用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用的制作方法

1.本发明涉及分子生物技术领域，特别涉及用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用。


背景技术：

2.膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在中国膀胱癌的2014 年发病人数为7.8 万人/年，并且发病率有逐年上升的趋势。膀胱癌具有发病率高、易复发的特点。血尿为膀胱癌的常见临床症状，其中约17% 的血尿患者检出膀胱癌。目前，膀胱癌的主要诊断方法包括影膀胱镜检查、尿脱落细胞学检查、尿液fish检测及肿瘤标记物检查。其中，膀胱镜检查结合活检组织病理为膀胱镜诊断的金标准，但是该检查方法具有侵入性，容易产生并发症，患者依随性低。而影像学检查对千微小病灶的诊断能力有限，尿脱落细胞学检查的灵敏度低，尿液fish检测操作复杂、判读结果具有主观性。现有肿瘤标记物检查主要基于尿液中的特定蛋白质的存在进行检测，但由于尿液中测定蛋白的含量低，敏感性及特异性仍然具有局限性。


技术实现要素：

3.针对以上述背景技术的不足，本发明提供一种用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合、试剂盒及应用，解决了膀胱癌检测敏感度低，特异性差，避免膀胱镜检查引发的并发症的问题。
4.本发明采用的技术方案如下：用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合，关键在于：包括与膀胱癌人群早期甲基化位点相关的4对靶标特异引物及对应的内参引物、特异性引物探针；其中所述4对靶标特异引物的序列如下：seq id no.1fccgcgctcacgtcggttcc，seq id no.1rccccctacttcccagctcacga；seq id no.2ftcctatcctcatcggttctcgtact，seq id no.2raattgtccaacgaatgcacctg；seq id no.3fcccgcacactactccaaatcaa，seq id no.3rgcaaaatcgagggcagctgaag；seq id no.4fcagcgcgtgtccttcttcgcctg，seq id no.4ragttctcgagcgtgccaccgttg；内参引物的序列如下：seq id no.5fgacccgcgcttcgacaccg，seq id no.5rccagcgtcgcgtgcttctc。
5.优选的，所述特异性引物探针序列如下：seq id no.1pfam
‑ꢀ
atgacccctctccaaacggcgcag
‑
bhq1，seq id no.2pfam
‑ꢀ
aaaagtctgcgcgtgagcct
‑
bhq1；
seq id no.3pfam
‑ꢀ
ccactaagagttcctcccgcgcaga
‑
bhq1，seq id no.4pfam
‑ꢀ
cctcgccgcatccgctcagcc
‑
bhq1；内参引物探针序列如下：seq id no.5pvic
‑
ccaggctctgcttgtgcgtcacca
‑
bhq1。
6.用于膀胱癌早期筛查的试剂盒，关键在于：包括以上方案中的用于膀胱癌早期筛查的生物标志物组合及甲基化敏感内切酶体系。
7.优选的，所述甲基化敏感内切酶体系包含hinp1i、hpaii、acii、hpych4iv。
8.试剂盒在制备膀胱癌早期筛查试剂中的应用，关键在于：所述筛查方法包括以下步骤：s1.提取尿液中游离的cfdna；s2.将cfdna与甲基化敏感内切酶体系在37℃下孵育；s3.将孵育产物作为模板，加入4对靶标特异引物及内参引物，进行多重pcr扩增；s4.将扩增产物作为模板，加入4对靶标特异引物、4个特异性引物探针及内参引物，进行qpcr检测反应；s5.根据4对靶标特异引物与内参引物的ct值之差δct，评估膀胱癌风险。
9.优选的，所述s1具体为：采用qiagen尿液游离dna提取试剂盒提取尿液中的cfdna。
10.优选的，所述s3的扩增程序为：98℃/45 s，1个循环；98℃/15 s，55℃/30 s，72℃/30 s，12个循环； 72℃/1 min，1cycles；4℃/hold。
11.优选的，所述s4的qpcr检测反应程序为：95℃/3min，1个循环；98℃/15 s， 60℃/60 s，45个循环。
12.优选的，所述s5的评估方式为：δct=内参引物扩增ct值
‑
4对引物特异扩增ct值；δct>
‑
2.7 膀胱癌高风险；δct≤
‑
2.7膀胱癌低风险。
