一种t2毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用
技术领域
1.本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种t2毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用。
背景技术：
2.t2毒素（t2）是由多种镰刀菌产生的一种霉菌毒素。主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物及其制品，对人类健康及畜牧业构成了较大危害。t
‑
2毒素主要影响血液，肝脏，肾脏，胰腺肌肉及淋巴细胞的功能，t
‑
2毒素中毒后的一般临床症状为厌食、呕吐、腹泻、生长停滞、繁殖和神经机能障碍等。目前对的检测方法多为仪器检测，如薄层色谱法、液相色谱法、液相色谱
‑
质谱法、气相色谱
‑
质谱法等。仪器检测法虽然具有较高的准确性，但是样品前处理繁琐、检测时间长、仪器价格昂贵，并且需要专业的操作人员，从而限制了该方法的广泛应用。酶联免疫吸附测定技术enzyme
‑
linked immunosorbent assay(elisa)，是将免疫技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微量的测定方法，具有成本低、速度快、灵敏度高、仪器设备简单的特点，可以进行现场操作。适合大批量样品的快速分析。而免疫学检测方法的基础是高特异性、高亲和力的抗体的制备，而t2毒素作为小分子化合物，本身不具备免疫原性，因此，其半抗原的结构改造和全抗原合成是建立免疫速测技术的关键和难点之一。
技术实现要素：
3.为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种t2毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用。
4.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：一种t2毒素半抗原，该半抗原的分子结构如下所示：。
5.进一步的，本发明所述t2毒素半抗原的制备方法，包括以下步骤：（1）取5ml单口瓶，称取t2 毒素10mg、zncl
2 2mg、γ
‑
氨基丁酸3.2mg，加入二氯甲烷2ml，室温搅拌反应过夜；（2）tlc检测反应完全后，加入5ml水，用5ml二氯甲烷萃取3次，无水硫酸钠干燥有机相后旋干有机相，即得到t2毒素半抗原。
6.一种t2毒素人工抗原，所述人工抗原由权利要求1所述的半抗原与载体蛋白偶联后制备而得。
7.进一步的，本发明所述t2毒素人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
7h), 1.80 (d, j=16.6hz, 1h),1.78 (m, 2h), 1.76 (s, 3h), 0.96 (d, j=6.3hz, 3h), 0.95 (d, j=6.3hz, 3h), 0.74 (s, 3h); 13c nmr (75 mhz, cdcl3) δ 182.7, 173.1, 170.4, 170.2, 136.3 , 123.6, 82.8, 81.6, 79.7, 76.3, 71.6, 68.1, 64.8, 50.2, 49.9, 44.5, 44.4, 41.2, 35.9, 28.3, 25.9, 25.8, 25.4, 22.6, 22.3, 21.0, 20.7, 6.5; hrms (esi) calcd for c28h44no11 (m h) 570.2909, found: 570.2939.实施例2 人工抗原的合成1、免疫原的合成（1）取5mg半抗原、3.5 mg nhs、5 mg edc溶于200μl dmf溶液中，反应2h；（2）将20 mg bsa载体蛋白溶于2ml的ph9.6缓冲溶液中，将步骤（1）的反应液滴加至载体蛋白溶液中，反应过夜，即得t2毒素免疫原。
17.2、包被原的合成（1）取5mg半抗原、3.5 mg nhs、5 mg edc溶于200μl dmf溶液中，反应2h；（2）将20 mg ova载体蛋白溶于2ml的ph9.6缓冲溶液中，将步骤（1）的反应液滴加至载体蛋白溶液中，反应过夜，即得t2毒素包被原。
18.实施例3 单克隆抗体制备一种t2毒素单克隆抗体，是将实施例2制备的免疫原免疫6～8周龄的balb/c小鼠制备而得，用于检测食品中t2毒素的残留量。
19.（1）小鼠免疫：将完全抗原作为免疫原来免疫balb/c雌性小鼠。使用无菌生理盐水将完全抗原稀释至1mg/ml，取适量稀释液，与等体积的快速免疫佐剂混合，振荡均匀后，按照10μg/只的剂量进行肌肉单点注射。三周后，按照同样的剂量和方式进行第二次免疫，并于免疫后七天对小鼠进行尾部采血并检测效价。
20.（2）细胞融合：将采集的小鼠尾血分离血清后，采用间接elisa和间接竞争elisa测定血清的效价和抑制。选择效价高、抑制好的小鼠进行细胞融合。小鼠在最后一次免疫后18天冲击免疫，三天后通过无菌操作去除脾脏，制备脾单细胞悬液，按照10:1的比例与对数期生长的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0细胞进行混合。离心去除上清液体，将细胞振散后，通过聚乙二醇法进行细胞融合。
