一种天然纳米多效保鲜剂的制备方法及对花椰菜制品的保鲜应用与流程

1.本发明属于食品保鲜与贮藏、添加剂、纳米材料等相关技术领域，具体涉及种天然纳米多效保鲜剂制备方法及其在低盐熟制花椰菜加工食品中的应用。


背景技术：

2.花椰菜是一种很受人们欢迎的蔬菜，味道鲜美，营养价值和药用价值都不可小觑。花椰菜中的维生素c含量非常丰富，还具有抗癌功效，平均营养价值及防病作用远远超出其他蔬菜。美国加利福尼亚大学科研人员的一项新研究发现，花椰菜中的化合物对增强人体免疫力大有裨益。在被咀嚼和消化时，能够产生出一种叫做dim的化合物，dim确能阻止某些癌细胞的生长，可能有助于提升免疫力。
3.花椰菜低盐加工食品，在炒制过后易受到常见食源性病菌的污染，易出现腐败及变色等问题；其次，其炒制后的油脂也极易被氧化而变质；从而减低花椰菜低盐加工食品的产品品质。由此，市场对低盐熟制花椰菜产品的保存方法和保鲜剂有很大的需求。
4.no自由基还是一种有效的抗菌和抗病毒剂，该自由基可诱导dna链断裂，促进脂质过氧化，这种现象能够杀死癌细胞和细菌。在抗菌应用中，no不仅能够有效的杀死单一菌株，而且能够杀死混合微生物菌株。因此，no被认为是抗癌和抗微生物的潜在治疗剂。然而，目前研究的no供体还存在诸多不足，如生物相容性差、no负载量低、控释缓释效果不佳等。为了实现no的可控释放，充分发挥其优异的长效控菌优势，人们开始尝试制备各种no供体，一个理想的no释放的大分子载体将是多功能的，并由多个no供体组成，以实现一个理想的no有效载荷。壳聚糖是由甲壳素经脱乙酰化后得到的天然碳水化合物共聚物。壳聚糖的基本组成单位是n
‑
乙酰氨基葡萄糖，而其基本结构单元是甲壳二糖。壳聚糖分为三种不同形式：高分子量壳聚糖、中分子量壳聚糖和低分子量壳聚糖。壳聚糖具有优越的可降解性、在弱酸中的溶解度、ph敏感性、成膜性、生物相容性、非抗原性、无毒性、低成本等特性。此外，壳聚糖还具备天然来源和多种可能的应用，如制备可生物降解的薄膜、共混物、涂层、复合材料、纳米复合材料等。在化学修饰后，由此产生的壳聚糖衍生物可以被赋予新的特性，它们作为多功能纳米载体的潜在用途一直备受关注。s
‑
亚硝基硫醇
‑
壳聚糖(sno
‑
cs)将是多重生物功效的大分子支架，既可以结合no释放的能力，产生超强的抗菌和抗生物被膜特性，同时又能被制备成多种形态的纳米材料。
5.由于金属纳米颗粒的抗菌潜力，以及银纳米颗粒的潜在毒性劣势，我们将重点放在我们对广泛研究的硒纳米颗粒的研究。硒纳米材料，包括纳米颗粒，纳米棒，纳米线，碳纳米管和纳米管已被广泛探索并用于拥有出色的抗癌活性和低毒。目前，有一些研究涉及硒纳米材料的抗菌性能。例如，在一项体外研究中，硒纳米粒子能有效抑制金黄色葡萄球菌的生长。在另一项研究中，发现用高稳定硒纳米颗粒填充的织物(psp
‑
senps)具有显著的抗真菌和抗菌活性。而且，硒元素具有抗癌、抗氧化、增强人体免疫力的作用。主要能够防止肿瘤以及肝病的发生，提高身体免疫力，和各种重要器官的正常功能，而且还有一定的预防老年
性心脑血管疾病的发生，调节各种维生素的吸收与利用。
6.本课题组长期从事新型功能食品添加剂的制备与应用研究工作，我们研发了一种纳米多效保鲜剂，可有效提高其抗氧与抑菌效果，且避免了化学防腐剂的使用，符合当代人类大健康理念。


技术实现要素：

7.根据现有技术不足之处，本发明的目的是提供一种天然纳米多效保鲜剂，即天然纳米硒
‑
no型壳聚糖纳米颗粒(se
‑
nocs
‑
nps)，此保鲜剂使用健康、安全，且防腐保鲜与抗氧效果优良，并且抑菌应用广泛。
8.为实现上述目的，本发明的技术方案在于：
9.一种天然纳米硒
‑
no型壳聚糖纳米颗粒(se
‑
nocs
‑
nps)的制备方法，具体步骤如下：
10.s1.通过共价修饰天然壳聚糖的方法制备内生no型壳聚糖(nocs)。
11.s2.使用益生菌的方法制备的天然硒纳米颗粒。
