贝莱斯芽孢杆菌菌株及其用途的制作方法

1.本发明涉及一种贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)kl
‑
2菌株及其应用。


背景技术：

2.植物病原真菌引起的腐败是水果和蔬菜采后损失的主要原因之一。发达国家果蔬采后病原真菌造成的损失约占20％～25％；而在发展中国家，由于储存和运输设施不足，采后的损失往往更为严重甚至达到50％以上。
3.国内外在果蔬采后保鲜方面主要从以下几个方面进行防控研究：(1)物理防治，通过热处理、冷藏、气调和紫外照射处理等物理方法来抑制病原菌的侵染；(2)化学防治，通过使用农药等化学杀菌剂来抑制病原菌的生长，是效果显著的一种方式，但长期及不合理地使用化学杀菌剂不但容易引起真菌的耐药性，更容易对人体和环境造成危害；(3)生物防治，利用生防微生物或其代谢产物控制病原微生物增殖。
4.在果蔬采前、采后的综合管理中，生防微生物作为生物防治剂的使用非常重要，已被广泛应用于农作物的病害防控，也是当今微生物生态防控的研究热点。生防微生物通过与病原菌竞争营养和空间、产生抗菌性物质、诱导植物产生抗病性和寄生作用来抑制病原菌，这种方法在短期、中期和长期都是有效的，并且不会对环境和人畜造成伤害。
5.贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)是芽孢杆菌属的一个新种，能够产生多种次级代谢产物，并且具有潜在的抑菌活性和促进植物生长作用。但目前贝莱斯芽孢杆菌菌株应用于果蔬采后防腐保鲜的应用仍然较少，尚无成熟应用方案。因此，基于贝莱斯芽孢杆菌的生防特性，提供一种来源安全、对生态环境无害、培养条件简单的生防菌株，对果蔬采后保鲜具有重要的生防意义。


技术实现要素：

6.本发明的目的之一在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌株(bacillus velezensis)。该生防菌可利用拮抗作用在果蔬采后保鲜中发挥作用，是一种绿色环保、无毒无害的微生物防治方法，具有广阔的市场前景。
7.本发明的目的之二在于提供该菌株的培养方法。
8.本发明的目的之三在于提供该菌株在抑制病原微生物增殖中的应用。
9.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
10.一种贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于该该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)kl
‑
2，于2019年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为cctcc no:m 2019817。
11.上述的贝莱斯芽孢杆菌菌株，其特征在于该贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)kl
‑
2的16s rdna为seq id no.1所示的碱基序列。
12.一种培殖上述的贝莱斯芽孢杆菌菌株的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将贝莱斯芽孢杆菌菌株接种于lb培养液中，所述的培养液的ph＝5～9，培养温度为：20～50
℃，12～24h内处于稳定生长期。
13.一种上述的贝莱斯芽孢杆菌菌株在抑制抑制病原微生物增殖中的应用。
14.上述的贝莱斯芽孢杆菌菌株在抑制抑制病原微生物增殖中的应用，其特征在于所述的病原微生物为：极细链格孢菌、黑曲霉、青霉菌、拟康宁木霉、盐生枝孢霉、子囊菌、胶孢炭疽菌、桃褐腐菌、番茄灰霉菌、桃青霉菌、柑桔指状青霉、荔枝胶孢炭疽菌或杏交链孢霉菌。
15.本发明的贝莱斯芽孢杆菌菌株，经16s rdna菌种鉴定，该菌种为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)，保藏名称为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)kl
‑
2，已于2019年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为：cctcc no:m 2019817，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