21.（3）亚克隆：融合后第3天和第5天，分别进行50％、90％hat培养液换液，第7～9天进行细胞上清的筛选。挑选阳性的细胞上清，利用elisa测定抑制情况，并选择抑制最好的细胞孔进行亚克隆。亚克隆采用有限稀释法，每孔0.5～2个细胞，重复三次亚克隆。第一次亚克隆使用ht培养液，后两次使用1640培养液，所有培养液中血清含量均为15％，最终得到所需的单克隆抗体细胞株。
22.（4）细胞冻存与复苏纯化：将得到的细胞株扩大培养后，冻存保种，其余细胞继续培养，通过体内腹水法制备单克隆抗体，采用辛酸硫酸铵法或蛋白g方法进行纯化。
23.实施例4 t2单克隆抗体酶联免疫检测方法的构建一、采用间接elisa方法检测血清效价，具体操作步骤如下：1、包被：将实施例2制备的包被原用0.05m ph9.6碳酸盐缓冲液从5μg/ml开始倍比稀释，100μl/孔，37
°
c反应2h。
24.2、洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。
25.3、封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37
°
c反应2h，洗涤后烘干备用。
26.4、加样：将实施例3所得单抗从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μl/孔，37
°
c反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp
‑
羊抗鼠igg，100μl/孔，37
°
c反应1h。
27.5、显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37
°
c避光反应15min。、6、终止和测定：每孔加入100μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值。
28.二、最低检测限以及特异性的检测具体操作步骤如下： 1、用上述的间接elisa方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以od450值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。
29.2、包被：将包被原用包被缓冲液稀释至最适工作浓度，100μl/孔，37
°
c反应2h。
30.3、洗涤和封闭：方法操作同上述间接elisa法。
31.4、配制t2标准溶液：将t2标准品用0.01mol/l，ph7.4的pbs溶液配制成1mg/ml的母液，然后，再用0.01mol/l、ph7.4的pbs溶液倍比稀释成系列浓度。
32.5、加样：每孔加入50μl倍比稀释的标准品，然后再加入50μl/孔最适稀释倍数的抗体，37
°
c反应1h。充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp
‑
羊抗鼠igg，100μl/孔，37
°
c反应1h。
33.6、显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37
°
c避光反应15min。
34.7、终止和测定：每孔加入100μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值。8、数据处理：以t2各浓度的对数为横坐标，以对应的od值为纵坐标，绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（ic50，即od450值从零标准溶液对应的数值下降到50%时所对应的标准品浓度），从而判定抗血清对t2是否具有特异性。
35.抗体交叉反应的测定：通过以上间接竞争elisa测得t2单克隆抗体的ic
50
及与其类似物ht2的交叉反应率。
36.交叉反应率（%）=ic
50
（t2）/ic
50
（类似物），实验设3次重复，结果取平均值。
37.结果显示，t2单克隆抗体的检测限为2ng/ml，各类似物的交叉反应率均小于0.1%。
38.对比例1一、使用琥珀酸酐法制备t2半抗原将10mg t
‑
2毒素和15mg琥珀酸酐置于0.8 ml吡啶中，在100℃温度下反应4 h。待降至室温后，将反应混合物于氮气下吹干，再溶于氯仿中；用蒸馏水洗4次，将氯仿抽提物蒸发干燥，得t
‑
2hs。
39.二、人工抗原的制备使用与实施例2相同的方法制备人工免疫原和包被原。
40.三、单克隆抗体的制备使用与实施例3相同的方法制备t2单克隆抗体。
41.四、最低检测限以及特异性的检测
使用与实施例4相同的方法构建酶联免疫检测方法，通过该方法测得的t2单克隆抗体的检测限为20ng/ml，各类似物的交叉反应率小于0.1%。
42.综上所述，本发明所述人工抗原制备的单克隆抗体的检测限明显低于对比例1制得的抗体的检测限，从而说明本发明半抗原的合成方法比对比例1半抗原的合成方法具有更好的技术效果，本发明制得的抗体极大的提高了对t2检测的灵敏度，更有利于对实际样本的检测应用。
