一种用于重组蛋白表达的启动子及其应用的制作方法

1.本发明属于生物技术领域，具体地说，是关于一种用于大规模生物反应器和/或小规模生物反应器的重组蛋白表达的启动子及其应用。


背景技术：

2.甲基营养型毕赤酵母是应用最广泛的重组蛋白表达系统之一。迄今为止，已通过该系统成功表达了5000多种蛋白质。大多数情况下，蛋白质表达依赖于甲醇诱导型启动子p
aox1
(酒精氧化酶i启动子)。此外，gap启动子(p
gap
)是最常见无需诱导的组成型启动子。
3.除p
aox1
和p
gap
外，毕赤酵母中还报道了一些其他启动子，例如谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶启动子(p
fld1
)和二羟基丙酮合酶启动子(p
das
)。prielhofer等人鉴定了p
g1
和p
g6
，它们由低浓度葡萄糖诱导并被甘油抑制。除诱导型启动子外，还报道了一些组成型启动子，包括翻译延伸因子1(tef1)启动子、gtpase(ypt1)启动子和潜在的糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白(gcw14)启动子。ahmad、hirz、pichler和schwab提供了来源于毕赤酵母中的上述启动子的总结(protein expression in pichia pastoris:recent achievementsand perspectives for heterologous protein production)。然而，由于表达强度、诱导条件和调节严格性方面的各种缺陷，这些启动子并未得到广泛使用。例如，p
fld1
的诱导不仅需要甲醇作为唯一碳源，还需要硫酸铵作为氮源；许多启动子如p
g1
、p
g6
和少数组成型启动子的强度不足以支持大规模的重组蛋白表达。因此，启动子在毕赤酵母中的应用相当有限，这就需要筛选其他新的强启动子。