16.本发明的贝莱斯芽孢杆菌kl
‑
2是革兰氏染色阴性菌，菌体细胞呈短杆状，菌落形态呈规则圆形，边缘整齐，淡黄色无光泽，不透明，分离自上海某蔬菜原种场采摘的樱桃番茄成熟红果。
17.本发明的贝莱斯芽孢杆菌kl
‑
2的v
‑
p试验呈阳性反应，不能利用柠檬酸盐、丙酸盐，能利用d
‑
木糖、l
‑
阿拉伯糖、d
‑
甘露醇，能液化明胶，在7％naci不可以生长，ph5.7可以生长，硝酸盐还原反应呈阳性，能水解淀粉，无法在厌氧条件下生长。
18.本发明的贝莱斯芽孢杆菌kl
‑
2对引起樱桃番茄采后病害的极细链格孢菌、黑曲霉、青霉菌、拟康宁木霉、盐生枝孢霉、子囊菌和胶孢炭疽菌皆有明显的抑制作用；但对尖侧多隔孢霉没有抑制作用。
19.本发明的贝莱斯芽孢杆菌kl
‑
2对引起其他果蔬采后病害的桃褐腐菌、番茄灰霉菌、桃青霉菌、柑桔指状青霉、荔枝胶孢炭疽菌、杏交链孢霉菌皆有抑制作用，且抑制率均高于58％，其中对桃褐腐菌的抑制率最大为80％。
20.本发明的贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)kl
‑
2来源于樱桃番茄成熟红果，比其他来源更加安全；不但能够抑制樱桃番茄的多种病原菌，还能对其他果蔬常见病原菌有较好的抑制性，说明其具有广谱抑菌性，防病效果理想，为果蔬生物防治提供了菌种资源，具有较好的应用前景。
附图说明
21.图1为本发明的菌株kl
‑
2对病原菌的抑制率。
22.图2为菌株kl
‑
2在lb固体培养基平板培养12h后的菌落形态。
23.图3为光学显微镜下kl
‑
2的菌体形态。
24.图4为贝莱斯芽孢杆菌kl
‑
2的16s rdna序列neighbor
‑
joining系统进化树。
25.图5为贝莱斯芽孢杆菌kl
‑
2的gyra序列neighbor
‑
joining系统进化树。
26.图6为菌株kl
‑
2的生长曲线。
27.图7为ph值对菌株kl
‑
2生长的影响。
28.图8为温度对菌株kl
‑
2生长的影响。
29.图9为菌株kl
‑
2的抑菌效果。
具体实施方式
30.下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明中所述的室温是指进行试验的操作间的温度，一般为25℃。
31.(一)本发明所用到的病原菌：极细链格孢菌(alternaria tenuissima)，黑曲霉(aureobasidium melanogenum)，青霉菌(penicillium oxalicum)，尖侧多隔孢霉(pleurophragmium acutum)，拟康宁木霉(trichoderma koningiopsis)，盐生枝孢霉(cladosporium halotolerans)，子囊菌(ascomycota)，胶孢炭疽菌(colletotrichum gloeosporioides)均由上海大学生命科学学院食品质量与安全控制实验室筛选分离自樱桃番茄并保存。桃褐腐菌(monilinia fructicola)，番茄灰霉菌(botrytis cinerea)来自上海大学生命科学学院食品质量与安全控制实验室；桃青霉菌(penicillium)、柑桔指状青霉(penicilium digitatum)、杏交链孢霉(alternaria)购自中国林业微生物菌种保藏管理中心；荔枝胶孢炭疽菌(colletotrichum gloeosporioides)来自中国热带农业科学院环境与植物保护研究所。
32.(二)本发明所用到的培养基
33.lb培养基：5g牛肉浸膏、5g酵母浸膏、5g氯化钠、18g琼脂、10g鱼粉蛋白胨、1l水。
34.lb液体培养基：5g牛肉浸膏、5g酵母浸膏、5g氯化钠、10g鱼粉蛋白胨、1l水。
35.pda培养基：200g去皮马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂、1l水。
36.实施例一生防菌株的筛选
37.1实验方法
38.1.1菌株的分离和纯化
39.称取10g来自上海某蔬菜原种场采摘的樱桃番茄成熟红果样品，加入90mllb液体培养基中，37℃，150r/min震荡培养48h。然后吸取1ml菌液，用灭菌蒸馏水将浓度稀释成10
‑1至10
‑7，分别取10
‑5、10
‑6、10
‑7梯度稀释液0.1ml于lb培养基涂布，于37℃下培养24h后，将平板上的单菌落划线到其他新鲜平板上进行菌种的纯化。重复3次。
40.1.2初筛
