一种超声辅助酶解制备单环刺螠内脏抗氧化肽的方法与流程

1.本发明属于单环刺螠深加工领域，具体涉及一种超声辅助酶解制备单环刺螠内脏抗氧化肽的方法。


背景技术：

2.单环刺螠（urechisunicinctus）又名“海肠”，属于螠虫动物门（echiurioidea）、螠纲（echiurida）、无管螠目（xenopneusta）、刺螠科（urechidae）。它是一种圆柱形或椭圆形的海洋无脊椎动物，主要居住在浅水区的沙底或泥地，通过滤食获得营养物质。由于其本身特有的形态，其洞穴呈现“u”形，从而有助于维持有氧条件，并且其在较大区间的水温、水中盐度、ph值和溶解氧条件下均能存活。它主要分布在日本、韩国和中国渤海、黄海地区，其味道独特、口感鲜滑，深受沿海地区人们的喜爱。单环刺螠富含多种改善人体健康的生物活性物质，如多肽、脂肪酸、氨基酸等。它的粗蛋白质约占总量的22.84%，且蛋白质是由氨基酸组成的，这些氨基酸可被物理过程分解为具有多种生物活性的多肽，具有调节机体代谢的功能。
3.抗氧化肽是生物活性肽的一类，特指具有抗氧化活性的肽。一般肽链长度较短，富含人体必需氨基酸，活性高，易被人体所吸收。抗氧化肽进入人体后，可阻止自由基的形成、清除自由基和活性氧。大量研究表明，机体内自由基或氧化应激引起的氧化损伤与衰老、阿尔茨海默症、帕金森病以及心血管疾病密切相关。因此，寻找潜在的天然抗氧化剂来源来取代合成产品已成为研究热点，特别是一些海洋食品加工副产物水解蛋白已成为制药、保健食品领域热门的话题。
4.研究表明单环刺螠多肽具有降血压、抗凝血、抗肿瘤、抗菌和其他功能。但是在抗氧化方面，目前仅有一些关于单环刺螠蛋白水解物对自由基清除率的研究，表明单环刺螠蛋白水解物具有潜在的抗氧化活性，但是却没有单环刺螠抗氧化肽的进一步探讨与研究。并且目前单环刺螠蛋白水解物的制备主要采用酶解法，且主要针对单环刺螠体壁肌进行酶解，对单环刺螠内脏无多肽提取研究。其内脏通常作为加工废弃物，不仅造成环境污染，还造成资源的浪费。研究发现，超声可通过空化机制改变蛋白质的物理和功能性质，使蛋白质的裂解位点增多，从而提高水解程度，进而增强水解物的活性。因此，开发出一种超声辅助酶解制备单环刺螠内脏抗氧化肽的方法不仅有效的解决单环刺螠内脏废弃物资源浪费的问题，而且也可以获得高效的抗氧化肽产物。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于克服传统单环刺螠多肽制备方法蛋白水解度低、产物活性低、反应时间长等缺点，提供一种超声辅助酶解方法制备单环刺螠内脏抗氧化肽，解决单环刺螠内脏废弃物资源浪费的问题；提高单环刺螠内脏抗氧化肽的产物活性，缩短了蛋白水解的反应时间。
6.本发明的单环刺螠内脏抗氧化肽具有改善h2o2诱导氧化损伤的作用。
7.为实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一方面，提供一种单环刺螠内脏抗氧化肽的制备方法，具体步骤如下：（1）将单环刺螠内脏脱脂、烘干、粉碎，过30~50目筛；优选地，将单环刺螠内脏脱脂、烘干、粉碎，过40目筛；（2）将单环刺螠内脏粉按料液比为1：25~1：30配制溶液，加1%~2%木瓜蛋白酶、2%~3%胰蛋白酶、1%~2%碱性蛋白酶，保持反应体系在ph为7~8，进行超声处理；优选地，将单环刺螠内脏粉按料液比为1：27配制溶液，加1%木瓜蛋白酶、2.4%胰蛋白酶、1.6%碱性蛋白酶，保持反应体系在ph为7.5，进行超声处理；（3）超声功率在700w以下，超声20~40 min，转入常规酶解，即酶解过程中保持ph为7~8、温度40~60℃下酶解1~2 h；优选地，超声功率为675w，超声30 min，转入常规酶解，即酶解过程中保持ph为7.5、温度50.5℃下酶解1.5 h；（4）酶解1~2 h后，在95℃下灭酶10~20min，7500 r/min离心10 min收集上清液；优选地，酶解1.5 h后，在95℃下灭酶15 min，7500 r/min离心10 min收集上清液；（5）在上清液中添加1%~3%颗粒状活性炭，在60℃下脱色除味2h以内，随后真空抽滤收集滤液。
