一种增效且抵抗耗竭的嵌合抗原受体T细胞及其在制备治疗肿瘤药物中的用途的制作方法

persist and induce sustainedremissions in relapsed refractory chronic lymphocytic leukemia.sci transl med,2015,7(303): 303ra139.maude sl,et al.managing cytokine release syndrome associated with novel tcell-engaging therapies.cancer j,2014,20(2):119-122.sadelain m.chimeric antigen receptors: a paradigm shift in immunotherapy.annu rev canc biol,2017,1:447-466.)。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一在于提供一种新型增效且抵抗耗竭的嵌合抗原受体(car)，表达该嵌合抗原受体的t细胞，能够使得该嵌合抗原受体在t细胞中更加高效、稳定表达，以更好地发挥对靶细胞的杀伤作用，提高car-t的持久性，耗竭标志物表达更低，具备更丰富的记忆型t细胞。
6.本发明的目的之二在于提供本发明所述的嵌合抗原受体t细胞在制备治疗肿瘤药物中的用途。
7.本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
8.本发明提供一种嵌合抗原受体，其包括：抗原结合结构域(scfv)和信号传导结构域；其中信号传导结构域包括第一传导结构域和第二传导结构域，第一传导结构域和第二传导结构域之间串联抗原结合结构域；所述第一传导结构域包括受体信号结构域和/或共刺激结构域；第二传导结构域包括跨膜结构域，所述跨膜结构域连接或不连接共刺激结构域和 /或基本信号域。
9.在一些实施例中，本发明所述的第二传导结构域通过串联信号传导结构域与抗原结合结构域(scfv)连接。
10.本发明所述的嵌合抗原受体，在抗原结合结构域特异性结合抗原后变成能够传递激活信号的多链形式，将激活信号传输到表达其的免疫细胞，实现免疫治疗的作用。
11.为了提高本发明所述嵌合抗原受体的安全性和疗效，能介导更强的肿瘤杀伤能力，持续性更好，耗竭标志物表达更低，能够分化更多的记忆型t细胞，本发明还提供一些优选的传导结构域。
12.在一些优选的实施例中，本发明所述的第一传导结构域中无共刺激结构域；即优选的第一传导结构域仅包括受体信号结构域。
13.在一些优选的实施例中，本发明所述的第一传导结构域仅包括受体信号结构域；第二传导结构域包括跨膜结构域，所述跨膜结构域连接共刺激结构域；或者第二传导结构域包括依次连接的跨膜结构域、共刺激结构域和基本信号域。
14.在一些实施例中，本发明所述的跨膜结构域选自dap12、dap10、cd3ζ、fcεrγ中的任意一种；优选的为dap12。
15.在一些实施例中，本发明所述的受体信号结构域选自kirs2、kir2ds2、kir2dl3、 kir2dl1、kir2dl2、kir2dl4、kir2dl5a、kir2dl5b、kir2ds1、kir2ds3、kir2ds4、 kir2ds5、kir3dl1、kir3ds1、kir3dl2、kir3dl3、kir2dp1、kir3dp1、nkp46、 nkp30、nkp44、slam、cd48、cd229、2b4、cd84、ntb-a、cracc、blame、、 cd2f-10、klrd1/klrc2、sirpb1、pilrb、clec5a、trem1、trem2、cd300b、 cd300e、siglec-14、siglec-15、siglec-16或nkg2d中的一种；优选为nkp44或 trem1或kirs2；更优选的为kirs2。
16.在一些实施例中，本发明所述的抗原结合域结合的抗原与恶性肿瘤有关，可以根据不同的肿瘤目标进行本领域常规选择，例如所述肿瘤抗原可以选自cd19、cd20、cd22、 cd30、cd33、cd38、cd123、cd138、cea、ctla4、bcma、cs1、c-met、epcam、 egfr/egfrviii、gp100、gpc3、gd-2、igf1r、igf-i receptor、mage a3、mesothelin、 muc1、ny-eso-1、her2、pd1、psma、ror1、wt1、糖脂f77或其他任意肿瘤抗原或其他修饰类型和其任何组合。
