一种适于制备高效价感受态细胞的缓冲液及其应用的制作方法

1.本发明涉及一种缓冲液及其应用，尤其涉及一种适于制备高效价感受态细胞的缓冲液及其应用，属于分子生物学技术领域。


背景技术：

2.dna克隆是克隆中常用的技术，对分子生物学的发展具有里程碑的意义。大肠杆菌是dna克隆的常见宿主，为了提高克隆效率目前已经开发了各种制备用于转化的感受态细胞方法以寻求高转化效率。dna转化常用的两种方法为化学转化和电转化。在化学转化中，感受态制备通常是利用含有ca
2
的缓冲液孵育细菌，从而在细菌膜上制造孔隙，使细胞膜通透性变大进而促进dna与膜的结合，42℃的热激可以协助细胞建立dna通过膜的通道，进而将dna带入细胞。化学转化方法中最经典的方法是hanahan法和inoue法，此外一种不依赖42℃热激的一步法转化tss法也被广泛应用。不同的化学转化方法最大的区别是制备感受态细胞所用的缓冲液的不同。
3.hanahan法制备感受态所使用的缓冲液配方为1m的ph7.0乙酸钾40ml/l、二水氯化钙11.8g/l、四水氯化锰4g/l、六水氯化镁2g/l、甘油100ml/l，虽然其报道的转化效率为109cfu/μg dna，但在标准实验条件下能制备出的感受态效价常保持在108cfu/μg dna。hanahan法制备感受态所提及的标准实验条件对配制缓冲液所用试剂的纯度、存储时间及细胞的生长状态都有严格要求。相比4℃培养的细菌，
‑
70℃冷冻储存的细菌更容易获得高的转化效率，此外培养细菌所用玻璃器皿的清洁度，洗涤剂的存在也会影响转化效率。
4.inoue法制备感受态所使用的缓冲液配方为四水氯化锰10.88g/l、二水氯化钙2.2g/l、氯化钾18.65g/l、0.5m的ph6.7 pipes 20ml/l，所制备的感受态效价在标准实验条件下可以达到108cfu/μg dna，但此方法需要细菌培养生长在18℃而非正常的37℃，大大延长了制备所需的时间。此外该方法仅对于dh5a和xl1
‑
blue效果较好，高的效价并不适用于其他大肠杆菌。
5.tss法制备感受态所使用的缓冲液配方为聚乙二醇3350 100g/l、二甲基亚砜50ml/l、甘油100ml/l、硫酸镁1.2g/l、氯化镁0.952g/l、用胰化蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l配制的lb液体培养基补齐到1l并用盐酸调ph至6.1，其制备感受态的步骤比较简单，但其转化效率较低，基本在107cfu/μg dna。
6.经检索，有关在制备感受态细胞时，对配制所需试剂、培养基及细菌状态等条件要求宽容，也无需低温长时间培养，并适用于多种大肠杆菌可使普通大肠杆菌感受态效价由107cfu/μg dna提高到108cfu/μg dna，同时能大大节省感受态制备时间的适于制备高效价感受态细胞的缓冲液及其应用还未见报道。


技术实现要素：

7.针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种适于制备高效价感受态细胞的缓冲液及其应用。
8.本发明所述的适于制备高效价感受态细胞的缓冲液，其特征在于：所述缓冲液命名为tss
‑
hi缓冲液，其配方是：聚乙二醇8000 60g/l
‑
140g/l、二甲基亚砜50
±
5ml/l、甘油80ml/l
‑
120ml/l、氯化镁1.9g/l
‑
4.76g/l、用胰化蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l配制的lb液体培养基补齐到1l并用盐酸调ph至6.1
±
0.1，121℃高压灭菌后加入无菌4m的氯化锰25.6ml/l
‑
52.6ml/l。
9.上述适于制备高效价感受态细胞的缓冲液中，所述tss
‑
