一种海绵内生真菌来源的聚酮化合物及其在制备抗炎药物中的应用的制作方法

1.本发明属于医药化合物技术领域，涉及一种海绵内生真菌拟盘多毛孢菌中分离出的聚酮类化合物，及其在制备抗炎药物中的应用。


背景技术：

2.过去的几十年里，海绵内生真菌被认为是新药物的重要来源。真菌的代谢途径多样，代谢产物丰富，具有可持续性，对环境友好等特点，一直是药物筛选的重要源头。其次真菌的代谢产物具有广泛的生理活性，如抗菌，抗肿瘤，免疫调节，抗炎，酶抑制等多种活性。目前，从海绵内生真菌中寻找新的药源分子已成为国际国内研究的热点。然而，大多数生物合成基因簇在实验室条件下是沉默的，而只有一小部分基因簇被转录。为了扩大代谢物的多样性，人们采用osmac策略、表观遗传修饰和基因组挖掘等不同策略来激活沉默基因簇。
3.炎症是当机体受到外源性的感染，机体采取的自我组织修复，排除损伤细胞和外来抗原的免疫反应。然而这种免疫反应必须迅速且可控，防止发生进一步的炎症紊乱，从而造成严重组织损伤。据报道，炎症跟肥胖，糖尿病，血栓，甚至癌症都有直接的关系。目前临床上常用的抗炎药主要有两类：非甾体抗炎药和甾体类抗炎药。虽然他们在一定程度上具有抗炎效果，但长期大量使用会产生一系列不良反应和耐受性，如胃粘膜损伤、肝脏损伤、肾脏损害等。为解决药物的耐受性及不良反应，寻找新的抗炎药物成为抗炎药物研究领域的热点。
4.发明人在前期研究工作中，从采自中国西沙群岛的棕色扁海绵(phakellia fusca)中分离筛选得到一株海绵内生真菌，并鉴定为拟盘多毛孢(pestalotiopsis heterocornis)，并由该真菌发酵得到次生代谢产物。并且发现聚酮化合物具有很好的抗炎活性，能够显著抑制lps 诱导的no产生，表明海绵内生真菌发酵生产更多具有抗炎活性的化合物，对于治疗炎症类疾病具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明的目的是为了克服现有技术的不足，提供一种新的海绵内生真菌来源的聚酮化合物，该化合物可抑制lps诱导的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(raw 264.7 cells)释放no，起到显著的抗炎作用，在制备抗炎药物中具有远大的市场前景。
6.本发明的目的是提供一种海绵内生真菌拟盘多毛孢(pestalotiopsis heterocornis)来源的聚酮化合物i和ii。
7.本发明的另一目的是提供聚酮化合物i和ii的制备方法。
8.(1)将从棕色扁海绵中分离得到的真菌拟盘多毛孢菌(pestalotiopsis heterocornis)接入种子培养基中，得到种子培养液；
9.(2)真菌发酵培养：将种子培养液接入固体发酵培养基中，静置培养；
10.(3)粗提：总发酵物用乙酸乙酯浸泡，提取3～5次，收集提取液，浓缩得到浸膏；
11.(4)分离纯化：将浸膏经过硅胶柱层析得到化合物i和化合物ii。
12.进一步地，步骤(1)中所述的种子培养基的组分(按比重比)：麦芽浸膏5～20g，粗海盐10
‑
20g，蒸馏水1000～2000ml，ph7.4～8.2。
13.进一步地，步骤(2)中所述的固体大米发酵培养组成：大米100～200g，粗海盐2～ 10g，自来水200～1000m，培养时间：28～60天，静置培养温度：25～30℃。
14.进一步地，步骤(4)中所述的分离纯化的步骤具体为：将浸膏经过硅胶柱层析，洗脱条件为：二氯甲烷
‑
甲醇(30:1
‑
0:100)，得到1～10组分，以fr.1
‑
10表示；将fr.5经过硅胶层析柱洗脱，洗脱条件为：二氯甲烷
‑
丙酮(3:1)，得到1～5组分，以fr.5.1
‑
5.5 表示；再将fr.5.3组分经过常压反相柱(ods)洗脱，洗脱条件：甲醇
‑
水(80～40％)，得到1～5组分，以fr.5.3.1
‑
fr.5.3.5表示，将fr.5.3.5再经过半制备液相得到化合物i和化合物ii；所述的半制备液相为甲醇
‑
水，其体积比为40:60。
15.化合物的物理和化学性能描述：
16.化合物ⅰ，白色无定型固体，旋光值为：
‑
10.0(c0.2,meoh)；紫外吸收(meoh)λ
max
(log ε)273.8(3.62),213(4.40)nm；红外吸收(film)ν
max
3414,2940,2870,1732,1717, 1640,1456,1373,1149,1024cm
‑1；高分辨质谱m/z 415.1755[m na]