8.优选地，在上清液中添加2%颗粒状活性炭，在60℃下脱色除味1hmin，随后真空抽滤收集滤液。
9.（6）将滤液真空冻干后获得冻干粉，将冻干粉配制成一定浓度的蛋白溶液，依次进行超滤和sephadex g
‑
25凝胶层析等步骤，收集层析滤液，进行真空冻干后得抗氧化肽冻干粉。其中超滤步骤是将蛋白溶液依次通过分子量为30 kda和10 kda的超滤膜，从而获得蛋白分子量< 10 kda的蛋白溶液。其中sephadex g
‑
25凝胶层析步骤是将冻干后的<10 kda组分配制成一定浓度上样，低温高速离心去除不溶性杂质，进样体积为5~10 ml，洗脱速度为0.2~0.6 ml/min，在280 nm紫外吸收波长测定吸光度，洗脱出2个峰，比较两溶液的dpph
·
清除率，获得较高活性的抗氧化肽冻干粉。
10.优选地，将滤液真空冻干后获得冻干粉，将冻干粉配制成1.5 mg/ml的蛋白溶液，依次进行超滤和sephadex g
‑
25凝胶层析等步骤，收集层析滤液，进行真空冻干后得抗氧化肽冻干粉。其中超滤步骤是将蛋白溶液依次通过分子量为30 kda和10 kda的超滤膜，从而获得蛋白分子量< 10 kda的蛋白溶液。其中sephadex g
‑
25凝胶层析步骤是将冻干后的<10 kda组分配制成2 mg/ml的浓度上样，低温高速离心去除不溶性杂质，进样体积为5 ml，洗脱速度为0.5 ml/min，在280 nm紫外吸收波长测定吸光度，洗脱出2个峰，比较两溶液的dpph
·
清除率，获得较高活性的抗氧化肽冻干粉。
11.（7）采用lc
‑
ms/ms鉴别上述抗氧化肽冻干粉中肽段的氨基酸序列，分离得到三种不同的单环刺螠内脏抗氧化肽，p1、p2和p3。
12.另一方面，比较单环刺螠内脏抗氧化肽改善h2o2诱导损伤的raw264.7细胞的能力。
13.首先探究多肽对raw264.7细胞有无细胞毒性，多肽p1、p2、p3在浓度0.01~2 mg/ml的范围内，raw264.7细胞活性都在90%以上，表明在0.01~2 mg/ml浓度下，p1、p2、p3对raw264.7细胞无毒副作用。
14.然后探究多肽对h2o2诱导损伤的raw264.7细胞有无改善作用，当多肽浓度为1 mg/
ml时，细胞活性均已达到75%以上。当多肽浓度为2 mg/ml时，p1、p2、p3都极大地改善了raw264.7细胞的氧化损伤，并且促进了细胞生长，表明单环刺螠内脏多肽p1、p2和p3都是抗氧化肽，且其抗氧化活性顺序为p1>p2>p3。
15.另一方面，从分子量、氨基酸组成、疏水性和二级结构上研究p1、p2、p3的组成和抗氧化活性。
16.采用lc
‑
ms/ms鉴定p1、p2、p3的氨基酸序列：其中p1的氨基酸序列如seqidno.1所示，具体为：vtsalvgpr；其中p2的氨基酸序列如seqidno.2所示，具体为：iglgdeglrr；其中p3的氨基酸序列如seqidno.3所示，具体为：tkirneisdlner。
17.从分子量、氨基酸组成、疏水性和二级结构上看，p1、p2和p3的抗氧化活性顺序为：p1>p2>p3。
18.另一方面，提供前述制备方法或前述抗氧化肽的制备方法在单环刺螠多肽提取中应用。
19.另一方面，如前述的抗氧化肽或前述制备方法制备的抗氧化肽在制备氧化损伤药物中的应用。
20.本发明的有益效果包括：1．本发明开发了一种超声辅助酶解方法制备单环刺螠多肽，该方法的蛋白水解度是常规酶解蛋白水解度的两倍多。
21.2．本发明解决了单环刺螠内脏废弃物资源浪费的问题，提高了单环刺螠的利用率。
22.3．本发明的方法获得的多肽具有抗氧化活性，对raw264.7细胞的增殖没有抑制作用，即无细胞毒性；且对raw264.7细胞具有改善h2o2诱导氧化损伤的作用。
23.4．本发明超声辅助酶解制备的单环刺螠抗氧化多肽共获得三种，分别为p1，p2和p3，根据实际结果与数据分析可知抗氧化活性顺序为p1>p2>p3。
24.5．通过分子量、氨基酸组成、疏水性和二级结构比较，本发明公开的p1与已公布的其他单环刺螠抗氧化肽相比，具有更高的抗氧化肽活性。