17.在一些实施例中，本发明所述的共刺激结构域选自cd27、cd28、4-1bb、ox40、 cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、 nkg2c、b7-h3中的任意一种；优选的为4-1bb。
18.在一些实施例中，本发明所述的基本信号域为cd3ζ。
19.在一些实施例中，本发明所述的串联信号传导结构域为f2a、e2a、t2a、p2a中的一种或多种，优选为t2a。
20.本发明还提供一种带有所述嵌合抗原受体的重组表达载体。
21.在一种实施例中，本发明所述的重组表达载体，包括顺序连接的第二传导结构域、串联信号传导结构域、抗原结合结构域、第一传导结构域。
22.本发明还提供一种带有所述嵌合抗原受体的免疫细胞。
23.本发明所述的嵌合抗原受体免疫细胞；在一些实施例中，所述的细胞选自t淋巴细胞、nk细胞、nkt细胞、巨噬细胞、间充质干细胞、造血干细胞、多能干细胞或胚胎干细胞培养分化的免疫细胞。
24.本发明还提供本发明所述的嵌合抗原受体、重组表达载体或免疫细胞在制备治疗肿瘤药物中的用途。
25.本发明所述的肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，包括但不限于脑癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、肝癌、肾脏癌、淋巴瘤、白血病、肺癌、黑色素瘤、转移性黑色素瘤、间皮瘤、神经母细胞瘤、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、皮肤癌、胸腺瘤、肉瘤、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、子宫癌等以及其它未列肿瘤或者他们的任何组合。
26.本发明所述的上述结构域为现有已知结构域，其核苷酸序列和氨基酸序列均可通过现有技术查询获得。例如：
27.本发明所述的跨膜结构域dap12广泛存在于自自然杀伤细胞、粒细胞、单核/巨噬细胞表面，用于传递活化信号，其核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示。或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。
28.本发明所述的串联信号传导结构域t2a，其核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seq id no.4所示。或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。
29.本发明所述的共刺激结构域4-1bb是一个激活性共刺激分子，在免疫系统的多种细胞上表达，其核苷酸序列如seq id no.5所示，氨基酸序列如seq id no.6所示。或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。
30.本发明所述的受体信号结构域nkp44基因全长的核苷酸序列见ncbi，genbank: aj225109.1，氨基酸序列见ncbi，genbank:cab39168.1；trem1基因全长的核苷酸序列见ncbi，accession：nm_004829.6，氨基酸序列见ncbi，accession：np_004820； kirs2基因全长的核苷酸序列见ncbi，accession：nm_147130.2，氨基酸序列见ncbi， accession：np_
667341.1。
31.其他本发明所述的部分结构域可以入表1所示，或与其氨基酸序列具有85％-99％同一性的多肽。
32.【表1】
33.34.35.[0036][0037]
本发明的有益效果：
[0038]
(1)本发明所涉及的car结构通过体外功能实验证实其对肿瘤的杀伤效果更强；
[0039]
(2)本发明所涉及的car结构受到抗原刺激时分泌更高的细胞因子水平，能够很好抗肿瘤的效果；
[0040]
(3)本发明所涉及的car结构通过体内功能实验证实其抗肿瘤效果更强；
[0041]
(4)本发明所述的信号传导结构域，当用跨膜受体dap12结合4-1bb结构域组成 car的信号传导结构域，而受体信号域不连接共刺激结构域时，当car特异性地结合了靶标中的配体，可以诱导免疫细胞的活化，产生更稳定且更强的免疫应答。
[0042]
(5)本发明所涉及的car结构能实现更低的耗竭标志物表达水平。
[0043]
(6)本发明所涉及的car结构具备更多的记忆型t细胞，如tscm，tcm等。
附图说明