12.s3.通过物理吸附方法制备内生no型壳聚糖包覆的硒纳米颗粒，即天然硒
‑
no型壳聚糖纳米颗粒(se
‑
nocs
‑
nps)，作为天然纳米多效保鲜剂。
13.作为优选，步骤s1中所述含内生no型壳聚糖的制备方法如下：
14.将壳聚糖和氯化锂溶解于n,n
‑
二甲基苯胺中，向体系中加入三乙胺和对甲苯磺酰氯，搅拌反应，丙酮沉淀，过滤并洗涤沉淀，真空除残留溶剂；
15.将产物与氯化锂加入n,n
‑
二甲基苯胺中，继续加入三乙胺和乙二硫醇，氮气保护下，55～65℃搅拌过夜，丙酮沉淀，过滤并洗涤沉淀；
16.然后将重悬在含有二硫苏糖醇的n,n
‑
二甲基苯胺中，搅拌，过滤并洗涤沉淀，真空除溶剂，之后重悬在n,n
‑
二甲基苯胺/甲醇体系中，加入亚硝酸叔丁酯，搅拌反应10～20小时，反应结束后，使用甲醇沉淀，过滤并洗涤沉淀，真空除溶剂，制得内生no型壳聚糖。
17.最优选地，将壳聚糖和氯化锂溶解于dma中，向体系中加入三乙胺和对甲苯磺酰氯，搅拌过夜，丙酮沉淀，过滤并洗涤沉淀，真空除残留溶剂。将上述产物与氯化锂加入dma中，继续加入三乙胺和乙二硫醇，氮气保护下，60℃搅拌过夜，丙酮沉淀，过滤并洗涤沉淀；然后将其重悬在含有二硫苏糖醇的dma中，室温下搅拌；过滤并洗涤沉淀，真空除溶剂。重悬在dma/甲醇中，加入亚硝酸叔丁酯，室温下搅拌15小时，反应结束后，使用甲醇沉淀，过滤并洗涤沉淀，真空除溶剂，制得内生no型壳聚糖(no
‑
cs)，储存在
‑
20℃备用。壳聚糖(cs)具有优秀的生物降解性、生物相容性、抗微生物活性、无毒和通用的化学和物理特性，作为新的包装材料，可以显著提高新鲜食品的货架期。壳聚糖基薄膜和涂层有效的延长了食品的质量和贮藏性，特别是跟一些天然抗氧化剂、抗菌剂的复合膜效果更佳。
18.壳聚糖与氯化锂的质量比在0.25～1：1；对甲苯磺酰氯与壳聚糖的质量比在1～10:1；1,2
‑
乙二硫醇与壳聚糖的质量比在0.5～3:1；亚硝酸叔丁酯与壳聚糖的质量比在0.3～6:1。洗涤沉淀时使用的溶解为：甲醇、丙酮或乙醚。
19.所述的壳聚糖与对甲苯磺酰氯在0～5℃搅拌反应20～24h；与亚硝酸叔丁酯在20～25℃搅拌反应10～20h。
20.作为优选，步骤s2中所述的天然纳米硒(se
‑
nps)的制备步骤如下：
21.将细菌培养物和na2seo3添加到lb培养基中，在发酵反应初期，使培养基的ph维持在6.5～7.5，反应结束时，以7500～15000rpm离心5～15分钟从反应混合物中分离出纳米se，并用蒸馏水洗涤数次，得到天然硒纳米颗粒。
22.最优选地，将新鲜细菌培养物(500μl)和0.1mm的无菌na2seo3添加到50ml无菌lb培养基中。在发酵反应初期，使培养基的ph维持在7附近。反应结束时，由于产生的元素硒(se0)。以10000rpm离心10分钟从反应混合物中分离出纳米se，并用蒸馏水洗涤数次，所有收获的样品都存储在4℃下备用。
23.所述的细菌为嗜酸乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、格氏乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、保加利亚乳酸杆菌、约氏乳杆菌、凝结芽孢杆菌、费氏丙酸杆菌、粪肠球菌、乳酸乳球菌、嗜热链球菌及其组合所组成的群组中的一种。
24.作为优选，步骤s3中所述的天然硒
‑
no型壳聚糖纳米颗粒(se
‑
nocs
‑
nps)的制备方法：
25.将天然硒纳米颗粒在100000g～200000g离心5～15min，再将其分散在含有1～5mg/ml的内生no型壳聚糖水溶液中，经过6～12h的充分接触后，继续在100000g～200000g离心5～15min，重新分散入pbs缓冲液中，得到内生no型壳聚糖包覆的硒纳米颗粒。