技术实现要素：

4.为鉴定新的诱导型或组成型启动子，本发明基于三种不同碳源(葡萄糖、甘油和甲醇)条件下的毕赤酵母野生型gs115菌株rna
‑
seq数据和mrna折叠自由能(δg)选择了 16个候选启动子。在这些启动子后插入gfp报告基因和重组α
‑
淀粉酶以测试它们的表达强度和诱导能力。最后，本发明确定了两个有希望用于重组蛋白表达的新型启动子：甲醇诱导型启动子p
0547
和组成型启动子p
0472
。经实验，使用α
‑
淀粉酶作为报告蛋白， p
0547
和p
0472
的启动子强度在摇瓶实验中与p
aox1
和p
gap
相当，但在补料分批培养中分别比 p
aox1
和p
gap
高5
‑
10％和25
‑
30％。
5.因此本发明的第一个目的在于提供一种用于大规模生物反应器和/或小规模生物反应器的重组蛋白表达的甲醇诱导型启动子p
0547
和组成型启动子p
0472
。
6.本发明的第二个目的在于提供一种甲醇诱导型启动子p
0547
或组成型启动子p
0472
在大规模生物反应器和/或小规模生物反应器的重组蛋白表达中的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
8.作为本发明的第一个方面，一种重组蛋白表达的甲醇诱导型启动子p
0547
，所述甲醇诱导型启动子p
0547
的基因组dna序列包括如ncbi登录号为nc_012963.1的5’端起第 2416633位至第2417632位所示的碱基序列。
9.作为本发明的第二个方面，一种用于重组蛋白表达的组成型启动子p
0472
，所述组成型启动子p
0472
的基因组dna序列是如ncbi登录号为nc_012964.1的5’端起第874193 位至第875192位所示的碱基序列。
10.作为本发明的第三个方面，一种甲醇诱导型启动子p
0547
或组成型启动子p
0472
在大规模生物反应器和/或小规模生物反应器的重组蛋白表达中的应用。
11.根据本发明，所述大规模生物反应器为3
‑
5l的生物反应器。
12.根据本发明，所述小规模生物反应器为≥0.1l且小于3l的生物反应器。
13.根据本发明，所述甲醇诱导型启动子p
0547
的基因组dna序列是如ncbi登录号为 nc_012963.1的5’端起第2416633位至第2417632位所示的碱基序列；所述组成型启动子p
0472
的基因组dna序列是如ncbi登录号为nc_012964.1的5’端起第874193位至第875192位所示的碱基序列。
14.作为本发明的第四个方面，一种gs115
‑
启动子
‑
gfp表达菌株，其是以引物序列分别如seq id no.3和seq id no.6所示的pagr1和pgfpf2为引物扩增绿色荧光蛋白gfp 表达框，通过一步克隆试剂盒将gfp片段、p
0547
启动子片段连接至ppic 9k载体中构建获得；或者，其是以引物序列分别如seq id no.3和seq id no.6所示的pagr1和pgfpf2 为引物扩增绿色荧光蛋白gfp表达框，通过一步克隆试剂盒将gfp片段、p
0472
启动子片段连接至ppic 9k载体中构建获得，其中，所述p
0547
启动子片段的dna序列是如ncbi 登录号为nc_012963.1的5’端起第2416633位至第2417632位所示的碱基序列，所述 p
0472
启动子片段的dna序列是如ncbi登录号为nc_012964.1的5’端起第874193位至第875192位所示的碱基序列。
15.作为本发明的第五个方面，一种gs115
‑
启动子
‑
amy表达菌株，其是通过pcr扩增重组α
‑
淀粉酶表达框，并与启动子片段p
0472
一起连接到ppic 9k载体构建获得；或者，其是通过pcr扩增重组α
‑
淀粉酶表达框，并与启动子片段p
0547
一起连接到ppic 9k载体构建获得，其中，所述p
0547
启动子片段的dna序列是如ncbi登录号为nc_012963.1 的5’端起第2416633位至第2417632位所示的碱基序列，所述p
0472
启动子片段的dna 序列是如ncbi登录号为nc_012964.1的5’端起第874193位至第875192位所示的碱基序列。
16.作为本发明的第六个方面，一种上述所述的gs115
‑
启动子
‑
gfp表达菌株或gs115
‑ꢀ
启动子
‑
amy表达菌株在大规模生物反应器和/或小规模生物反应器的重组蛋白表达中的应用。
17.根据本发明，所述大规模生物反应器为3
‑
5l的生物反应器。
18.根据本发明，所述小规模生物反应器为≥0.1l且小于3l的生物反应器。
19.本发明的甲醇诱导型启动子p
0547
和组成型启动子p
0472
，其有益效果：
20.1、甲醇诱导型启动子p
0547
和组成型启动子p
0472
均可以用于大规模生物反应器的重组蛋白表达，同时也可以用于小规模生物反应器的重组蛋白表达，是毕赤酵母中良好的诱导型或组成型启动子。
21.2、gs115
‑
启动子
‑
gfp表达菌株或gs115
‑
启动子
‑
amy表达菌株可以用于大规模生物反应器的重组蛋白表达，同时也可以用于小规模生物反应器的重组蛋白表达，是毕赤酵母中良好的诱导型或组成型启动子表达菌株。
附图说明
22.图1为实施例4所述的5个候选启动子的gs115
‑
启动子
‑
gfp报告基因在不同碳源下的荧光强度。
23.图2为实施例1所述的16个候选启动子中除实施例4所述5个外剩余11个具有潜在有效性候选启动子的gs115
‑
启动子
‑
gfp报告基因在不同碳源下的荧光强度。
24.图3为gs115
‑
启动子
‑
gfp基因在不同碳源条件下的转录水平。
25.图4为候选启动子与常见启动子的强度比较。
26.图5为候选启动子的gs115
‑
启动子
‑
amy表达菌株在不同碳源和时间下的淀粉酶活性。
27.图6为p
0374
、p
0547
和p
aox1
在甲醇下的表达强度比较。
28.图7为5l生物反应器中候选启动子的表达能力分析。
具体实施方式
29.以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或厂商提供的条件进行。
30.除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
31.1、以下实施例的引物序列，见表1。
32.表1引物序列
33.[0034][0035]
2、毕赤酵母中候选启动子列表，见表2。
[0036]
表2毕赤酵母中候选启动子
[0037]
[0038][0039]
3、毕赤酵母中候选启动子序列，见表3。
[0040]
启动子启动子序列(ncbi)p
0374
chromosome:3；nc_012965.1(729544..730543)p
0043
chromosome:4；nc_012966.1(92081..93080)p
0547
chromosome:1；nc_012963.1(2416633..2417632)p
0099
chromosome:3；nc_012965.1(211600..212599)p
0319
chromosome:1；nc_012963.1(1162600..1163599)p
0016
chromosome:2；nc_012964.1(31010..32009)p
0065
chromosome:2；nc_012964.1(2255592..2256591)p
0090
chromosome:1；nc_012963.1(1570910..1571909)p
0188
chromosome:3；nc_012965.1(381287..382286)p
0769
chromosome:2；nc_012964.1(1464321..1465320)p
0072
chromosome:1；nc_012963.1(679765..680764)p
0440
chromosome:3；nc_012965.1(855281..856280)p