hi缓冲液的配方优选的实施方式是：聚乙二醇8000 100g/l、二甲基亚砜50ml/l、甘油100ml/l、氯化镁1.9g/l、用胰化蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l配制的lb液体培养基补齐到1l并用盐酸调ph至6.1，121℃高压灭菌后加入无菌4m的氯化锰36.2ml/l。
10.本发明所述适于制备高效价感受态细胞的缓冲液在制备大肠杆菌高效价的感受态细胞实现dna的高效转化中的应用。
11.上述的应用中，所述制备大肠杆菌高效价的感受态细胞的方法是：从固体lb平板挑取大肠杆菌单克隆至含lb液体培养基的试管中，培养12小时后转接至50ml三角瓶中使菌的初始od
600
＝0.02，继续培养待od
600
长至0.5时收菌；冰浴10min后4000rpm,10min,4℃离心；弃上淸，加入1ml tss
‑
hi缓冲液并在冰上轻混使菌悬浮，避免产生气泡；再4000rpm,10min,4℃离心；弃上清，加入1ml tss
‑
hi缓冲液在冰上轻混匀，冰浴10min后按30μl/管分装，
‑
80℃存储；所述dna转化的方法是：将5μl kcm液、设定量dna和h2o补齐至25μl，再加入25μl制得的高效价感受态细胞轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰上放置2min，加250μl lb液体培养基恢复培养1h后涂布相应抗性的平板；其中所述kcm液的配方是：氯化钾37.27g/l,氯化钙16.65g/l,氯化镁23.8g/l，余量为水。
12.上述的应用中：所述大肠杆菌优选是大肠杆菌bw3kd、omnimax、xl1
‑
blue mfr’、stble3、mach1或stbl2。
13.本发明公开了一种适于制备高效价感受态细胞的缓冲液及其应用，其具有的有益效果体现在：
14.1)应用本发明的适于制备高效价感受态细胞的缓冲液制备感受态细胞时，对配制所需试剂、培养基及细菌状态等条件要求比较宽容，也无需低温长时间培养，在提高感受态效价的同时大大节省了感受态制备时间；
15.2)在制备大肠杆菌高效价的感受态细胞实现dna的高效转化应用中，本发明的缓冲液可以使普通大肠杆菌感受态效价由107cfu/μg dna提高到108cfu/μg dna，其中bw3kd效价可以达到约7.21
×
109±
1.85
×
109cfu/μg dna，且本发明的缓冲液和相应方法适用于多种大肠杆菌；
16.3)基于菌株的高效价，可以提高dna片段的组装效率、可以同时完成多个片段的组装，应用效果和应用领域均可得到提升。
附图说明
17.图1.基于tss法，本发明所述的适于制备高效价感受态细胞的缓冲液tss
‑
hi配方组分改变对效价的影响变化。
18.图2.本发明所述tss
‑
hi缓冲液对多株实验室常用大肠杆菌进行感受态效价测试。
19.选取实验室常用的几株大肠杆菌bw3kd、omnimax、xl1
‑
blue mfr’、stble3、mach1
或stbl2，分别用tss法和tss
‑
hi法进行感受态制备后转化0.2ng pbluescript sk
‑
进行效价测试。
20.图3.应用本发明所述tss
‑
hi缓冲液进行感受态制备与常用的感受态制备方法的效价比较。
21.选取实验室常用的几种感受态细胞，采用电转化、hanahan法、inoue法和tss法及tss
‑
hi法分别制备感受态细胞，并转化0.2ng pbluescript sk
‑
进行效价测试比较。
22.图4.应用本发明所述tss
‑
hi缓冲液制备感受态效价稳定性测试。
23.选取菌株bw3kd用本发明所述tss
‑
hi缓冲液进行多次感受态制备和转化0.2ng质粒pbluescript sk
‑
进行效价稳定性测试。
具体实施方式
24.下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
25.下述实施例中，所使用的材料、试剂、菌株、质粒等，如无特殊说明，均从商业途径得到。
26.在本发明实施案例中，测试了tss
‑