技术领域
1.本发明属于食品安全检测领域，具体涉及一种t2毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用。
背景技术：
2.t2毒素（t2）是由多种镰刀菌产生的一种霉菌毒素。主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物及其制品，对人类健康及畜牧业构成了较大危害。t
‑
2毒素主要影响血液，肝脏，肾脏，胰腺肌肉及淋巴细胞的功能，t
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2毒素中毒后的一般临床症状为厌食、呕吐、腹泻、生长停滞、繁殖和神经机能障碍等。目前对的检测方法多为仪器检测，如薄层色谱法、液相色谱法、液相色谱
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质谱法、气相色谱
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质谱法等。仪器检测法虽然具有较高的准确性，但是样品前处理繁琐、检测时间长、仪器价格昂贵，并且需要专业的操作人员，从而限制了该方法的广泛应用。酶联免疫吸附测定技术enzyme
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linked immunosorbent assay(elisa)，是将免疫技术与现代测试手段相结合而建立的一种超微量的测定方法，具有成本低、速度快、灵敏度高、仪器设备简单的特点，可以进行现场操作。适合大批量样品的快速分析。而免疫学检测方法的基础是高特异性、高亲和力的抗体的制备，而t2毒素作为小分子化合物，本身不具备免疫原性，因此，其半抗原的结构改造和全抗原合成是建立免疫速测技术的关键和难点之一。
技术实现要素：
3.为了解决以上现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种t2毒素半抗原、人工抗原的合成方法及其应用。
4.为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：一种t2毒素半抗原，该半抗原的分子结构如下所示：。
5.进一步的，本发明所述t2毒素半抗原的制备方法，包括以下步骤：（1）取5ml单口瓶，称取t2 毒素10mg、zncl
2 2mg、γ
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氨基丁酸3.2mg，加入二氯甲烷2ml，室温搅拌反应过夜；（2）tlc检测反应完全后，加入5ml水，用5ml二氯甲烷萃取3次，无水硫酸钠干燥有机相后旋干有机相，即得到t2毒素半抗原。
6.一种t2毒素人工抗原，所述人工抗原由权利要求1所述的半抗原与载体蛋白偶联后制备而得。
7.进一步的，本发明所述t2毒素人工抗原的制备方法，包括以下步骤：
7h), 1.80 (d, j=16.6hz, 1h),1.78 (m, 2h), 1.76 (s, 3h), 0.96 (d, j=6.3hz, 3h), 0.95 (d, j=6.3hz, 3h), 0.74 (s, 3h); 13c nmr (75 mhz, cdcl3) δ 182.7, 173.1, 170.4, 170.2, 136.3 , 123.6, 82.8, 81.6, 79.7, 76.3, 71.6, 68.1, 64.8, 50.2, 49.9, 44.5, 44.4, 41.2, 35.9, 28.3, 25.9, 25.8, 25.4, 22.6, 22.3, 21.0, 20.7, 6.5; hrms (esi) calcd for c28h44no11 (m h) 570.2909, found: 570.2939.实施例2 人工抗原的合成1、免疫原的合成（1）取5mg半抗原、3.5 mg nhs、5 mg edc溶于200μl dmf溶液中，反应2h；（2）将20 mg bsa载体蛋白溶于2ml的ph9.6缓冲溶液中，将步骤（1）的反应液滴加至载体蛋白溶液中，反应过夜，即得t2毒素免疫原。
17.2、包被原的合成（1）取5mg半抗原、3.5 mg nhs、5 mg edc溶于200μl dmf溶液中，反应2h；（2）将20 mg ova载体蛋白溶于2ml的ph9.6缓冲溶液中，将步骤（1）的反应液滴加至载体蛋白溶液中，反应过夜，即得t2毒素包被原。
18.实施例3 单克隆抗体制备一种t2毒素单克隆抗体，是将实施例2制备的免疫原免疫6～8周龄的balb/c小鼠制备而得，用于检测食品中t2毒素的残留量。
19.（1）小鼠免疫：将完全抗原作为免疫原来免疫balb/c雌性小鼠。使用无菌生理盐水将完全抗原稀释至1mg/ml，取适量稀释液，与等体积的快速免疫佐剂混合，振荡均匀后，按照10μg/只的剂量进行肌肉单点注射。三周后，按照同样的剂量和方式进行第二次免疫，并于免疫后七天对小鼠进行尾部采血并检测效价。
