一种可利用低成本碳源的复合脱氮菌剂构建及应用的制作方法

1.本发明涉及一种突破碳源利用局限性的好氧脱氮复合菌剂及其制备方法和应用，属于环境污染生物修复技术领域。


背景技术：

2.微生物脱氮主要包括三种：(1)传统的自养硝化
‑
厌氧反硝化系统脱氮；(2)厌氧氨氧化菌株过程；(3)异养硝化
‑
好氧反硝化菌株脱氮。
3.近年来，许多微生物被发现具有异养硝化
‑
好氧反硝化作用，这些微生物较前两种脱氮系统和菌株相比具有以下优点:(1)反应程序简单，硝化和反硝化可以同时进行；(2)环境适应能力强，生长速度快；(3)由于反硝化过程中产生的碱度可以部分补偿硝化过程中的碱度消耗，因此脱氮过程中所需缓冲量较少。因此，异养硝化
‑
好氧反硝化菌的脱氮途径具有效率高、设备要求低、占地空间小等优势，应用前景更为广泛。
4.但是，该类菌株往往以小分子酸作为碳源，表1例举出了以前发表的代表性异养硝化
‑
好氧反硝化菌株及其去除能力。该类菌株仅在乙酸、丁二酸、柠檬酸等小分子酸存在时，具有优异的氨氮和总氮去除效果，但是若以葡萄糖作为唯一碳源，所有报道菌株均不发生脱氮作用，这一碳源利用局限性影响其在实际应用过程中的稳定性，极大阻碍了该类菌株的推广及应用。另外，从经济角度考虑，小分子酸因成本较高，极大的提高了菌株发酵的成本，严重影响实际应用的效果，不利于大规模推广。
5.表1已报道的具有异养硝化
‑
好氧反硝化能力的菌株碳源利用能力和脱氮效果
[0006][0007]


技术实现要素：

[0008]
本发明通过理性设计和筛选，基于好氧产酸菌w1和异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1的代谢产物互作，突破性的解决了异养硝化
‑
好氧反硝化菌对碳源利用的局限性，提供一种可以利用葡萄糖作为唯一碳源进行脱氮的复合微生物菌剂，推动了异养硝化
‑
好氧反硝化菌种资源在生物脱氮方面的高效利用。与此同时，在实际应用过程中，利用廉价的葡萄糖将传
统的单独菌株分别发酵变为两种菌株共同发酵，以及利用廉价的葡萄糖代替较为昂贵的小分子酸作为碳源的添加，都将极大的节约应用成本。
[0009]
具体地，本发明提供了如下技术方案：
[0010]
1.复合脱氮菌剂，其特征在于，包括异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1和好氧产酸菌w1；
[0011]
其中，所述异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1为水产碱杆菌(alcaligenes aquatilis)，其保藏编号为cgmcc no.21580；
[0012]
所述好氧产酸菌w1为产左聚糖微杆菌(microbacterium laevaniformans)，其保藏编号为cgmcc no.19762。
[0013]
2.根据项目1所述的复合脱氮菌剂，其特征在于，所述异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1和所述好氧产酸菌w1的体积比为1:5至1:20，优选为1:10至1:20。
[0014]
3.项目1
‑
2任一项所述的复合脱氮菌剂的制备方法，其特征在于，分别将异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1和好氧产酸菌w1发酵培养，然后将发酵液按比例混合。
[0015]
4.根据项目3所述的制备方法，其中，所述异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1和所述好氧产酸菌w1的体积比为1:5至1:20，优选为1:10至1:20。
[0016]
5.根据项目3所述的制备方法，其特征在于，所述方法还包括将混合后的发酵液吸附于基质上，然后低温烘干造粒；所述基质优选为硅藻土或沸石粉。
[0017]
6.项目1
‑
2中任一项所述的复合脱氮菌剂在污染物脱氮中的应用。
[0018]
7.用于污染物脱氮的方法，包括向污染物中投入如项目1或2所述的复合脱氮菌剂。
[0019]
8.根据项目7所述的方法，其中，在脱氮过程中使污染物的溶氧保持在3mg/l～8mg/l。
[0020]
9.根据项目7所述的方法，其中，所述污染物为污泥或污水。
[0021]
【生物材料保藏】
[0022]
本发明的异养硝化
‑
好氧反硝化菌株d1保藏于：