[0044]
图1是含有不同信号域结构的慢病毒载体；
[0045]
图2是含有不同信号域结构的示意图；
[0046]
图3是kt4 car-t细胞感染慢病毒7天后通过流式细胞仪检测t细胞表面识别cd19 抗原的car结构的表达阳性率；
[0047]
图4是ntd/car-t细胞对抗原阳性肿瘤细胞株杀伤作用图；
[0048]
图5是ntd/car-t细胞在抗原阳性刺激下ifn-γ的分泌情况；
[0049]
图6是ntd/car-t细胞在抗原阳性刺激下il-2的分泌情况；
[0050]
图7是car-t细胞在小鼠体内抗肿瘤作用图。
具体实施方式
[0051]
下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著) 中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
[0052]
实施例1、含有dap12-4-1bb-t2a-cd19(scfv)-kirs2这5个元件的car慢病毒的构建
[0053]
为证明含有dap12-4-1bb-kirs2胞内信号域的car-t细胞较以往已报道的含有4-1bb-cd3ζ、dap12-kirs2、dap12-4-1bb-cd3ζ-kirs2-4-1bb、 dap12-41bb-kirs2-4-1bb、dap12-kirs2-4-1bb和dap12-cd3ζ-kirs2-4-1bb刺激信号的car-t细胞更具有优势，因此需要分别构建含有不同刺激信号组合的病毒载体。本实施例中以靶向b细胞恶性肿瘤(cd19)的单链抗体为统一的胞外识别抗原的结构，分别需要构建如下8个嵌合抗原受体(图1和图2)：
[0054]
cd19(scfv)-cd8α-4-1bb-cd3ζ
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(kt1)
[0055]
dap12-t2a-cd19(scfv)-kirs2
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(kt2)
[0056]
dap12-4-1bb-cd3ζ-t2a-cd19(scfv)-kirs2
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(kt3)
[0057]
dap12-4-1bb-t2a-cd19(scfv)-kirs2
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(kt4)
[0058]
dap12-4-1bb-cd3ζ-t2a-cd19(scfv)-kirs2-4-1bb
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(kt5)
[0059]
dap12-41bb-t2a-cd19(scfv)-kirs2-4-1bb
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(kt6)
[0060]
dap12-t2a-cd19(scfv)-kirs2-4-1bb
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(kt7)
[0061]
dap12-cd3ζ-t2a-cd19(scfv)-kirs2-4-1bb
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(kt8)
[0062]
1、合成含有不同胞内刺激信号的靶向b细胞恶性肿瘤的嵌合抗原受体的基因序列
[0063]
合成依次含有自然杀伤激活受体(简称dap12)、t2a、激活性共刺激分子4-1bb、抗b细胞恶性肿瘤的单链抗体scfv(简称cd19(scfv)，杀伤细胞免疫球蛋白样受体(简称kirs2)，其结构如图1所示。其中dap12的核苷酸序列如seq id no.1所示，氨基酸序列如seq id no.2所示，t2a的核苷酸序列如seq id no.3所示，氨基酸序列如seqid no.4所示，4-1bb其核苷酸序列如seq id no.5所示，氨基酸序列如seq id no.6 所示，抗b细胞恶性肿瘤的单链抗体(cd19)scfv的核苷酸序列如seq id no.7所示，氨基酸序列如seq id no.8所示。kirs2的核苷酸和氨基酸序列见专利(用于过继免疫疗法的具有嵌合受体的靶向细胞毒性细胞，公开号：cn107580628a)，cd8α-4-1bb-cd3ζ的核苷酸序列和氨基酸序列见专利(methods for treatment of cancer,us 20130309258)； cd3ζ氨基酸序列seq id no.9。