20.（2）细胞融合：将采集的小鼠尾血分离血清后，采用间接elisa和间接竞争elisa测定血清的效价和抑制。选择效价高、抑制好的小鼠进行细胞融合。小鼠在最后一次免疫后18天冲击免疫，三天后通过无菌操作去除脾脏，制备脾单细胞悬液，按照10:1的比例与对数期生长的小鼠骨髓瘤细胞sp2/0细胞进行混合。离心去除上清液体，将细胞振散后，通过聚乙二醇法进行细胞融合。
21.（3）亚克隆：融合后第3天和第5天，分别进行50％、90％hat培养液换液，第7～9天进行细胞上清的筛选。挑选阳性的细胞上清，利用elisa测定抑制情况，并选择抑制最好的细胞孔进行亚克隆。亚克隆采用有限稀释法，每孔0.5～2个细胞，重复三次亚克隆。第一次亚克隆使用ht培养液，后两次使用1640培养液，所有培养液中血清含量均为15％，最终得到所需的单克隆抗体细胞株。
22.（4）细胞冻存与复苏纯化：将得到的细胞株扩大培养后，冻存保种，其余细胞继续培养，通过体内腹水法制备单克隆抗体，采用辛酸硫酸铵法或蛋白g方法进行纯化。
23.实施例4 t2单克隆抗体酶联免疫检测方法的构建一、采用间接elisa方法检测血清效价，具体操作步骤如下：1、包被：将实施例2制备的包被原用0.05m ph9.6碳酸盐缓冲液从5μg/ml开始倍比稀释，100μl/孔，37
°
c反应2h。
24.2、洗涤：将板内溶液倾去，甩干，并用洗涤液洗涤3次，每次3min。
25.3、封闭：拍干后，加入200μl/孔封闭液，37
°
c反应2h，洗涤后烘干备用。
26.4、加样：将实施例3所得单抗从1:1000开始倍比稀释，并加入到各稀释度的包被孔中，100μl/孔，37
°
c反应1h；充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp
‑
羊抗鼠igg，100μl/孔，37
°
c反应1h。
27.5、显色：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37
°
c避光反应15min。、6、终止和测定：每孔加入100μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值。
28.二、最低检测限以及特异性的检测具体操作步骤如下： 1、用上述的间接elisa方阵滴定法确定包被原和抗体的工作浓度，以od450值在1.5左右时所对应的抗原和抗体浓度为最适工作浓度。
29.2、包被：将包被原用包被缓冲液稀释至最适工作浓度，100μl/孔，37
°
c反应2h。
30.3、洗涤和封闭：方法操作同上述间接elisa法。
31.4、配制t2标准溶液：将t2标准品用0.01mol/l，ph7.4的pbs溶液配制成1mg/ml的母液，然后，再用0.01mol/l、ph7.4的pbs溶液倍比稀释成系列浓度。
32.5、加样：每孔加入50μl倍比稀释的标准品，然后再加入50μl/孔最适稀释倍数的抗体，37
°
c反应1h。充分洗涤后，加入1:3000稀释的hrp
‑
羊抗鼠igg，100μl/孔，37
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c反应1h。
33.6、显色反应：将酶标板取出，充分洗涤后，每孔加入100μl的tmb显色液，37
°
c避光反应15min。
34.7、终止和测定：每孔加入100μl终止液以终止反应，然后用酶标仪测定各孔的od450值。8、数据处理：以t2各浓度的对数为横坐标，以对应的od值为纵坐标，绘制标准曲线，计算半数抑制浓度（ic50，即od450值从零标准溶液对应的数值下降到50%时所对应的标准品浓度），从而判定抗血清对t2是否具有特异性。
35.抗体交叉反应的测定：通过以上间接竞争elisa测得t2单克隆抗体的ic
50
及与其类似物ht2的交叉反应率。
36.交叉反应率（%）=ic
50
（t2）/ic
50
（类似物），实验设3次重复，结果取平均值。
37.结果显示，t2单克隆抗体的检测限为2ng/ml，各类似物的交叉反应率均小于0.1%。
38.对比例1一、使用琥珀酸酐法制备t2半抗原将10mg t
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2毒素和15mg琥珀酸酐置于0.8 ml吡啶中，在100℃温度下反应4 h。待降至室温后，将反应混合物于氮气下吹干，再溶于氯仿中；用蒸馏水洗4次，将氯仿抽提物蒸发干燥，得t
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2hs。
39.二、人工抗原的制备使用与实施例2相同的方法制备人工免疫原和包被原。
40.三、单克隆抗体的制备使用与实施例3相同的方法制备t2单克隆抗体。
41.四、最低检测限以及特异性的检测
使用与实施例4相同的方法构建酶联免疫检测方法，通过该方法测得的t2单克隆抗体的检测限为20ng/ml，各类似物的交叉反应率小于0.1%。
42.综上所述，本发明所述人工抗原制备的单克隆抗体的检测限明显低于对比例1制得的抗体的检测限，从而说明本发明半抗原的合成方法比对比例1半抗原的合成方法具有更好的技术效果，本发明制得的抗体极大的提高了对t2检测的灵敏度，更有利于对实际样本的检测应用。
再多了解一些
本文用于企业家、创业者技术爱好者查询，结果仅供参考。