[0023]
中国典型培养物保藏中心/中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期为2021年1月18日、保藏编号cgmcc no.21580；该保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0024]
本发明的好氧产酸菌株w1保藏于：
[0025]
中国典型培养物保藏中心/中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)，保藏日期为2020年4月30日、保藏编号cgmcc no.19762；该保藏单位的地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
[0026]
技术效果
[0027]
1、优良菌株的筛选：本发明筛选出具有高效脱氮的异养硝化
‑
好氧反硝化菌株，同时筛选出具备好氧产酸能力的菌株；
[0028]
2、通过菌株互作，突破异养硝化
‑
好氧反硝化菌株碳源利用的局限性，提高了同步硝化反硝化脱氮菌株在实际应用的稳定性；
[0029]
3、将葡萄糖等廉价的碳源代替相对昂贵的有机小分子酸，大大的节约了实际应用中投加碳源的成本以及大批发酵的成本。
[0030]
总之，本发明的复合脱氮菌剂包含两种菌株，分别为异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1和
好氧产酸菌w1，其中利用这两种菌株的功能互作关系，成功解决了异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1对小分子酸等高成本碳源的依赖性，将低成本的葡萄糖作为脱氮碳源，大大的节约了实际脱氮应用中投加碳源的成本。本发明的复合脱氮菌剂可应用于生活污水的脱氮，氨氮去除达84％，总氮去除达48％。
附图说明
[0031]
图1显示了本发明的复合菌剂发酵获得的共发酵培养液对生活污水的脱氮效果。
具体实施方式
[0032]
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
[0033]
定义
[0034]
异养硝化
‑
好氧反硝化(heterotrophic nitrification and aerobic denitrification)菌是指能够进行异养硝化，同时又可以在氧气存在条件下进行反硝化的一类细菌，其不仅可以将氨氮转化为气态产物，而且不会造成no2‑
‑
n/no3‑
‑
n的累积现象，同时还能够去除污水中的cod。
[0035]
好氧产酸菌是指在有氧条件下利用廉价碳源(例如葡萄糖)进行生长，同时产生大量的小分子酸的菌株；在本发明中，其所获得的代谢产物可以为反硝化菌株提供充足的生长和生化因子。
[0036]
实施例1菌株筛选
[0037]
本发明提供了一种好氧脱氮复合型菌剂，特别的突破了异养硝化
‑
好氧反硝化菌剂的碳源利用局限性。本发明复合菌剂涉及两种菌株，分别为w1和d1，其中w1为好氧产酸菌，能够在有氧条件下利用葡萄糖产乙酸，溶氧范围为1～8mg/l，24h产乙酸含量约为0.5mm，16s测序比对结果为红球菌(rhodococcus sp.)；d1为异养硝化
‑
好氧反硝化菌，可以在有氧条件下利用乙酸、琥珀酸等小分子酸进行高效同步硝化和反硝化，并且在异养条件生长迅速，氨氮去除率高达100％，总氮去除率高达45％，16s rdna测序比对结果为产碱杆菌(alcaligenes sp.)。
[0038]
1、异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1菌的分离纯化方法和功能验证：
[0039]
d1的富集培养基：10mg/l nh4cl，20mg/l ch3coona，0.2mg/l mgso4·
7h2o，0.2mg/l酵母提取物(diamond)，0.2mg/l蛋白胨(diamond)，1mg/l edta
‑
na2，1.5mg/l丙酮酸钠，ph调为7.5，121℃，15min高压灭菌；再向上述培养基中加入10ml过滤除菌的0.1g/l nahco3溶液和20mg/l kh2po4溶液。
[0040]