26.最优选地，将100μg的天然硒纳米颗粒在155000g离心10min，再将其分散在1ml含有2mg/ml的内生no型壳聚糖水溶液中，经过8h的充分接触后，继续在155000g离心10min，重新分散入1ml的pbs缓冲液中，4℃储藏备用。
27.本发明还提供了一种所述的保鲜剂的应用，天然纳米多效保鲜剂在熟制花椰菜贮藏保鲜中的应用，所述的纳米保鲜剂用于低盐熟制花椰菜的保鲜。所述的熟制花椰菜贮藏保鲜方法如下：花椰菜加工过程结束后，将天然纳米多效保鲜剂粉末均匀分散于熟制花椰菜中后，迅速热封包装。
28.作为优选，具体步骤如下，一定量花椰菜于醋中浸泡一晚，再将上述花椰菜沥干后放入锅中，加适量食用油、红椒、蒜和少量的盐和适量调味品炒至成熟。质量为500g的低盐花椰菜熟制品起锅前加入(0.1g)上述纳米保鲜剂(se
‑
nocs
‑
nps)，充分混匀，真空包装或者气调包装。如选用热封包装，用频率为50hz的倾斜式真空包装机真空热封包装，所述倾斜式真空包装机功率为2～3kw，真空度为0.1～0.2mpa。
29.同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
30.(1)本发明采用天然纳米多效保鲜剂，兼具优良的抑菌、抗氧化和功能保健等多重效果。硒纳米颗粒，既有抑菌与抗氧效果，还具备增强人体免疫功能、抗炎、延缓衰老，并能有效抑制肿瘤生长等保健功效，对人体健康也有一定的促进作用。
31.(2)改善了低盐熟制花椰菜产品的贮藏工艺，配方由生物抑菌剂组成，不添加任何化学防腐剂，更有利人体健康，符合当代人类社会的大健康理念。
附图说明
32.图1(a)为纳米硒的zeta电位图，图1(b)为天然硒
‑
no型壳聚糖纳米颗粒(se
‑
nocs
‑
nps)的透射电镜图。
33.图2为本发明实施例2～5和对照组得到的低盐花椰菜熟制品中的菌落数变化曲线。
34.图3为本发明实施例2～5和对照例得到的低盐花椰菜熟制品存储90天后各指标感官品评结果。
35.图4为本发明实施例4和对照例得到的低盐花椰菜熟制品存储90天的外观图片。
具体实施方式
36.以下结合具体实施例对本发明做进一步的描述。
37.实施例1
38.内生no型壳聚糖的制备：
39.将1g壳聚糖和2g氯化锂溶解在30ml dma中搅拌过夜。冰水浴中向体系中加入7ml三乙胺和9.4g对甲苯磺酰氯，继续搅拌过夜22h。200ml丙酮沉淀产物，过滤，用200ml甲醇和丙酮清洗，真空除残留溶剂。取0.4g上述反应中间体与0.8g氯化锂加入20ml的dma中，继续加入0.8ml三乙胺和0.5ml乙二硫醇(即1,2
‑
乙二硫醇)，氮气保护下，60℃搅拌过夜；反应结束后，利用200ml丙酮沉淀，过滤后，用200ml甲醇与丙酮清洗；然后将其重悬在含有10ml二硫苏糖醇和10mm三乙胺的dma中，室温25℃下搅拌1小时；过滤后，用200ml甲醇和200ml丙酮清洗，真空除溶剂。重悬在dma/甲醇中，加入0.5ml亚硝酸叔丁酯，室温25℃下搅拌15小时；反应结束后，使用100ml甲醇沉淀，过滤后，用100ml丙酮和乙醚洗涤，真空除溶剂，制得内生no型壳聚糖(no
‑
cs)，储存在
‑
20℃备用。
40.实施例2
41.天然硒纳米脂质体(se
‑
nps
‑
lps)的制备过程：
42.将新鲜细菌培养物(500μl，lactobacillus plantarum bmz123306)和0.1mm的无菌na2seo3添加到50ml无菌lb培养基中。在发酵反应初期，使培养基的ph维持在7附近。反应结束时，由于产生的元素硒(se0)。以10000rpm离心10分钟从反应混合物中分离出纳米se，并用蒸馏水洗涤数次，所有收获的样品都存储在
‑
4℃下备用。纳米硒的zeta电位图，如图1(a)所示。
43.实施例3
44.天然硒
‑
no型壳聚糖纳米颗粒(se
‑
nocs
‑
nps)制备过程：