41.取极细链格孢菌病原菌菌块置于pda平板中央，在距离病原菌菌块2cm两侧点接纯化的待筛选细菌，在28℃恒温培养箱中培养4d，观察菌落生长情况，筛选出产生抑菌圈且对病原菌表现抑制的菌株。
42.1.3复筛
43.取八种病原菌菌块置于pda平板中央，用接种环挑取有抑菌效果的细菌点接在距平板中央3cm处的4个角点上，放入培养箱28℃恒温培养4d，以只接种病原菌的pda平板培养基作对照，观察病原菌的生长状态，测量病原菌菌落直径，并按下述公式计算菌株的抑制率。
44.抑制率(％)＝(对照组菌落直径
‑
处理组菌落直径)/对照组菌落直径
×
100％
45.2实验结果与分析
46.以樱桃番茄成熟红果为样本，樱桃番茄中最常见的病原真菌极细链格孢菌为指示菌，通过平板拮抗试验，从樱桃番茄成熟红果上筛选得到一株抑菌效果明显的拮抗细菌，将其命名为kl
‑
2。菌株kl
‑
2对上述八种病原菌的抑制效果如图1所示。对极细链格孢菌、黑曲
霉、青霉菌、拟康宁木霉、盐生枝孢霉、子囊菌和胶孢炭疽菌，菌株kl
‑
2皆有明显的抑制作用；但对于尖侧多隔孢霉没有抑制作用，说明菌株kl
‑
2可以抑制番茄中的多种病原菌。
47.实施例2菌株kl
‑
2的鉴定
48.1实验方法
49.1.1形态特征鉴定
50.将菌株kl
‑
2在lb平板上划线，37℃培养12h，观察菌落的颜色、形态、透明度等特征，并通过使用光学显微镜和革兰氏染色观察细胞形态。
51.1.2生理生化特性鉴定
52.将菌株kl
‑
2进行v
‑
p试验、柠檬酸盐利用、丙酸盐利用、d
‑
木糖利用、l
‑
阿拉伯糖利用、d
‑
甘露醇利用、明胶液化试验、7％nacl生长、ph 5.7生长、硝酸盐还原、淀粉水解、厌氧性测定。重复三次。
53.1.3分子生物学鉴定
54.将菌株kl
‑
2送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，测序后将测序结果输入ncbi数据库进行同源性分析。利用blast软件进行比对，利用mega7.0软件构建系统进化树。
55.gyra基因使用对应的通用引物(表1)进行pcr扩增，gyra
‑
f gyra
‑
r引物对的pcr反应程序为:95℃预变性5min；95℃变性45s,57℃退火45s,72℃延伸80s,35个循环；72℃延伸10min。pcr扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序产物上传于ncbi，在ncbi中进行blast同源性比对。选择菌株序列的最高相似性序列和模式菌株的序列为参考序列，利用mega7.0中clustalw进行多序列比对。使用n
‑
j法构建系统进化树。重复抽样1000次分析系统树各分支的置信度。
56.表1 pcr引物序列
[0057][0058]
2实验结果与分析
[0059]
2.1形态学鉴定
[0060]
菌株kl
‑
2形态特征为：革兰氏染色阴性菌，菌体细胞呈短杆状，菌落形态呈规则圆形，边缘整齐，淡黄色无光泽，不透明，如图2和图3所示。
[0061]
2.2生理生化鉴定
[0062]
菌株kl
‑
2生理生化特性结果如表2所示。
[0063]
表2贝莱斯芽孢杆菌kl
‑
2生理生化特性
[0064][0065]
注：“ ”表示阳性，
“‑”
表示阴性。
[0066]
2.3分子生物学鉴定
[0067]
首先菌株kl
‑
2通过16s rdna片段序列对比，与已知菌株贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)的部分序列同源性达99％以上。16s rdna是目前细菌分类鉴定的“公认尺子”，一般相似性高于98％以上可认为是一个属。但16s rdna序列无法区分鉴定芽孢杆菌属内的近缘物种，而通过序列变异程度更大的管家基因(gyra)的单基因系统进化分析，可在种或亚种水平上对芽孢菌进行有效区分。如图4是基于16s rdna基因序列的系统进化树，结果显示菌株kl
‑
2与贝莱斯芽孢杆菌(mk780002.1)的遗传距离最近；如图5是基于gyra基因序列的系统进化树，结果显示菌株kl
‑
2与贝莱斯芽孢杆菌(nz_cp011937.1)的遗传距离最近，综合菌体形态、菌落特征及生理生化指标的测定结果，将其鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(bacillus velezensis)。1483bp序列如下：
[0068]
tcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcagacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgc
aactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgt
[0069]
所述菌株bacillus velezensis kl
‑
2，已于2019年10月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(cctcc)，保藏编号为：cctcc no:m 2019817，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。
[0070]
实施例3贝莱斯芽孢杆菌kl
‑
2的培养条件
[0071]
1实验方法
[0072]
1.1制备种子培养液
[0073]
将在lb固体培养基上预先活化的菌株kl
‑
2接入灭菌后的lb液体培养基中，在37℃、150r/min培养24h，用无菌蒸馏水将浓度调至1
×
108cfu/l，即为菌株kl
‑
2的种子培养液。
[0074]
1.2测定生长曲线
[0075]
接种1ml种子培养液到100ml lb液体培养基中，放置于37℃，150r/min的摇床中培养。取菌体培养液5ml，每隔3h用分光光度计在600nm波长下测吸光度，观察曲线情况，至少测至48h。重复三次。
[0076]
1.3测定最适生长ph值
[0077]
用naoh将lb液体培养基分别调至100mlph值为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，灭菌后分别接种1ml种子培养液于100ml调至不同ph的lb液体培养基中，于37℃，150r/min的摇床中培养，48h后用紫外可见分光光度计在600nm波长下测其吸光度。重复三次。
[0078]
1.4测定最适生长温度
[0079]
接种1ml种子培养液于100mlph为7.0的lb液体培养基中，于20℃、28℃、300℃、37℃、40℃、45℃、50℃，150r/min的摇床中培养，48h后用分光光度计在600nm波长下测其吸光度。重复三次。
[0080]
2实验结果与分析
[0081]
2.1菌株kl
‑
2的生长曲线
[0082]
菌株kl
‑
2的生长曲线如图6所示，菌株kl
‑
2在接种到lb培养液后的12h内处于对数生长期，12～24h内处于稳定生长期，接种24h后进入衰老期。
[0083]
2.2 ph对菌株kl
‑
2生长的影响
[0084]
ph对菌株kl
‑
2的影响如图7所示，菌株kl
‑
2在较大ph范围内都能生长，但ph值对菌株kl
‑
2生长影响明显，其中ph＝5～9适宜菌株kl
‑
2的生长，最适ph在7.0左右。
[0085]
2.3温度对菌株kl
‑
2生长的影响
[0086]
温度对菌株kl
‑
2的影响如图8所示，温度对菌株kl
‑
2生长和繁殖有明显的影响，在20～50℃范围内，菌株kl
‑
2生长和繁殖速率呈先上升后下降趋势，最适温度为30℃左右。
[0087]
实施例4贝莱斯芽孢杆菌kl
‑
2在生防领域的应用
[0088]
1实验方法
[0089]
取六种病原菌菌块置于pda平板中央，用接种环挑取菌株kl
‑
2点接在距平板中央3cm处的4个角点上，放入培养箱28℃恒温培养4d，每组处理做三个平行，试验重复两次。以只接种病原菌的pda平板培养基作对照，观察病原菌的生长状态，测量病原菌菌落直径，计
算菌株的抑制率。
[0090]
抑制率(％)＝(对照组菌落直径
‑
处理组菌落直径)/对照组菌落直径
×
100％
[0091]
2实验结果与分析
[0092]
为研究贝莱斯芽孢杆菌kl
‑
2的生防效力，选择桃褐腐菌、番茄灰霉菌、桃青霉菌、柑桔指状青霉、荔枝胶孢炭疽菌、杏交链孢霉这六种指示菌，研究菌株kl
‑
2对果蔬采后病原菌的影响。如图9所示，菌株kl
‑
2对六种病原菌都有明显的抑制作用，抑制效果最明显的是对桃褐腐菌，其抑制率可以达到80％；紧随其后的是桃青霉，对桃青霉的抑制率可以达到77％；随后是番茄灰霉病、荔枝胶孢炭疽菌、杏交联孢霉，对这三种病原菌的抑制率分别为66％、69％、62％，抑制率皆在60％以上，最后对柑桔指状青霉的抑制效果略弱于前几种病原菌，但是抑制率也达到了54％。这说明菌株kl
‑
2可以抑制多种引发果蔬病害的病原真菌，具有广谱抑菌性。