13.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：1.本发明通过深入挖掘cgac项目与公共数据库资源，筛选中国人群膀胱癌早期基因组超甲基化区域，并与白细胞基因组对应区域进行比对，选取在白细胞中低甲基化，且区域内含有ccgc, ccgg, gcgc,acgt,gcgg中至少两个位点的区域作为靶点，设计100余对引物。筛选pcr效率高，特异性强，稳定性好的引物，最终得到4对可用于判别早期膀胱癌风险的引物及对应探针序列；2. 通过膀胱癌特异性dna 甲基化生物标记物的组合，进行几千个dna 甲基化位点的检测，利用甲基化敏感内切酶不能切割甲基化位点的特性，降解非肿瘤来源cfdna，特异扩增肿瘤来源ctdna极大提升检查灵敏度，克服了单个dna 甲基化信号低的问题，提高了检测的灵敏度及特异性；3. 基于dna 甲基化的检测简单易行、判读客观，避免了人为判读结果的主观性，提高了准确率；同时该检测具有非侵入性，能避免膀胱镜检查引发的并发症，提高患者依随性，用于肿瘤的早期筛查、早期诊断、疗效评价和追踪以及预后评估。
附图说明
14.图1为基于本发明的风险判定图；图2为基于本发明的分类性能auc曲线图。
具体实施方式
15.为使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面结合附图和具体实施方式对本发明作详细说明。
16.实施例1 用于膀胱癌早期筛查的试剂盒包括qiagen尿液游离dna提取试剂盒、hinp1i、hpaii、acii、hpych4iv甲基化敏感内切酶体系、4对靶标特异引物及内参引物、4对特异性引物探针及内参引物探针；其中其中所述4对靶标特异引物的序列如下：seq id no.1fccgcgctcacgtcggttcc，seq id no.1rccccctacttcccagctcacga；seq id no.2ftcctatcctcatcggttctcgtact，seq id no.2raattgtccaacgaatgcacctg；seq id no.3fcccgcacactactccaaatcaa，seq id no.3rgcaaaatcgagggcagctgaag；seq id no.4fcagcgcgtgtccttcttcgcctg，seq id no.4ragttctcgagcgtgccaccgttg；内参引物的序列如下：seq id no.5fgacccgcgcttcgacaccg，seq id no.5rccagcgtcgcgtgcttctc。
17.所述特异性引物探针序列如下：seq id no.1pfam
‑ꢀ
atgacccctctccaaacggcgcag
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bhq1，seq id no.2pfam
‑ꢀ
aaaagtctgcgcgtgagcct
‑
bhq1；seq id no.3pfam
‑ꢀ
ccactaagagttcctcccgcgcaga
‑
bhq1，seq id no.4pfam
‑ꢀ
cctcgccgcatccgctcagcc
‑
bhq1；内参引物探针序列如下：seq id no.5pvic
‑
ccaggctctgcttgtgcgtcacca
‑
bhq1。
18.实施例2 检测ctdna甲基化水平变化的方法1. 取10 ml尿液，采用qiagen尿液游离dna提取试剂盒（cat: 954154）提取游离cfdna；2. 取20 ng cfdna与20μlhinp1i、hpaii、acii、hpych4iv四种甲基化敏感内切酶体系（终浓度10 u/μl），于37℃ 孵育16 h，80℃酶失活 20 min；3.将孵育完成的全部产物作为模板，4对靶标特异引物（每种50 nm）加1个内参引物（10 nm）配置体系，设置以下表1设定程序在普通pcr仪中进行扩增程序；表1
4. 取上步扩增产物1μl做为模板，加入4对靶标特异引物（每种0.25μm），4个特异性引物探针（每种0.1μm）加1个内参引物（0.05 μm）及内参引物探针（0.02 μm），设置以下表2设定程序在abi 7500荧光pcr仪中进行qpcr反应，每轮循环结束前采集fam及vic通道信号；表25. 根据内参引物与4对靶标特异引物的ct值之差δct，如图1所示，评估膀胱癌风险，δct=内参引物扩增ct值
‑
4对引物特异扩增ct值；δct>
‑
2.7 膀胱癌高风险，建议影像学检查；δct≤
‑
2.7膀胱癌低风险。
19.对95例健康者和71例
ⅰ‑ⅲ
期膀胱癌患者的尿液样本同时采用本发明评估膀胱癌风险性能，样本信息和测试结果如下表3所示：表3
将表3中的数据导入到graphpadprism 6.0软件中，自动生成roc曲线，并统计曲线下面积auc值（图2），横坐标为1
‑
特异度，纵坐标为敏感度，软件统计结果以δct>
‑
2.7为阈值，分类器敏感度90.91%，特异度95.24%。
20.最后需要说明，上述描述仅为本发明的优选实施例，本领域的技术人员在本发明的启示下，在不违背本发明宗旨及权利要求的前提下，可以做出多种类似的表示，这样的变换均落入本发明的保护范围之内。