[0064]
2、构建表达嵌合抗原受体的慢病毒载体
[0065]
pelns t2a-cd19-kirs2由南京卡提医学科技有限公司保存，或者根据文献(enxiuwang et al.generation of potent t-cell immunotherapy for cancer using dap12-based, multichain,chimeric immunoreceptors.2015,cancer immunology research,3(7):815)公开的方法进行构建。以下以kt4为例说明嵌合抗原受体的慢病毒载体构建的方法， dap12-41bb基因合成由生工生物工程(上海)有限公司合成并提供puc57-dap12-41bb 质粒，将质粒pelns t2a-cd19-kirs2和puc57-dap12-41bb通过sma i、bamh i-hf 双酶切(购自neb公司)，酶切反应按说明书进行，获得pelns t2a-cd19-kirs2片段约9000bp，
dap12-41bb片段约500bp的dna片段，然后用琼脂糖凝胶回收试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)进行dna片段回收，具体方法见说明书，回收获得的pelnst2a-cd19-kirs2和dap12-41bb，然后将目的片段dap12-41bb和载体片段pelnst2a-cd19-kirs2通过t4连接酶(购自takara公司)进行连接，获得表达嵌合抗原受体的慢病毒载体，命名为pelns dap12-41bb-t2a-cd19-kirs2(简称kt4)。将1μl慢病毒载体kt4转化大肠杆菌top10感受态细胞中(购自南京安杰优生物科技有限公司)， 37℃培养15h后挑取单克隆，挑取的单克隆在37℃条件下培养14h后用质粒抽提试剂盒 (购自takara公司)抽提质粒，具体方法见说明书。
[0066]
按照上述方法分别构建pelns cd19-cd8α-41bb-cd3ζ(简称kt1)；dap12-t2a
-ꢀ
cd19-kirs2(简称kt2)；dap12-41bb-cd3ζ-t2a-cd19-kirs2(简称kt3)； dap12-41bb-t2a-cd19-kirs2(简称kt4)；pelns dap12-41bb-cd3ζ-t2a
-ꢀ
cd19-kirs2-41bb(简称kt5)；pelns dap12-41bb-t2a-cd19-kirs2-41bb(简称 kt6)；pelns dap12-t2a-cd19-kirs2-41bb(简称kt7)；pelns dap12-cd3ζ-t2a
-ꢀ
cd19-kirs2-41bb(简称kt8)慢病毒载体。
[0067]
3、慢病毒包装
[0068]
本实施包装慢病毒采用磷酸钙转染法，本方法使用的试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，具体步骤如下：
[0069]
(1)293t细胞隔天传代
[0070]
每个t150细胞瓶种植5
×
106个细胞。48小时后，细胞数目应该达到20-25百万/瓶。
[0071]
(2)293t细胞铺瓶
[0072]
a)以1个t150细胞培养瓶为例，用约15ml的1
×
pbs轻柔地洗细胞两次；
[0073]
b)加入3ml 0.25％胰酶-2.21mm edta；
[0074]
c)等到细胞脱落，加入12ml 10％(wt)fbs(购自gibico)的dmem培养基(购自corning)至已经脱落的细胞中；
[0075]
d)收集并将细胞转移至无菌离心管，1000rpm,离心10分钟；
[0076]
e)吸掉上清，将沉淀重悬于10ml 10％(wt)fbs的dmem培养液中；
[0077]
f)细胞计数，根据细胞浓度计算12
×
106个细胞所需要的体积；
[0078]
g)将细胞和25ml的10％(wt)fbs的dmem培养液合并，放入t150细胞瓶中，轻摇，使得细胞均匀分布到细胞瓶底37℃，5％co2培养箱中培养过夜。
[0079]
(3)细胞转染
[0080]
观察细胞，细胞密度大约达到80％-90％，此时就可以开始转染。
[0081]
a)在转染前30-60分钟，轻柔吸掉培养液；
[0082]