(calcd for c
21
h
28
nao7,415.1733).
[0017]
化合物ⅱ，白色无定型固体，旋光值为
‑
14.6(c0.1,meoh)；紫外吸收(meoh)λ
max
(log ε)272(3.78),208(4.60)nm；红外吸收(film)ν
max
3414,2941,2870,1732,1716,1650, 1490,1485,1373,1240,1026cm
‑1；高分辨质谱m/z415.1745[m na]

(calcd forc
21
h
28
nao7,415.1733)。
[0018]
本发明的再一目的是提供所述的海绵内生真菌来源的聚酮化合物在制备抗炎药物中的应用。
[0019]
本发明的再一目的是提供所述的海绵内生真菌来源的聚酮化合物在制备能够抑制lps 诱导no产生的药物中的应用。
[0020]
本发明提供了一株海绵内生真菌来源的聚酮类衍生物及其在制备抗炎药物中的应用。本发明从中国西沙群岛的棕色扁海绵(phakellia fusca)中分离得到一株海绵内生真菌拟盘多毛孢(pestalotiopsis heterocornis)，并从该真菌的发酵培养产物中分离鉴定得到了聚酮类衍生物，该衍生物具有较强的抗no产生的活性，其抗炎活性与阳性药物地塞米小相当，且该衍生物，无细胞毒活性，有很大的安全系数。因此，本发明提供的聚酮类衍生物在制备抗炎药物、尤其是制备抑制lps诱导no产生的药物中具有良好的临床应用前景。
附图说明
[0021]
图1为化合物ⅰ和ⅱ抑制lps诱导的raw 264.7细胞释放no比较图；
[0022]
图2为化合物ⅰ和ⅱ抑制lps诱导的raw 264.7inos蛋白表达比较图。
具体实施方式
[0023]
实施例1海绵内生真菌的获得
[0024]
1、实验方法
[0025]
发明人团队从采自中国西沙群岛的棕色扁海绵(phakellia fusca)中分离得到一
株海绵内生真菌，经rdnaits区分析，鉴定为拟盘多毛孢(pestalotiopsis heterocornis)。
[0026]
2、实验结果
[0027]
海绵内生真菌的its
‑
rrna基因序列如seq id no.1所示：
[0028]
实施例2聚酮化合物的制备鉴定
[0029]
本实施例利用海绵内生真菌发酵生产得到聚酮类衍生物，具体的实验方法和实验结果如下：
[0030]
2.1、衍生物的制备
[0031]
衍生物的制备方法包括以下步骤：
[0032]
(1)将从棕色扁海绵中分离得到的真菌拟盘多毛孢菌(pestalotiopsis heterocornis)接入种子培养基中，得到种子培养液；所述的种子培养基的组分(按比重比)：麦芽浸膏5～ 20g，粗海盐10
‑
20g，蒸馏水1000～2000ml，ph 7.4～8.2；
[0033]
(2)真菌发酵培养：将种子培养液接入固体发酵培养基中，静置培养；所述的固体大米发酵培养组成：大米100～200g，粗海盐2～10g，自来水200～1000m，培养时间： 28～60天，静置培养温度：25～30℃；
[0034]
(3)粗提：总发酵物用乙酸乙酯浸泡，提取3～5次，收集提取液，浓缩得到浸膏；
[0035]
(4)分离纯化：将浸膏经过硅胶柱层析得到化合物i和化合物ii，具体为：洗脱条件为：二氯甲烷
‑
甲醇(30:1
‑
0:100)，得到1～10组分，以fr.1
‑
10表示；将fr.5经过硅胶层析柱洗脱，洗脱条件为：二氯甲烷
‑
丙酮(3:1)，得到1～5组分，以fr.5.1
‑
5.5表示；再将fr.5.3组分经过常压反相柱(ods)洗脱，洗脱条件：甲醇
‑
水(80～40％)，得到1～5组分，以fr.5.3.1
‑
fr.5.3.5表示，将fr.5.3.5再经过半制备液相得到化合物i和化合物ii；所述的半制备液相为甲醇
‑
水，其体积比为40:60。
[0036]
2.2、衍生物的鉴定
[0037]
对衍生物i和ii进行结构解析，化合物1和化合物2理化数据如下：
[0038]
衍生物i的分子式：c
21
h
28
o7高分辨质谱(hresims)415.1755[m na]