d1的分离培养基：0.5g/l酵母提取物(diamond)，0.5g/l蛋白胨(diamond)，0.5g/l酪蛋白水解物(diamond)，0.5g/l葡萄糖，0.5g/l可溶性淀粉(diamond)，0.3g/l磷酸二氢钾0.03g/l，无水硫酸镁，0.3g/l丙酮酸钠，ph 7.0。
[0041]
d1的功能验证培养基：0.1g/l(nh4)2so4，0.7g/l ch3coona，0.50g/l kh2po4,0.50g/l na2hpo4，0.20g/l mgso4·
7h2o 0.20g，微量元素2.00ml，ph 7.3。其中，微量元素为每1l包含：edta
·
2na 57.10g，znso4·
7h2o 3.90g，cacl2·
2h2o 7.00g,mncl2·
4h2o 1.00g,feso4·
5.00g，(nh4)6mo7o
24
·
4h2o 1.10g，mnso4·
4h2o 1.60g，cocl2·
6h2o 1.60g,
ph 6.0。
[0042]
采集湖泊水样和底泥混合样品20g于d1富集培养基中富集半个月，取富集液10倍梯度稀释涂布于d1分离培养基中，挑取形态不同的单菌落进行保种。随后分别活化这些纯菌，按照1/100的比例接种于d1功能验证培养基中，48h测定其脱氮能力，最终筛选出d1菌株，其保藏号为cgmcc no.21580
[0043]
2、好氧产酸菌w1菌的分离纯化方法和功能验证：
[0044]
w1的富集培养基：0.5g/l kh2po4，1g/l na2hpo4，0.2g/l mgso4·
7h2o，1g/l葡萄糖，1.07g/l nh4cl，0.03g/l酵母提取物，微量元素2ml，ph调到7.3；其中，微量元素(1l)：edta
·
2na 0.5g，znso4·
7h2o 0.22g，cacl2·
2h2o 0.055g，mncl2·
4h2o 0.051g，feso4·
0.0499g，(nh4)6mo7o
24
·
4h2o 0.011g，mnso4·
4h2o 0.0157，cocl2·
6h2o 0.016g,ph 6.0。
[0045]
w1的分离培养基与w1富集培养基相同。
[0046]
采集湖泊底泥5g于100ml w1富集培养基中，30℃，150rpm进行富集，按照5％转接，两天传一代，共传7代。富集培养结束后，取传代样品稀释后涂布于固体w1分离培养基(在w1分离培养基基础上加入1.5％琼脂)中，进行菌株分离纯化。之后选取培养菌株接种于w1分离培养基中，3天后测定培养基ph，并通过反向高效液相色谱检测产乙酸能力，最终筛选出w1和w2两株产酸菌株，并根据与d1的功能配伍实验最终确定选择w1菌株，其保藏号为cgmcc no.19762。
[0047]
3、两菌配伍比例：配伍培养基选择d1功能验证培养基，并将碳源ch3coona替换为葡萄糖，c/n比调为15:1，ph 7.5。d1自身无法利用葡萄糖，无法在该培养基生长，w1可以在该培养基生长，并将葡萄糖转化为小分子酸供d1利用，发挥脱氮功能。
[0048]
本发明选择w1和d1按照20:1、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、1:20的比例进行配比验证，并按1/100的比例接种于d1功能验证培养基中，每过12h取一次样品，48h后根据脱氮效果，最终确定w1:d1为10:1和20:1时，功能最佳，脱氮率达到100％。
[0049]
4、发酵生产：
[0050]
种子发酵培养基：5g/l胰蛋白胨、5g/l酵母提取物，5g/l nacl。
[0051]
共发酵培养基：葡萄糖20g/l，玉米浆5g/l，尿素1g/l，k2hpo
4 1g/l，mgso
4 0.5g/l，ph 7.5。
[0052]
共生产培养工艺控制：w1和d1按照10:1的比例混合，罐压0.02
‑
0.05mpa，温度30
‑
35℃，ph控制在6.5
‑
7.5，搅拌转速150
‑
200rpm，溶氧>20％。
[0053]
5、发酵及应用效果：
[0054]
单独利用共发酵培养基进行培养时，单独的d1无法生长，而单独的w1不具有脱氮能力；将二者组合进行共发酵后菌株od
600
达到18，利用发酵培养物按照千分之一的比例处理生活污水，氨氮去除能达到99％，总氮去除在50％以上，仅有少量的亚硝酸盐和硝酸盐积累。
[0055]
实施例2：通过菌剂互作突破碳源利用局限性
[0056]