附图说明
25.图1为单环刺螠蛋白不同分子量水解物的浓度。
26.图2为sephadex g
‑
25 凝胶层析结果。
27.图3为单环刺螠内脏多肽对raw264.7细胞活性影响，沿箭头方向从左及右依次是p1，p2，p3。
28.图4为单环刺螠内脏多肽对氧化损伤raw264.7细胞活性影响，沿箭头方向从左及右依次是p1，p2，p3，vc。
29.图5为p1、p2、p3的疏水性分析。
30.图6为p1、p2和p3的二级结构分析结果。
31.图7为f4、f5的疏水性分析。
32.图8为f4和f5的二级结构分析结果。
具体实施方式
33.下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
34.实施例1超声辅助酶解方法对单环刺螠内脏多肽水解度的影响以水解度（dh）衡量整个反应的反应速率，水解度的测定参考gb 5009.235
‑
2016中的甲醛滴定法，首先计算氨基酸态氮，然后计算蛋白水解度，其计算公式分别为：氨基酸态氮计算公式如下：水解度计算公式如下：式（1）中：v1：naoh滴定体积（ml）v2：空白实验中naoh滴定体积（ml）c：naoh溶液浓度（mol/l）式（2）中：m：蛋白水解液中氨基酸态氮质量（g）m：样品总氮质量（g），m = 0.05
×
样品g （g）其中对照组常规酶解的步骤为：（1）将单环刺螠内脏脱脂烘干粉碎，过40目筛；（2）将单环刺螠内脏粉按料液比为1：27配制溶液，加1%木瓜蛋白酶、2.4%胰蛋白酶、1.6%碱性蛋白酶，保持反应体系在ph为7.5，进行常规酶解，即酶解过程中保持ph为7.5、温度50.5℃下酶解2h；（3）酶解2 h后，在95℃下灭酶15 min，7500 r/min离心10 min收集上清液；（4）在上清液中添加2%颗粒状活性炭，在60℃下脱色除味60 min，随后真空抽滤收集滤液；计算水解度（dh）。
35.其中实验组超声辅助酶解的步骤为：（1）将单环刺螠内脏脱脂烘干粉碎，过40目筛；（2）将单环刺螠内脏粉按料液比为1：27配制溶液，加1%木瓜蛋白酶、2.4%胰蛋白酶、1.6%碱性蛋白酶，保持反应体系在ph为7.5，进行超声处理；（3）在超声功率为675 w下，超声30 min，转入常规酶解，即酶解过程中保持ph为7.5、温度50.5℃下酶解1.5 h；（4）酶解2 h后，在95℃下灭酶15 min，7500 r/min离心10 min收集上清液；（5）在上清液中添加2%颗粒状活性炭，在60℃下脱色除味60 min，随后真空抽滤收集滤液；计算水解度（dh）。
36.表1 对照组和实验组酶解产物的水解度
protein hydrolysate
‑
4，uuph
‑
4）（<10 kda）。随后收集这4个组分进行冻干，配制成相同浓度的溶液进行抗氧化活性测定，筛选出活性最好的多肽组分，用于后续凝胶过滤层析。
39.如图1所示，经过超滤后，uuph
‑
2的浓度最高，为1.60 mg/ml，uuph
‑
4的浓度最低，为0.71 mg/ml。uuph
‑
1的浓度为 1.44 mg/ml，表明单环刺螠内脏蛋白水解物冻干粉的纯度为96%，而且uuph
‑
1作为未超滤组分，该组分浓度应该在uuph
‑
2和uuph
‑
4之间，与图1结果一致，表明超滤步骤基本准确。uuph
‑
4（mw<10 kda）的dpph
·
清除率为53.95%、
·
oh清除率为21.87%、
·
o2‑
清除率为51.0 %，表明uuph
‑
4（mw<10 kda）有最高的抗氧化活性，uuph
‑
3次之，uuph
‑
2相较最低。而uuph
‑
1的抗氧化活性要稍高于uuph
‑
2，这可能是由于其作为未超滤组分，uuph
‑
1中含有少量的uuph
‑
3和uuph
‑
4有关。实验结果表明组分的抗氧化活性与其多肽分子量呈负相关，即在一定分子量范围内，分子量越小，多肽的抗氧化活性越高，这与许多前人的研究结果一致。
40.sephadex g
‑
25凝胶过滤层析：取适量uuph
‑
