用于减轻自身免疫性疾病患者不良炎性反应的小分子化合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域，尤其涉及用于减轻自身免疫性疾病患者不良炎性反应的小分子化合物及其应用。


背景技术：

2.dna感受器感知胞质内积累的外源或自身dna后，通过激活下游信号引起干扰素和其他促炎细胞因子的产生，从而引发强烈的免疫应答。胞质dna识别受体环一磷酸鸟苷一磷酸腺苷合酶(cyclic gmp
‑
amp synthase，cgas)的发现是dna识别领域的重要里程碑。cgas识别胞质dna后，催化三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，atp)和三磷酸鸟苷(guanosine triphosphate，gtp)合成cgamp，随后，cgamp结合干扰素刺激基因(stimulator of interferon gene，sting)并诱导其sting二聚化，激活tank结合激酶1(tank
‑
bindingkinase1，tbk1)和核因子kb抑制剂(inhibitor of nuclear factor kappa
‑
b kinase，ikk)，随后它们分别激活干扰素调节因子3(interferon regulatory factor 3，irf3)和核因子kb(nuclear factor kappa
‑
b kinase，nf
‑
κb)，最终引起快速而强烈的干扰素产生。异常的dna累积激活cgas
‑
sting通路所诱发的下游干扰素和其他细胞因子的产生，可能导致自身炎症和自身免疫疾病。
3.类风湿性关节炎((rheumatoid arthritis，ra)是一类以炎症细胞浸润、成纤维细胞样滑膜细胞(fibroblast
‑
like synovial，fls)侵入性增殖、关节损伤为特点的免疫疾病。目前临床上治疗ra的目的主要以减轻关节炎症反应，抑制病变发展及不可逆骨质破坏，尽可能保护关节和肌肉的功能，减轻患者疼痛为主，其中药物治疗在临床上较为多用。ra治疗药物主要由非甾体抗炎药(nasids)、抗风湿药(dmards)、糖皮质激素(gcs)、生物制剂等几类。自身免疫性疾病方面暂无小分子药物，每种小分子药物设计都是针对一种机制，因此，有自己的适应群体，并不能覆盖所有的自身免疫性疾病患者。因此，需要探寻更多有效的、广谱的炎性反应抑制药物，提高患者生存受益，降低患者疾病负担。
4.cgas在ra这一疾病进程中发挥着重要作用，在ra
‑
fls中，tnfα刺激cgas
‑
sting过表达而促进ra
‑
fls增殖，sting通过irf3
‑
tbk1和mapk
‑
nf
‑
κb通路显著增加主要促炎调节因子il
‑
1β、il
‑
6、mmp
‑
1和mmp
‑
3的表达。因此，筛选出能够特异性抑制cgas
‑
cgamp
‑
sting的小分子药物能够抑制炎性反应，提高患者生存受益，具有重要临床应用价值。


