用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用的制作方法

技术特征：
1.用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合，其特征在于：包括与膀胱癌人群早期甲基化位点相关的4对靶标特异引物及对应的内参引物、特异性引物探针；其中所述4对靶标特异引物的序列如下：seq id no.1fccgcgctcacgtcggttcc，seq id no.1rccccctacttcccagctcacga；seq id no.2ftcctatcctcatcggttctcgtact，seq id no.2raattgtccaacgaatgcacctg；seq id no.3fcccgcacactactccaaatcaa，seq id no.3rgcaaaatcgagggcagctgaag；seq id no.4fcagcgcgtgtccttcttcgcctg，seq id no.4ragttctcgagcgtgccaccgttg；内参引物的序列如下：seq id no.5fgacccgcgcttcgacaccg，seq id no.5rccagcgtcgcgtgcttctc。2.根据权利要求1所述的用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合，其特征在于所述特异性引物探针序列如下：seq id no.1pfam
‑ꢀ
atgacccctctccaaacggcgcag
‑
bhq1，seq id no.2pfam
‑ꢀ
aaaagtctgcgcgtgagcct
‑
bhq1；seq id no.3pfam
‑ꢀ
ccactaagagttcctcccgcgcaga
‑
bhq1，seq id no.4pfam
‑ꢀ
cctcgccgcatccgctcagcc
‑
bhq1；内参引物探针序列如下：seq id no.5pvic
‑
ccaggctctgcttgtgcgtcacca
‑
bhq1。3.用于膀胱癌早期筛查的试剂盒，其特征在于：包括权利要求1或2所述的用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合及甲基化敏感内切酶体系。4.根据权利要求3所述用于膀胱癌早期筛查的试剂盒，其特征在于：所述甲基化敏感内切酶体系包含hinp1i、hpaii、acii、hpych4iv。5.根据权利要求3所述的试剂盒在制备膀胱癌早期筛查试剂中的应用，其特征在于所述筛查方法包括以下步骤：s1.提取尿液中游离的cfdna；s2.将cfdna与甲基化敏感内切酶体系在37℃下孵育；s3.将孵育产物作为模板，加入4对靶标特异引物及内参引物，进行多重pcr扩增；s4.将扩增产物作为模板，加入4对靶标特异引物、4个特异性引物探针及内参引物，进行qpcr检测反应；s5.根据4对靶标特异引物与内参引物的ct值之差δct，评估膀胱癌风险。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述s1具体为：采用qiagen尿液游离dna提取试剂盒提取尿液中的cfdna。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述s3的扩增程序为：98℃/45 s，1个循环；98℃/15 s，55℃/30 s，72℃/30 s，12个循环； 72℃/1 min，1cycles；4℃/hold。8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述s4的qpcr检测反应程序为：95℃/3min，
1个循环；98℃/15 s， 60℃/60 s，45个循环。9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述s5的评估方式为：δct=内参引物扩增ct值
‑
4对引物特异扩增ct值；δct>
‑
2.7 膀胱癌高风险；δct≤
‑
2.7膀胱癌低风险。

技术总结
本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用，用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合，包括与膀胱癌人群早期甲基化位点相关的4对靶标特异引物及对应的内参引物、特异性引物探针。与现有技术相比，本发明基于DNA甲基化的检测，简单易行、判读客观，避免了人为判读结果的主观性，提高了准确率；同时本发明的检测方法具有非侵入性，能避免膀胱镜检查引发的并发症，提高患者依随性，用于肿瘤的早期筛查、早期诊断、疗效评价和追踪以及预后评估。疗效评价和追踪以及预后评估。疗效评价和追踪以及预后评估。


技术研发人员：张怡然 王冰 商宇红 牛春影 顾丽清 王天阳
受保护的技术使用者：北京求臻医疗器械有限公司
技术研发日：2021.09.14
技术公布日：2021/10/23