hi缓冲液中peg3350和peg8000对感受态效价的影响，发现分子量为8000的peg最为合适。
27.在本发明实施案例中，测试了tss
‑
hi缓冲液中不同浓度的mncl2对感受态效价的影响，发现140mm为最优反应温度。
28.在本发明实施案例中，测试了tss
‑
hi缓冲液对不同的克隆型菌株效价的影响；共测试了bw3kd、omnimax、xl
‑
1blue mrf’、stbl3、stbl2、mach1共6种菌株，发现与最初的tss法相比本发明的tss
‑
hi缓冲液制备的感受态细胞效价都有提升，其中bw3kd、omnimax的效价提高最多。
29.在本发明实施案例中，测试了转化过程中30s
‑
720s之间的热激时间，发现45s或90s为最优热激时间。
30.实施例1：tss
‑
hi缓冲液对多株实验室常用大肠杆菌感受态效价高低的研究
31.选取感受态制备和转化tss法为对照，对实验室常用的几株大肠杆菌bw3kd、omnimax、xl1
‑
blue mfr’、stble3、mach1和stbl2应用tss
‑
hi缓冲液进行tss
‑
hi法感受态效价的测试比较，具体感受态制备和转化方法如下：
32.1.tss法
33.a.tss缓冲液配方：聚乙二醇3350 100g/l、二甲基亚砜50ml/l、甘油100ml/l、硫酸镁1.2g/l、氯化镁0.952g/l、用lb(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l)补齐到1l用盐酸调ph至6.1。
34.b.感受态制备：从固体lb平板分别挑取上述六株菌的单克隆至含lb液体培养基的试管中，培养12小时后转接至50ml三角瓶中使菌初始od
600
＝0.02，待od
600
长至约0.5左右4000rpm,10min,4℃收菌；弃上淸，用1ml tss缓冲液在冰上轻柔悬浮细胞，冰浴10min后分装30μl/管，
‑
80℃存储。
35.c.转化：5μl kcm(氯化钾37.27g/l,氯化钙16.65g/l,氯化镁23.8g/l)、0.2ng pbluescript sk
‑
和h2o补齐至25μl,加入制得的25μl感受态轻柔混匀，冰浴30min，加250μl lb液体培养基，37℃恢复培养1h后涂布amp抗性的平板。
36.2.tss
‑
hi法
37.a.tss
‑
hi缓冲液配方：聚乙二醇8000 100g/l、二甲基亚砜50ml/l、甘油100ml/l、氯化镁1.9g/l、用lb(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l)补齐到1l用盐酸调ph至6.1，121℃高压灭菌后加入无菌4m氯化锰36.2ml/l。
38.b.感受态制备：从固体lb平板挑取上述六株菌的单克隆至含lb液体培养基的试管中，培养12小时后转接至50ml三角瓶中使菌初始od
600
＝0.02，待od
600
长至约0.5左右收菌；冰浴10min后4000rpm,10min,4℃离心；弃上淸，加入1ml tss
‑
hi缓冲液在冰上轻柔悬浮细胞，避免产生气泡，再4000rpm,10min,4℃离心；弃上清，加入1ml tss
‑
hi缓冲液在冰上轻柔悬浮细胞，冰浴10min后分装30μl/管，
‑
80℃存储。
39.c.转化：5μl kcm(氯化钾37.27g/l,氯化钙16.65g/l,氯化镁23.8g/l)、0.2ng pbluescript sk
‑
和h2o补齐至25μl,加入制得的25μl感受态轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰上放置2min，加入250μl lb液体培养基，37℃恢复培养1h涂布amp抗性的平板。
40.3.结果如图2所示，感受态制备方法tss
‑
hi适用于多种大肠杆菌，且其效价都稳定高于tss法，其中用tss
‑
hi法制备菌株bw3kd的感受态效价可以达到6.4
×