首先采用实施例1的方法筛选获得保藏号为cgmcc no.21580的异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1和保藏号为cgmcc no.19762的好氧产酸菌w1，然后分别
‑
80℃冻存备用。
[0057]
将分别冻存于
‑
80℃的保藏号为cgmcc no.21580的异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1和保藏号为cgmcc no.19762的好氧产酸菌w1菌株在lb固体培养基中划线活化，30℃生长24h
后分别挑取单克隆于lb液体培养基中扩大培养，30℃，200rpm，摇菌24h。
[0058]
分别取d1和w1培养菌液10ml，6000rpm离心10min，用无菌的磷酸盐缓冲液悬浮，再离心，离心后菌体用磷酸缓冲液调od
600
为2。分别按照d1:w1为1:1和1:10两种比例混合，之后将混合溶液分别按照1/100的比例接至配伍培养基摇瓶中，每个实验重复3次，30℃，150rpm培养，在24h和48h分别取样测定氨氮和总氮结果，利用只接d1和只接w1的做对照。
[0059]
结果显示于表2，通过表2可知：单独的d1菌株无法在只有葡萄糖为碳源的培养基上生长，因此氨氮和总氮无变化；单独的w1菌株虽然生长很好，但是不具备脱氮能力，只是由于菌株生长而同化了部分的氨氮；d1和w1比例1:1混合后，氨氮和总氮较单独w1有减少，脱氮率有限，说明该比例下的d1菌株并不能发挥其高效的脱氮功能，原因可能是w1菌株比例小，产酸能力弱，不足以提供d1的生长和发挥功能；d1和w1按照1:10混合后，氨氮和总氮有了明显降低，48h时氨氮去除接近100％，总氮去除达到50％，说明通过两个菌的互作，突破了异养硝化
‑
好氧反硝化对碳源利用局限性。
[0060]
表2
[0061][0062]
实施例3：利用廉价碳源葡萄糖进行菌剂共同发酵
[0063]
利用种子发酵培养基对保藏号为cgmcc no.19762的好氧产酸菌w1和保藏号为cgmcc no.21580的异养硝化
‑
好氧反硝化菌d1分别扩大培养，并按照w1:d1为10:1的比例混合两种菌株，混合菌液按1/100的比例接种于共发酵培养基进行发酵，发酵条件控制为罐压0.02
‑
0.05mpa，温度30
‑
35℃，ph控制在6.5
‑
7.5，搅拌转速150
‑
200rpm，溶氧>20％，得到共发酵培养液。同时，设置对照组，对照组为发酵种子不混合，分别按照1/100的比例接种于发酵罐，其中w1利用共发酵培养基，d1发酵培养基是在共发酵培养基基础上将碳源葡萄糖更换为乙酸钠，按照共发酵培养工艺发酵，分别得到w1单独发酵液和d1单独发酵液。
[0064]
发酵完成后，取共发酵培养液，w1单独发酵液和d1单独发酵液，将od600分别调为5，w1和d1单独发酵液按照10:1比例混合为混合发酵液。将共发酵培养液、混合发酵液、w1单独发酵液和d1单独发酵液4种发酵液按1/1000的比例分别接种于功能培养基摇瓶，48小时后测定脱氮率。
[0065]
结果如表3所述，显示了：w1和d1单独发酵液组的总氮较接种前没有明显变化，原因为w1不具备脱氮功能，而d1在配伍培养基上无法生长。共发酵培养液组和混合发酵液组的总氮脱除分别达到55％和51％，说明廉价的葡萄糖代替相对昂贵的有机小分子酸作为碳源可以对w1和d1共发酵，节约了实际应用的成本，达到了好氧脱氮的稳定性。
[0066]
表3
[0067]
实验组氨氮(mg/l)总氮(mg/l)共发酵培养液09.07
±
0.08混合发酵液09.89
±
0.05
w1单独发酵液5.51
±
0.0521.43
±
1.25d1单独发酵液19.66
±
0.0120.57
±
1.01
[0068]
实施例4：复合菌剂在实验室条件下对生活污水进行脱氮应用；
[0069]
采取北京某污水处理厂经过1mm筛孔的污水，经测定氨氮为44mg/l，总氮54mg/l。取30l污水加入到反应器中，加入曝气装置，使水体溶氧保持在5mg/l，将实施例3中获得的(按照w1:d1为10:1的比例混合发酵)共发酵菌液按照1/1000的比例加入到反应器中，同时将未加菌液的反应器作为对照。每过24小时取一次样品，共持续5天。
[0070]
结果如图1所示，经过5天的时间，氨氮脱除率为84％以上，总氮脱除率约为48％，脱氮效果良好。
[0071]
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。