b)混合质粒dna和氯化钙溶液，以一个t150瓶为例，需要28ug prsv.rev(购自 invitrogen公司)，28ug pgag-pol(购自invitrogen公司)，11ug pvsvg(购自invitrogen 公司)，23ug重组慢病毒表达质粒kt1-kt8，加入到1.5ml氯化钙溶液中，混匀；
[0083]
c)将1.5ml bbs溶液加入到15ml无菌离心管中，用1ml枪头把dna-氯化钙溶液混匀后滴加到bbs溶液中，迅速混匀15-20下，室温孵育25-30分钟；
[0084]
d)用5ml移液管把dna-氯化钙-bbs混合物均匀逐滴加到t150瓶中。在含5％二氧化碳的37℃细胞培养箱内培养，6h换液；
[0085]
e)6h后换液。轻轻晃动培养板数次以充分悬浮一些磷酸钙沉淀，吸去含磷酸钙沉淀的培养液，加入20ml新鲜的5％(wt)fbs的dmem培养液，继续培养。
[0086]
(4)初次收集病毒上清
[0087]
a)将前一天转染的293t细胞培养上清收集到离心管，1000rpm离心5分钟，标记，暂存于4℃冰箱；
[0088]
b)将事先预热的20ml 5％(wt)fbs的dmem培养基加入细胞瓶中，37℃细胞培养箱继续培养过夜。
[0089]
(5)第二次收集病毒上清液(48h/第四天)。
[0090]
(6)过滤上清
[0091]
将两次收集的上清液集中在一起，用0.45μm的滤膜过滤去除细胞碎片。
[0092]
(7)病毒浓缩
[0093]
4℃，12000rpm离心过夜。
[0094]
(8)病毒储存
[0095]
离心后，倾倒全部上清，加入新鲜5％(wt)fbs的dmem培养基重悬，进行病毒分装，迅速存放于-80℃冰箱备用。
[0096]
(9)慢病毒滴度测定
[0097]
a)病毒感染293t细胞
[0098]
感染前将293t细胞铺至24孔板中，取已纯化浓缩病毒200μl加到293t细胞中， 24h后用含10％fbs(wt)的dmem培养基换液，感染72h后于1500rpm条件下离心5min 以收集细胞，抽提基因组。
[0099]
b)抽提基因组
[0100]
基因组抽提试剂盒为购自于takara公司，按试剂盒说明书操作。
[0101]
c)qpcr测定病毒滴度
[0102]
反应体系如下：probe qpcr mix 12.5μl(购自takara)，上游引物0.5μl(由生工生物工程(上海)有限公司合成)，下游引物0.5μl(由生工生物工程(上海)有限公司瑞合成)，探针1μl(由生工生物工程(上海)有限公司合成)，模板2μl，灭菌水8.5μl，反应体系为25μl，反应条件按照说明书设置，反应结束后，用分析软件分析数据，根据标准曲线计算病毒滴度。计算结果显示，病毒滴度为1
×
107tu/ml。
[0103]
实施例2、病毒感染t细胞
[0104]
1、t细胞的分离活化及病毒感染
[0105]
(1)人外周血单核细胞的分离
[0106]
用含有抗凝剂的采血管采集外周血约10ml，3000rpm离心30min，收集上层血浆，将收集的上层血浆于5000rpm条件下离心10min。按体积比1:1加到淋巴细胞分离液(购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)上，梯度离心，3000rpm，离心30min，离心后，离心管由上之下分层：第一层为血浆层；第二层为淋巴细胞白膜层；第三层为透明分离液层；第四层红细胞层。吸取淋巴细胞白膜层，并用生理盐水洗涤2次，两次离心以1500rpm，离心10min，pbs重悬细胞，加入5％自体血浆 300iu/ml重组人il-2 kbm581完全培养基培养人外周血单核细胞。
[0107]
(2)慢病毒感染t淋巴细胞
[0108]
用含5％自体血浆 300iu/ml重组人il-2 kbm581完全培养基培养新制备的单个核细胞pbmc，il-2购自r&d systems，kbm581购自corning，第0天加入cd3/cd28 dynabeads免
疫磁珠(购自invitrogen)活化t细胞，前3天进行慢病毒感染，按moi＝1 分别加入kt1、kt2、kt3、kt4、kt5、kt6、kt7、kt8对应的慢病毒载体，未感染的t淋巴细胞作为空白对照，48h后将培养基更换为含有5％自体血浆 300iu/ml重组人 il-2 kbm581完全培养基，继续培养7-9天。
[0109]
2、t细胞中car阳性率的检测
[0110]
将培养至第7天的已感染病毒的t细胞，1200rpm，离心5min，弃尽上清以收集细胞，用含有体积分数1％fbs的pbs溶液重悬细胞，并将细胞调整密度为1
×