45.将100μg的天然硒纳米颗粒在155000g离心10min，再将其分散在1ml含有2mg/ml的内生no型壳聚糖水溶液中，经过8h的充分接触后，继续在155000g离心10min，重新分散入1ml的pbs缓冲液中，4℃储藏备用。天然硒
‑
no型壳聚糖纳米颗粒(se
‑
nocs
‑
nps)的透射电镜图，如图1(b)所示。
46.实施例4
47.低盐花椰菜熟制品的制作包括以下步骤：
48.一定量花椰菜于醋中浸泡一晚，沥干后放入锅中，加适量食用油、红椒、蒜和少量的盐和适量调味品炒至成熟。
49.该天然硒
‑
no型壳聚糖纳米颗粒(se
‑
nocs
‑
nps)的应用包括以下步骤：
50.(1)按上述重量配比配制0.05g天然硒
‑
no型壳聚糖纳米颗粒(se
‑
nocs
‑
nps)保鲜剂。
51.(2)在质量为500g的低盐花椰菜熟制品起锅前加入上述保鲜剂，充分混匀，放入包装袋中，真空包装或者气调包装。
52.(3)将包装好的低盐花椰菜熟制品进行冷藏，冷藏温度为1～4℃。
53.(4)上述方法所得产品贮藏期约10天。
54.得到的熟制花椰菜中的菌落数变化曲线见图2。
55.实施例5
56.低盐花椰菜熟制品的制作包括以下步骤：
57.一定量花椰菜于醋中浸泡一晚，沥干后放入锅中，加适量食用油、红椒、蒜和少量的盐和适量调味品炒至成熟。
58.该天然硒
‑
no型壳聚糖纳米颗粒(se
‑
nocs
‑
nps)保鲜剂的应用包括以下步骤：
59.(1)按上述重量配比配制0.1g天然硒
‑
no型壳聚糖纳米颗粒(se
‑
nocs
‑
nps)保鲜剂。
60.(2)在质量为500g的低盐花椰菜熟制品起锅前加入上述保鲜剂，充分混匀，放入包装袋中，真空包装或者气调包装。
61.(3)将包装好的低盐花椰菜熟制品进行冷藏，冷藏温度为1～4℃。
62.(4)上述方法所得产品贮藏期达到30～90天。
63.得到的熟制花椰菜中的菌落数变化曲线见图2。
64.实施例6
65.低盐花椰菜熟制品的制作包括以下步骤：
66.一定量花椰菜于醋中浸泡一晚，沥干后放入锅中，加适量食用油、红椒、蒜和少量的盐和适量调味品炒至成熟。
67.该含天然精油纳米脂质体的生物复合保鲜剂的应用包括以下步骤：
68.(1)按上述重量配比配制0.2g保鲜剂。
69.(2)在质量为500g的低盐花椰菜熟制品起锅前加入上述保鲜剂，充分混匀，放入包装袋中，真空包装或者气调包装。
70.(3)将包装好的低盐花椰菜熟制品进行冷藏，冷藏温度为1～4℃。
71.(4)上述方法所得产品贮藏期超过90天。
72.得到的低盐花椰菜熟制品中的菌落数变化曲线见图2。
73.得到的低盐花椰菜熟制品的外观见图3。
74.相比于未添加复合保鲜剂的样品，其外观随着存储时间的延长没有较大的变化，且花椰菜的质地、脆性变化较小。在观察的时间范围内(30
‑
90天)，产品颜色未发生明显变化，浅黄色。但空白对照组，10天后，产品颜色明显变暗，90天后，产品颜色变化更为明显，已无法接受。
75.实施例7
76.上述实施例4～6中的样品，4℃放置90天后，样品用于感官评价测定。用于感官品评，由20人组成品评小组，分别从花椰菜的脆性、颜色、气味、口味、酸度对其进行评分并做出综合评价，最高得分9分，最低得分0分，平均综合得分4.5分，以下视为感官评不可接受。
77.得到的低盐花椰菜熟制品各指标感官品评结果，见图3。
78.对照例
79.参照实施例4中保鲜剂的应用，但是不进行步骤(2)中保鲜剂的处理步骤，直接进行包装和贮藏。得到的产品的菌落数变化见图2。
80.参照实施例4中保鲜剂的应用，但是不进行步骤(2)中保鲜剂的处理步骤，直接进行包装和贮藏。得到的产品存储90天后，样品的各指标感官品评结果见图2。
81.参照实施例4中保鲜剂组合物的应用，但是不进行步骤(2)中保鲜剂的处理步骤，直接进行包装和贮藏。得到的产品外观情况见图4。