束时进行荧光测量。
56.29、使用qpcr系统提供的软件计算每个文库中的分子数并确定文库制备的效率。
57.文库扩增和标签制备：
58.30、准备pcr混合物，其中pcr混合物包括10μl的accuprime pfx reaction mix(10
×
)、4μl的p7 indexing primer(10um)、4μl的p5 indexing primer or ls4(10um)、24μl的library、1μl的accuprime pfxpolymerase(2.5u/μl)，加水补足100μl；双索引需要p5索引引物，在不需要双索引测序的情况下，用引物is4替换，且双索引库与单索引测序保持完全兼容。
59.31、在具有以下热曲线的热循环仪中孵育反应：初始变性在95℃温度下处理2min，遵循选定数量的pcr循环，包括在95℃下变性15s、在60℃下退火30s和在68℃下引物延伸1min。
60.32、使用minelute pcr纯化试剂盒或ampure xp spri珠纯化扩增的文库，在20μl te缓冲液中洗脱dna。
61.33、通过运行带有dna 1000芯片的agilentbioanalyzer 2100确定dna文库的片段大小分布和浓度。
62.其中，洗涤缓冲液a(50毫升)包括：47.125ml水、1ml 5mnacl、500μl 1m tris
‑
hcl(ph 8.0)、100μl 0.5m edta(ph 8.0)、25μl tween 20、1.25ml 20％sds。
63.洗涤缓冲液b(50毫升)包括：48.375ml水、1ml 5mnacl、500μl 1m tris
‑
hcl(ph 8.0)、100μl 0.5m edta(ph 8.0)、25μl tween 20。
64.检测：
65.进行平行对照，取自同一个古代样本的骨粉并进行古dna提取，提取液平均分为四份，分别进行dna双链建库和上述的单链文库构建，并在illuminamiseq测序仪上进行平行测序，具体结果如下所示：
66.1、单链建库的敏感性更高，产率更高，通过qpcr进行dna含量分析，单链建库即使是在空白对照中，发现人工合成序列减少了20倍。
67.2、本技术中单链文库构建中dna片段长度符合古dna分布模式。
68.3、gc含量接近40％，表明没有明显的建库偏差
69.需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
70.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。