109cfu/μg dna。
41.实施例2.应用tss
‑
hi缓冲液以tss
‑
hi法制备的感受态与其他方法制备的感受态效价的比较
42.感受态细胞制备及转化：
43.1.hanahan法
44.a.ccmb80缓冲液配方：ph7.0乙酸钾4g/l、二水氯化钙11.8g/l、四水氯化锰4g/l、六水氯化镁2g/l、甘油100ml/l。
45.b.感受态制备：从固体lb平板挑取单克隆至含lb液体培养基的试管中，培养12小时后转接至50ml三角瓶中使菌初始od
600
＝0.02，待od
600
长至约0.5左右4000rpm,10min,4℃收菌；弃上清，加入4ml ccmb80缓冲液轻柔悬浮细胞，沉淀悬浮好后再次添加12mlccmb80缓冲液，冰上孵育20min后4000rpm,10min,4℃离心；弃上清，加入1ml ccmb80缓冲液在冰上轻柔悬浮细胞，冰浴20min分装50μl/管，
‑
80℃存储。
46.c.转化：0.2ng pbluescript sk
‑
加入到50μl的感受态细胞中混匀，冰浴30min，42℃热击60s，冰上放置2min，加250μl lb液体培养基，37℃恢复培养1h后涂布amp抗性的平板。
47.2.inoue法
48.a.inoue缓冲液配方：四水氯化锰10.88g/l、二水氯化钙2.2g/l、氯化钾18.65g/l、0.5m ph6.7pipes 20ml/l。
49.b.感受态制备：从固体lb平板挑取单克隆至含lb液体培养基的试管中，培养12小时后转接至50ml三角瓶中使菌初始od
600
＝0.02，待od
600
长至约0.5左右4000rpm,10min,4℃收菌；弃上清，用20ml inoue缓冲液轻柔悬浮细胞，4000rpm,10min,4℃离心；弃上清，加入1ml inoue缓冲液在冰上轻柔悬浮细胞，冰浴10min分装100μl/管，
‑
80℃存储。
50.c.转化：0.2ng pbluescript sk
‑
加入到100μl的感受态细胞中混匀，冰浴30min，
42℃热击90s，冰上放置2min，加400μl lb液体培养基，37℃恢复培养1h后涂布amp抗性的平板。
51.3.tss法
52.a.tss缓冲液配方：聚乙二醇3350 100g/l、二甲基亚砜50ml/l、甘油100ml/l、硫酸镁1.2g/l、氯化镁0.952g/l、用lb(胰化蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l)补齐到1l用盐酸调ph至6.1。
53.b.感受态制备：从固体lb平板挑取单克隆至含lb液体培养基的试管中，培养12小时后转接至50ml三角瓶中使菌初始od
600
＝0.02，待od
600
长至约0.5左右4000rpm,10min,4℃收菌；弃上淸，加入1ml tss缓冲液在冰上轻柔悬浮细胞，冰浴10min后分装30μl/管，
‑
80℃存储。
54.c.转化：5μl kcm(氯化钾37.27g/l,氯化钙16.65g/l,氯化镁23.8g/l)、0.2ng pbluescript sk
‑
和h2o补齐至25μl,加入25μl感受态轻柔混匀，冰浴30min，加250μl lb液体培养基，37℃恢复培养1h后涂布amp抗性的平板。
55.4.tss
‑
hi法
56.a.tss
‑
hi缓冲液配方：聚乙二醇8000 100g/l、二甲基亚砜50ml/l、甘油100ml/l、氯化镁1.9g/l、用lb(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l)补齐到1l用盐酸调ph至6.1，121℃高压灭菌后加入无菌4m氯化锰36.2ml/l。
57.b.感受态制备：从固体lb平板挑取单克隆至含lb液体培养基的试管中，培养12小时后转接至50ml三角瓶中使菌初始od
600
＝0.02，待od
600
长至约0.5左右收菌；冰浴10min后4000rpm,10min,4℃离心；弃上淸，加入1ml tss