4组分冻干粉用去离子水溶解，配置成2 mg/ml的样品溶液，低温高速离心去除不溶性杂质，上样，超纯水洗脱，以流速0.5 ml/min，5 min/管，在280 nm紫外吸收波长测定吸光度。测定各峰的dpph
·
清除率，选择清除率最高的组分冻干，以便进行下一步序列鉴定。
41.如图2所示，uuph
‑
4组分经sephadex g
‑
25凝胶柱层析洗脱出2个峰，记为单环刺螠蛋白水解物4
‑
1（urechisunicinctus protein hydrolysate
‑4‑
1，uuph
‑4‑
1），单环刺螠蛋白水解物4
‑
2（urechisunicinctus protein hydrolysate
‑4‑
2，uuph
‑4‑
2）。将uuph
‑4‑
1与uuph
‑4‑
2分别冻干后，配制成0.5 mg/ml的溶液，测定两溶液的dpph
·
清除率，结果表明uuph
‑4‑
1的dpph
·
清除率为58.5%，大于uuph
‑4‑
2的dpph
·
清除率，因此收集uuph
‑4‑
1组分，冻干以便进行下一步序列测定。
42.多肽的氨基酸序列鉴定：从凝胶柱的各组峰中选择抗氧化活性较高的组分，经脱盐后，采用lc
‑
ms/ms鉴定其氨基酸序列。电离是在离子源电压为1800 v的正离子模式下进行的，毛细管温度为360℃。一级质谱参数：扫描范围为350
‑
20000 da，扫描分辨率为70000；二级质谱参数：扫描范围依赖于一级母离子质荷比自动选择，扫描分辨率为17500。最后进行数据库检索，即原始文件用mascot 2.2软件中的de nava算法分析。
43.表2 肽的保留时间、氨基酸序列和分子量采用lc
‑
ms/ms分析uuph
‑4‑
1中肽段的氨基酸序列，结果表明uuph
‑4‑
1中共含有3条肽。并采用mascot 2.2软件中的de nava算法分析，得到3条肽的氨基酸序列。3条肽的出峰时间、氨基酸序列以及分子量，如表2所示。不难得出，uuph
‑4‑
1的高抗氧化活性一定与3条多肽有关，即p1、p2和p3中至少有1条抗氧化肽。
44.实施例3单环刺螠内脏多肽改善h2o2诱导损伤的raw264.7细胞
以raw264.7细胞活性衡量单环刺螠内脏多肽的作用，细胞活性的测定参考cck
‑
8法。首先探究多肽对raw264.7细胞有无细胞毒性，然后探究多肽对h2o2诱导损伤的raw264.7细胞有无改善作用。
45.单环刺螠内脏多肽对raw264.7细胞毒性测定：在96孔细胞培养板上接种raw264.7细胞，密度为1.0
×
104个/孔，在二氧化碳培养箱中培养24 h后，移除生长培养基，随后分别加入抗氧化肽浓度为0，0.01、0.05、0.1、0.5、1、2 mg/ml的dmem生长培养基。每组设置6个复孔，在二氧化碳培养箱中培养12 h后，用cck
‑
8法测定细胞存活率。
46.由图3可知，多肽p1、p2、p3在浓度0.01~2 mg/ml的范围内，raw264.7细胞活性都在90%以上，表明在0.01~2 mg/ml浓度下，p1、p2、p3对raw264.7细胞无毒性作用。
47.单环刺螠内脏多肽对h2o2诱导损伤的raw264.7细胞的改善作用：实验分为4组：空白组、损伤组、保护组和阳性对照组。在96孔细胞培养板上接种rw264.7细胞，密度为1.0
×
104个/孔，在二氧化碳培养箱中培养24 h后，移除生长培养基。保护组加入190 μl终浓度为0.1、0.5、1、2mg/ml的不同多肽培养液与抗坏血酸培养液（每组6个复孔），空白组和损伤组加入190 μl的细胞培养液继续培养24 h。然后保护组和损伤组加入h2o2终浓度为500 μmol/l的10 μl细胞培养液，空白组加入10 μl细胞培养液继续培养24 h后，用cck
‑
8法测定细胞存活率。
48.由图4可知，当h2o2浓度为500 μmol/l时，且溶液中无p1、p2、p3和vc时，细胞活性下降至54.52%。随着多肽与vc浓度的增大，细胞活性也随之增加。由图可知，当多肽浓度为1 mg/ml时，细胞活性均已达到75%以上。当多肽浓度为2 mg/ml时，p1、p2、p3和vc保护组的细胞活性分别为174.6%、172.5%、134.5%和180.2%，都极大地改善了raw264.7细胞的氧化损伤，并且促进了细胞生长，由此可得单环刺螠内脏多肽p1、p2和p3都是抗氧化肽，且其抗氧化活性顺序为p1>p2>p3。