105个/ml，加入生物素标记的cd19蛋白(bioswan公司)，再加入streptavidin-pe(bd biosciences 公司)，4℃孵育30min，pbs溶液洗涤2次，上流式细胞仪进行检测，结果显示经过7天的培养，car-t细胞car的阳性率：kt1病毒感染组阳性率41％，kt 2病毒感染组阳性率52％，kt 3病毒感染组阳性率59％，kt 4病毒感染组阳性率65％(图3)，kt 5 病毒感染组阳性率49％，kt 6病毒感染组阳性率59％，kt 7病毒感染组阳性率59％， kt 8病毒感染组阳性率59％，可见本发明所述的病毒感染具有较好的表达。
[0111]
实施例3、病毒感染car-t细胞体外杀伤效果评估
[0112]
(1)分别培养靶细胞mcf7-cd19细胞(cd19阳性细胞株)、293t(cd19阴性细胞株)和效应细胞kt1、kt2、kt3、kt4、kt5、kt6、kt7、kt8共8组car-t细胞；
[0113]
(2)收集靶细胞和效应细胞，1500rpm，离心5min，弃上清；
[0114]
(3)用10％fbs 1640完全培养基重悬靶细胞和效应细胞；
[0115]
(4)利用实时细胞分析系统(rtca)，在e-plate16的孔中加入50μl 1640培养基
[0116]
(5)利用rtca检测基线，确定所选孔接触正常；
[0117]
(6)设置效靶比为0:1、1:1、5:1、10:1；
[0118]
(7)取出e-plate16，按照效靶比，在每孔中加入混合均匀的靶细胞悬液50μl，使每孔种细胞数目为104cells/50μl；
[0119]
(8)将e-plate16置于培养箱中，以37℃，5％co2条件下，培养过夜；
[0120]
(9)第二天，将e-plate16取出，加入50μl相应的效应细胞，计算加入效应细胞8h 后的杀伤率；
[0121]
(10)
[0122]
kt3和kt4组的car-t对cd19抗原阳性肿瘤细胞杀伤作用优于kt1和kt2组， kt1和kt2组的car-t对cd19抗原阳性肿瘤细胞杀伤作用优于kt5和kt6组，kt5 和kt6组的car-t对cd19抗原阳性肿瘤细胞杀伤作用优于kt7和kt8组，kt3和kt4 组的car-t对cd19抗原阳性肿瘤细胞杀伤作用特别是明显高于kt7和kt8组。图4 结果显示，体外杀伤实验结果表明kt3和kt4组的结构组合在提高car安全性的基础上具备很强的抗肿瘤活性，该car信号区设计有利于临床应用。
[0123]
实施例4、检测病毒感染car-t细胞的细胞因子分泌
[0124]
(1)细胞因子检测采用r&d公司elisa试剂盒进行。
[0125]
(2)标准品的稀释：准备1ml离心管7支，依次编号号码，先在各离心管中加入标准品稀释液500μl，然后取原浓度标准品500μl加入到1只已编好号的离心管中，充分混匀，再在该离心管中取500μl加入第二支离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μl 加入第三
只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μl加入第四只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μl加入第五只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μl 加入第六只离心管中，充分混匀；再在该离心管中取500μl加入第七只离心管中，充分混匀。
[0126]
(3)在酶标包被板上设标准品孔，依次加入不同浓度的标准品100μl，每个浓度2-3 个平行孔。
[0127]
(4)加样：分别设置空白孔(空白对照孔用水代替，酶标试剂及生物素标记的抗体操作照旧)、待测样品孔，在酶标包被板上待测样品孔中先加样品100μl，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
[0128]
(5)孵育：室温放置孵育2h。
[0129]
(6)洗涤：弃去液体，用吸水纸吸干孔里的液体，每孔加200μl洗涤液，静止30s 后弃去，用吸水纸吸干孔里的液体，如此重复3次。
[0130]
(7)加抗体：酶标包被板上加入100μl检测抗体。
[0131]
(8)孵育：同操作(5)。
[0132]
(9)洗涤：同操作(6)。
[0133]
(10)加标记：每孔加入100μl辣根过氧化物酶标记链霉亲和素。
[0134]
(11)孵育：避光室温放置孵育20min。
[0135]
(12)洗涤：同操作(6)。
[0136]