技术实现要素：

5.本发明针对现有技术的不足，提供了用于减轻自身免疫性疾病患者不良炎性反应的小分子化合物milciclib(一种有效的cdk和tropomyosin receptor kinase(trk)双重抑制剂)及其应用，milciclib能够抑制患者自身免疫反应，改善生活质量，提高生存预期。
6.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
7.本发明的第一方面提供了用于减轻自身免疫性疾病患者不良炎性反应的小分子
化合物，该小分子化合物为milciclib或其药学上可接受的盐。
8.进一步地，上述milciclib的化学分子结构如式(ⅰ)所示：
[0009][0010]
进一步地，上述小分子化合物能够特异性识别sting并抑制sting下游信号通路。
[0011]
本发明的第二方面是提供本发明第一方面中的小分子化合物在制备用于减轻自身免疫性疾病患者不良炎性反应的药物中的应用。
[0012]
进一步地，上述药物还包括药学上可接受的载体或赋形剂。
[0013]
本发明的第三方面是提供一种用于治疗自身免疫性疾的药物，其包括milciclib或其药学上可接受的盐作为有效成分。
[0014]
进一步地，上述milciclib或其药学上可接受的盐通过抑制
[0015]
cgas
‑
cgamp
‑
sting信号通路进而减轻自身免疫性疾病患者不良炎性反应。
[0016]
本发明的第四方面是提供本发明第一方面中的小分子化合物的筛选方法，其包括如下步骤：
[0017]
步骤一，将在包含活性化合物的小分子微阵列上，采用bsa溶液封闭基片上未点印小分子位置的异氰酸酯基团；
[0018]
步骤二，对基片上未点印小分子位置的异氰酸酯基团封闭后，采用靶点蛋白sting与小分子微阵列反应；
[0019]
步骤三，对微阵列扫描，然后进行数据采集和分析。
[0020]
进一步地，上述bsa溶液的浓度为0.5mg/ml。
[0021]
进一步地，上述靶点蛋白sting的浓度为10μg/ml。
[0022]
进一步地，步骤二中的反应的时间为50
‑
70min。
[0023]
本发明采用以上技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0024]
本发明提供的小分子化合物milciclib能够特异性识别sting并抑制sting下游信号通路，进而降低机体自身炎症反应，提高患者生存受益，降低患者疾病负担，为制备用于减轻自身免疫性疾病患者不良炎性反应的药物提供了新的策略。
附图说明
[0025]
图1为本发明一实施例中的与sting反应后的小分子微阵列的oi
‑
rd差值图像；
[0026]
图2为本发明一实施例中与sting反应后hepes缓冲溶液中的小分子微阵列oi
‑
rd图像与反应前hepes缓冲溶液的小分子微阵列oi
‑
rd图像的差值图像；
[0027]
图3显示了本发明一实施例中在初筛的小分子化合物存在的情况下，c57小鼠腹腔巨噬细胞(采用外源性isd刺激)的ifn
‑
β表达水平结果；
[0028]
图4显示了本发明一实施例中在初筛的小分子化合物存在的情况下，c57小鼠腹腔巨噬细胞(采用外源性cgamp刺激)的ifn
‑
β表达水平结果。
具体实施方式
[0029]
sting通路在自身免疫疾病发生过程中十分关键，已经成为十分重要的干预和治疗靶点，本发明旨在筛选出一种针对sting靶点的小分子抑制剂，抑制患者自身免疫反应，改善生活质量，提高生存预期。基于上述目的，本发明提供了用于减轻自身免疫性疾病患者不良炎性反应的小分子化合物及其应用，该小分子化合物为milciclib或其药学上可接受的盐，该milciclib的化学分子结构分别如式(ⅰ)所示：
[0030][0031]
其中，上述小分子化合物能够特异性识别sting并抑制sting下游信号通路。
[0032]
上述小分子化合物的筛选方法包括如下步骤：
[0033]
步骤一，将在包含活性化合物的小分子微阵列上，采用bsa溶液封闭基片上未点印小分子位置的异氰酸酯基团；
[0034]
步骤二，对基片上未点印小分子位置的异氰酸酯基团封闭后，采用靶点蛋白sting与小分子微阵列反应；
[0035]
步骤三，对微阵列扫描，然后进行数据采集和分析。
[0036]
在本发明一优选的实施例中，bsa溶液的浓度为0.5mg/ml。
[0037]
在本发明一优选的实施例中，上述靶点蛋白sting的浓度为10μg/ml。
[0038]
在本发明一优选的实施例中，步骤二中的反应的时间为50
‑
70min。
[0039]
下面通过具体实施例和附图对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0040]
实施例中方法如无特殊说明的采用常规方法，使用的试剂如无特殊说明的使用常规市售试剂或按常规方法配制的试剂。
[0041]
实施例1
[0042]
新型药物研究与开发的起点和关键步骤是化合物的活性筛选，本实施例通过高通量筛选sting蛋白特异性结合的小分子化合物，具体的实验步骤和结果如下：
[0043]
在fda批准的3375种活性化合物小分子微阵列上，采用0.5mg/ml的bsa溶液封闭基片上未点印小分子位置的异氰酸酯基团后，采用体积为1.5ml，浓度10μg/ml的靶点蛋白sting与小分子微阵列反应1小时，得到与sting蛋白应后的小分子微阵列的oi
‑
rd差值图像(反应后在蛋白溶液中的oi
‑
rd图像与反应前在缓冲溶液中的oi
‑
rd图像的差)，如图1所示。
[0044]
为了从图1所有的亮点中正确地挑选出与sting反应的小分子，然后使用hepes缓冲溶液清洗反应后的小分子微阵列后在缓冲溶液中连续取两幅oi
‑
rd图像。图2是反应后hepes缓冲溶液中的小分子微阵列oi
‑
rd图像与反应前hepes缓冲溶液的oi
‑
rd小分子微阵列图像的差值图像，图中的相邻双亮点包括能够与sting反应的解离速率较慢的小分子，还包括由于各种原因造成的信号变化的小分子。在图1中出现的相邻双亮点但在图2变弱或消失的双亮点对应的是与sting结合但解离速率较快的小分子。
[0045]
因此，从图1～2可以初步获得与sting结合的部分分子(解离速率较快)。然后进行了3次独立的sting的筛选，3次实验中至少2次成为可信阳性点的小分子是最终的可信阳性化合物阳性点。根据上述分析我们得到sting最终的阳性化合物为a6小分子
‑
milciclib(对应箭头所表示的化合物，8j19)。
[0046]
实施例2
[0047]
本实施例通过细胞学水平验证实施例1中筛选的小分子的功能，具体的实验方法和结论如下：
[0048]
分别用1μm浓度外源性isd(cgas激活剂)和1μm浓度cgamp(sting激活剂)刺激c57小鼠腹腔巨噬细胞6h，分别加入a2、a3、a7、b2、b5等小分子化合物平行对照，随后用rt
‑
rcr技术检测这几组不同刺激的肿瘤细胞的ifn
‑
β表达水平，结果如图3
‑
4所示。
[0049]
由图3～4可知，a6小分子(milciclib)能够特异性抑制isd刺激和cgamp刺激小鼠腹腔巨噬细胞ifn
‑
β表达水平。说明milciclib均能够通过sting特异性抑制cgas
‑
sting通路，上调肿瘤细胞表达ifn
‑
β。
[0050]
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。