49.实施例4单环刺螠内脏多肽的高抗氧化活性以分子量、氨基酸组成、疏水性和二级结构评估单环刺螠内脏多肽的抗氧化活性作用，所用软件为dnaman。首先探究本发明的单环刺螠内脏多肽的抗氧化活性，然后探究已公布单环刺螠抗氧化肽的抗氧化活性，从而评价本发明的单环刺螠内脏多肽。
50.单环刺螠内脏多肽的序列分析结果：如表2所示，p1、p2和p3的分子量都在3 kda以下，且p1的分子量最低，为898.5 da，p3的分子量最高，为1586.8 da，因此从分子量上可预测出：p1的抗氧化活性最高，p3最低。在氨基酸组成方面上，研究表明抗氧化肽一般都含有以下5种氨基酸pro、gly、ala、val和leu。这5种氨基酸占比总和越高，抗氧化活性越高。从表3可知，p1中这5种氨基酸的占比总和为62.11%，其次是p2，为39.53%，最后是p3，为7.27%。由此预测p1的抗氧化活性最高，p3最低。疏水性也是影响多肽抗氧化活性的重要因素。有研究表明疏水性的氨基酸残基可促进抗氧化肽与脂溶性自由基的相互作用，减轻脂质过氧化作用。同时，疏水性氨基酸残基位于c端或n端更有利于提高多肽的抗氧化活性。如图5所示，反映的是p1、p2和p3的疏水性分析。位于y=0直线上方代表疏水性，位于下方代表亲水性，上方的面积越大，代表多肽的疏水性越高。由图5可知，p1的疏水性最大，且疏水性氨基酸残基主要位于n端，p3的疏水性最低，无任何疏水性氨基酸残基，因此从疏水性方面推测，p1的抗氧化活性最高，p3最低。肽的二级
结构也是影响肽有无活性的重要因素。研究表明抗氧化肽的二级结构中β
‑
折叠结构和无规则卷曲结构均较多，α
‑
螺旋结构较少，这可能是由于β
‑
折叠结构和无规则卷曲结构可以使肽暴露更多的活性位点，从而与一些自由基或过渡金属离子反应。同时，β
‑
折叠也可以增加抗氧化肽结构的稳定性，使肽不容易受环境影响。由图6可知，p1的β
‑
折叠和无规则卷曲结构占比最多，α
‑
螺旋结构占比最少，其次是p3，最后是p2。因此从二级结构看，p1的抗氧化活性最高，p2最低。最后，从分子量、氨基酸组成、疏水性和二级结构上看，p1、p2和p3的抗氧化活性顺序为：p1>p2>p3。
51.表3 p1、p2和p3的氨基酸组成占比已公布单环刺螠抗氧化肽的序列分析结果：目前，已公布的单环刺螠抗氧化肽为f4：wpgka和f5：gltkp。如表4所示，f4和f5的分子量都在600 da以下，且f5的分子量最低，为514.5 da，f4的分子量为557.5 da，因此从分子量上可预测出：f5的抗氧化活性更高。在氨基酸组成方面上，f4中这5种氨基酸的占比总和为44.35%，f5为54.77%，由此预测f5的抗氧化活性更高。由图7可知，f4和f5均无疏水性残基，因此很难从疏水性方面推测两者的抗氧化活性高低。由图8可知，f4和f5的无规则卷曲结构占比最多，β
‑
折叠占比最少。从二级结构看，f4和f5差别不大。最后，从分子量、氨基酸组成、疏水性和二级结构上看，f4和f5的抗氧化活性顺序为：f5>f4。
52.表4f4和f5的氨基酸组成占比本发明的单环刺螠内脏多肽p1与已公布的单环刺螠多肽f5活性比较结果：在分子量上，p1的分子量为898.5 da，f5的分子量为514.5 da，推测f5的抗氧化活性高于p1，但是在氨基酸组成、疏水性分析和二级结构方面，p1的抗氧化活性是高于f5的，如p1中5种氨基酸的占比总和为62.11%，p1的n端具有疏水性残基，p1中的β
‑
折叠和无规则卷曲占比之和较高等。因此，依据抗氧化肽的构效关系分析，本发明的单环刺螠内脏多肽p1的抗氧化活性是大于已公布的单环刺螠多肽f5的。
53.上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此领域技术的人士能够了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。