(13)显色：每孔加入显色液100μl，轻轻震荡混匀，避光室温放置孵育20min。
[0137]
(14)终止：每孔加入终止液50μl，终止反应。
[0138]
(15)测定：以空白值校零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(od值)，应在加入终止液后15min内进行测定。
[0139]
选择抗原表达的靶细胞与kt4 car-t共培养，检测kt4 car-t受到抗原刺激产生响应作用分泌il-2和ifn-γ水平，靶细胞选择raji(cd19阳性细胞株)，293t(cd19 阴性细胞株)，以此来显示出kt4 car-t在受到cd19抗原刺激时所特异性分泌出il-2 和ifn-γ，结果显示kt4 car-t在cd19阳性靶细胞raji共培养时显著分泌ifn-γ和il-2 (图5和图6)，表明kt4 car对于抗原阳性的肿瘤细胞具有响应作用。
[0140]
另一方面，比较kt1、kt2、kt3、kt4、kt5、kt6、kt7、kt8 car-t与阳性靶细胞raji共培养时，各组分泌il-2和ifn-γ细胞因子水平。结果如图5所示，kt3和kt4 car-t分泌水平较其他各组car-t有显著提升，由于kt7和kt8 car-t抗肿瘤效果很弱，故分泌细胞因子量极低。
[0141]
实施例5、car-t细胞在小鼠体内抗肿瘤的效果
[0142]
nalm6细胞在5％co2，37℃的培养箱中培养，培养基为含10％fbs的dmem高糖培养基。ngg小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司，4周龄，体重(17
±
2)g，雌性。 2.5
×
106/ml的nalm6细胞悬液,按0.2ml/鼠的量，通过皮下接种于小鼠右侧，小鼠培养20d成瘤。2.5
×
107/ml的car-t细胞悬液,按0.2ml/鼠的量，通过静脉注射的方式给药，隔3-5d测量小鼠的肿瘤体积的大小。
[0143]
静脉注射pbs(对照组)和kt1、kt2、kt3、kt4、kt5、kt6、kt7、kt8共8 组car-t，观察小鼠体内肿瘤体积的变化，结果显示：对照组的小鼠在地16d时出现小鼠死亡的现象，而实验组kt3和kt4组在第16d时出现肿瘤消失的现象，与其余几组相比，kt3和kt4组小鼠体内肿
瘤消失的时间最早，其次是kt1和kt2，再次kt5和kt6 (图7)。在小鼠体内，8组不同结构的car-t对阳性抗原的肿瘤有不同程度的抗肿瘤的效果。
[0144]
实施例6、car-t细胞表面耗竭标志物表达水平
[0145]
为了评估kt1-kt8受到抗原刺激对耗竭标志物的影响，在car-t培养12天后，选择cd19抗原阳性靶细胞293t-cd19与car-t按1:1效靶比共培养，共培养1天后检测 car-t细胞表面耗竭标志物pd-1，lag-3，tim-3表达情况(表1)。体外证实pd-1在 kt4中的表达最低，这表明kt4对pd-l1介导的抑制作用可能较低。同样地，lag3和 tim3在kt4中的表达最低，结果表明，8组不同结构的car-t细胞表面产生的耗竭标志物水平随着结构的不同而具有差异性。
[0146]
表1 car-t细胞表面耗竭标志物表达情况
[0147] kt1kt2kt3kt4kt5kt6kt7kt8pd1(％)28.126.716.38.533.736.448.944.6lag3(％)30.230.822.910.625.329.733.321.4tim3(％)25.314.620.84.721.425.335.434.9
[0148]
实施例7、car-t细胞t细胞分化亚型情况
[0149]
为了评估kt1-kt8制备第10天时t细胞分化亚型情况，通过cd3-apc-cy7， cd4-apc，ccr7-fitc，cd45ra-percp-cy5.5，cd45ro-amcyan检测tn、tscm、tcm、 tem、temra各细胞群比例情况(表2)。8组不同结构的car-t细胞分化亚型差异性较大。其中代表早期记忆型的亚型有tscm、tn及tcm。结果表明，kt3和kt4记忆型细胞占比较多，其中kt3以cd8 细胞为主，而kt4主要是cd4 细胞。
[0150]
表2 t细胞分化亚型情况
[0151][0152][0153]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通
过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权力要求书所限定的范围。