‑
hi缓冲液在冰上轻柔悬浮细胞，避免产生气泡，4000rpm,10min,4℃离心；弃上清，加入1ml tss
‑
hi缓冲液在冰上轻柔悬浮细胞，冰浴10min分装30μl/管，
‑
80℃存储。
58.c.转化：5μl kcm(氯化钾37.27g/l,氯化钙16.65g/l,氯化镁23.8g/l)、0.2ng pbluescript sk
‑
和h2o补齐至25μl,加入25μl感受态轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰上放置2min，加入250μl lb液体培养基，37℃恢复培养1h涂布amp抗性的平板。
59.5.电转化
60.a.缓冲液配方：100ml/l甘油
61.b.感受态制备：从固体lb平板挑取单克隆至含lb液体培养基的试管中，培养12小时后转接至50ml三角瓶中控制菌初始od
600
＝0.02，待od
600
长至约0.5左右4000rpm,10min,4℃收菌；弃上清，用20ml冰浴水4000g,10min,4℃离心清洗细胞两次；弃上清，加入20ml冰浴100ml/l甘油4000g,10min,4℃离心清洗细胞一次；弃上清，用1ml冰浴100ml/l甘油轻柔悬浮细胞，分装100μl/管。
62.c.转化：0.2ng pbluescript sk
‑
质粒与100μl感受态细胞混匀，并转移到预冷的0.2cm的电转杯中；使用电转仪电转，转化参数为2.5kv，5ms；电转后迅速加入900μl lb液体培养基与感受态细胞混匀；将1ml体积的菌液转移到1.5ml ep管中，37℃恢复培养1hr涂布amp抗性的平板。
63.6.结果如图3所示，在化学转化方法下bw3kd和xl1
‑
blue mfr’两株菌其最高效价都是tss
‑
hi法，且bw3kd菌株用tss
‑
hi法制备的感受态效价可基本与电转化得到的效价相持平。
64.实施例3.应用tss
‑
hi缓冲液以tss
‑
hi法制备的感受态效价稳定性研究
65.基于上述实验，进一步选取可以用tss
‑
hi法获得更高效价的菌株bw3kd，用tss
‑
hi缓冲液进行多次感受态制备并通过转化0.2ng pbluescript sk
‑
测试效价。
66.1.tss
‑
hi缓冲液配方：聚乙二醇8000 100g/l、二甲基亚砜50ml/l、甘油100ml/l、氯化镁1.9g/l、用lb(胰蛋白胨10g/l、酵母提取物5g/l、氯化钠10g/l)补齐到1l用盐酸调ph至6.1，121℃高压灭菌后加入无菌4m氯化锰36.2ml/l。
67.2.感受态制备：从固体lb平板分别挑取上述六株菌(bw3kd、omnimax、xl1
‑
blue mfr’、stble3、mach1和stbl2)的单克隆至含lb液体培养基的试管中，培养12小时后转接至50ml三角瓶中使菌初始od
600
＝0.02，待od
600
长至约0.5左右收菌；冰浴10min后4000rpm,10min,4℃离心；弃上淸，加入1ml tss
‑
hi缓冲液在冰上轻柔悬浮细胞，避免产生气泡，再4000rpm,10min,4℃离心；弃上清，加入1ml tss
‑
hi缓冲液在冰上轻柔悬浮细胞，冰浴10min分装30μl/管，
‑
80℃存储。
68.3.转化：5μl kcm(氯化钾37.27g/l,氯化钙16.65g/l,氯化镁23.8g/l)、0.2ng pbluescript sk
‑
和h2o补齐至25μl,加入25μl制得的感受态轻柔混匀，冰浴30min，42℃热击90s，冰上放置2min，加入250μl lb液体培养基，37℃恢复培养1h涂布amp抗性的平板。
69.结果如图4所示，多次用tss
‑
hi缓冲液进行感受态制备和效价测试发现，tss
‑
hi法效价比较稳定，不受实验条件和批次的影响，其效价基本可维持在7.21
×
109±
1.85
×
109cfu/μgdna。