(calcd for c
21
h
28
nao7,415.1733).
[0039]
衍生物ii的分子式：c
21
h
28
o7高分辨质谱hresimsm/z415.1745[m na]

(calcd for c
21
h
28
nao7,415.1733)
[0040]
衍生物i和ii的核磁数据如表1所示
[0045]
ii r1＝coch3,r2＝h
[0046]
化合物的物理和化学性能描述：
[0047]
化合物ⅰ，白色无定型固体，旋光值为：
‑
10.0(c0.2,meoh)；紫外吸收(meoh)λ
max
(log ε)273.8(3.62),213(4.40)nm；红外吸收(film)ν
max
3414,2940,2870,1732,1717, 1640,1456,1373,1149,1024cm
‑1；高分辨质谱m/z 415.1755[m na]

(calcd for c
21
h
28
nao7,415.1733).
[0048]
化合物ⅱ，白色无定型固体，旋光值为
‑
14.6(c0.1,meoh)；紫外吸收(meoh)λ
max
(log ε)272(3.78),208(4.60)nm；红外吸收(film)ν
max
3414,2941,2870,1732,1716,1650, 1490,1485,1373,1240,1026cm
‑1；高分辨质谱m/z 415.1745[m na]

(calcd for c
21
h
28
nao7,415.1733).
[0049]
实施例3聚酮化合物的抗炎活性研究
[0050]
1、细胞培养及抗炎活性检测
[0051]
(1)将raw264.7细胞接种于10％fbs的dmem高糖培养基，在37℃、5％二氧化碳条件下进行常规培养和传代。
[0052]
(2)抗炎活性检测
[0053]
取对数期生长的raw264.7细胞以1
×
106细胞/孔的方式接种于6孔板中。24h后，分别用化合物ⅰ(0、3、11、33μm)、ⅱ(0、3、11、33μm)和阳性药地塞米松dxm(33μ m)预处理细胞2h，再用lps(1μg/ml)刺激细胞24h。收集上清液，用griess法检测 no含量。结果如下图1所示，化合物ⅰ和ⅱ均可显著抑制lps诱导的巨噬细胞no的释放，同时化合物ⅰ和ⅱ均无细胞毒，故可初步断定化合物ⅰ和ⅱ具有较好的抗炎活性。
[0054]
免疫印迹分析：raw264.7细胞使用化合物7(0、3、11日33μm),8(0、3、11日33μ m)和dxm(33μm)2h,然后用lps刺激(1μg/ml)24h。总蛋白提取通过里帕(beyotime, 北京)和浓度来衡量bca蛋白质装配工具(beyotime,北京)。用10％sds
‑
page分离(40μg) 蛋白，转移到pvdf膜(millipore,billerca,ma,usa)上，用5％脱脂牛奶在tbs中室温封闭1h。一抗孵育过夜，tbst洗涤3次，辣根过氧化物酶结合的二抗室温孵育1h,tbst 洗涤3次，cel(millipore)显示。gapdh作为内参。用fluor chem fc3系统 (proteinsimple,usa)分析能带图。数据以至少三次独立实验的平均值
±
s.e.表示。在适当的情况下，使用t检验或单向方差分析来确定平均数之间差异的统计显著性。如果发现平均值有显著差异，则通过tukey的事后检验进行多重两两比较。差异接受阈值为5％(p ≤0.05)。
[0055]
由图2可知，与空白组相比，lps模型组inos表达高，说明已经成功引起炎症反应，而阳性药(地塞米松)组显著抑制该蛋白的表达，同时，化合物ⅰ和ⅱ均显著抑制inos 蛋白的表达。这进一步说明化合物ⅰ和ⅱ具有较强的抗炎活性。