0428
chromosome:2；nc_012964.1(785382..786381)p
0122
chromosome:1；nc_012963.1(228631..229630)p
0200
chromosome:2；nc_012964.1(2011923..2012922)p
0472
chromosome:2；nc_012964.1(874193..875192)
[0041]
4、生物材料来源
[0042]
(1)商品化质粒和菌株用于基因克隆。质粒ppic 9k，菌株e.coli top 10，pichiapastoris gs115均购自于invitrogen公司。
[0043]
(2)p
aox1
的序列如seq id no.52所示。
[0044]
gatctaacatccaaagacgaaaggttgaatgaaacctttttgccatccgacatccacaggtccattctcac acataagtgccaaacgcaacaggaggggatacactagcagcagaccgttgcaaacgcaggacctccactcct
ctt ctcctcaacacccacttttgccatcgaaaaaccagcccagttattgggcttgattggagctcgctcattccaatt ccttctattaggctactaacaccatgactttattagcctgtctatcctggcccccctggcgaggttcatgtttgt ttatttccgaatgcaacaagctccgcattacacccgaacatcactccagatgagggctttctgagtgtggggtca aatagtttcatgttccccaaatggcccaaaactgacagtttaaacgctgtcttggaacctaatatgacaaaagcg tgatctcatccaagatgaactaagtttggttcgttgaaatgctaacggccagttggtcaaaaagaaacttccaaa agtcggcataccgtttgtcttgtttggtattgattgacgaatgctcaaaaataatctcattaatgcttagcgcag tctctctatcgcttctgaaccccggtgcacctgtgccgaaacgcaaatggggaaacacccgctttttggatgatt atgcattgtctccacattgtatgcttccaagattctggtgggaatactgctgatagcctaacgttcatgatcaaa atttaactgttctaacccctacttgacagcaatatataaacagaaggaagctgccctgtcttaaacctttttttt tatcatcattattagcttactttcataattgcgactggttccaattgacaagcttttgattttaacgacttttaa cgacaacttgagaagatcaaaaaacaactaattattcgaaacg，seq id no.52。
[0045]
(3)p
gap
的序列如seq id no.53所示
[0046]
tttttgtagaaatgtcttggtgtcctcgtccaatcaggtagccatctctgaaatatctggctccgttgcaa ctccgaacgacctgctggcaacgtaaaattctccggggtaaaacttaaatgtggagtaatggaaccagaaacgtc tcttcccttctctctccttccaccgcccgttaccgtccctaggaaattttactctgctggagagcttcttctacg gcccccttgcagcaatgctcttcccagcattacgttgcgggtaaaacggaggtcgtgtacccgacctagcagccc agggatggaaaagtcccggccgtcgctggcaataatagcgggcggacgcatgtcatgagattattggaaaccacc agaatcgaatataaaaggcgaacacctttcccaattttggtttctcctgacccaaagactttaaatttaatttat ttgtccctatttcaatcaattgaacaactat，seq id no.53。
[0047]
(4)绿色荧光蛋白(gfp)表达框的序列如seq id no.54所示
[0048]
atgggttctaaaggtgaagaattattcactggtgttgtcccaattttggttgaattagatggtgatgttaa tggtcacaaattttctgtctccggtgaaggtgaaggtgatgctacttacggtaaattgaccttaaaatttatttg tactactggtaaattgccagttccatggccaaccttagtcactactttcggttatggtgttcaatgttttgcgag atacccagatcatatgaaacaacatgactttttcaagtctgccatgccagaaggttatgttcaagaaagaactat ttttttcaaagatgacggtaactacaagaccagagctgaagtcaagtttgaaggtgataccttagttaatagaat cgaattaaaaggtattgattttaaagaagatggtaacattttaggtcacaaattggaatacaactataactctca caatgtttacatcatggctgacaaacaaaagaatggtatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaaga tggttctgttcaattagctgaccattatcaacaaaatactccaattggtgatggtccagtcttgttaccagacaa ccattacttatccactcaatctgccttatccaaagatccaaacgaaaagagagaccacatggtcttgttagaatt tgttactgctgctggtattacccatggtatggatgaattgtacaaataa，seq id no.54。
[0049]
5、菌株和培养条件
[0050]
大肠杆菌top 10细胞用于质粒构建和繁殖。毕赤酵母野生型菌株gs115用作宿主以制备表达gfp的菌株(gs115
‑
启动子
‑
gfp)和重组α
‑
淀粉酶表达菌株(gs115
‑
启动子
‑
amy)。
[0051]
ypd培养基包括1％酵母提取物、2％胰蛋白胨和2％葡萄糖。
[0052]
ynb培养基包括1.34％ynb固体粉末。
[0053]
缓冲bm碳源培养基(以下简称bm培养基)包括1％酵母提取物、2％胰蛋白胨、0.3％ k2hpo4和1.18％kh2po4。
[0054]
ynb培养基在添加1％葡萄糖后得到ynd培养基；
[0055]
ynb培养基在添加1％甘油后得到yng培养基；
[0056]
ynb培养基在添加0.5％甲醇后得到ynm培养基。
[0057]
bm培养基在添加1％葡萄糖后得到bmdy培养基；
[0058]
bm培养基在添加1％甘油后得到bmgy培养基；
[0059]
bm培养基在添加0.5％甲醇后得到bmmy培养基。
[0060]
top 10细胞在含有0.5％酵母提取物、1％胰蛋白胨和0.5％nacl的lb培养基中于37℃培养。gs115
‑
启动子
‑
gfp在ynb碳源培养基中于30度孵育。酵母淀粉酶表达菌株gs115
‑ꢀ
启动子
‑
amy在缓冲bm碳源培养基中于30℃孵育。
[0061]
6、mrna的折叠自由能(δg)计算
[0062]
rna稳定性和折叠自由能(δg)通过在线预测(http://unafold.rna.albany.edu/？q ＝mfold/rna
‑
folding
‑
form2.3)。
[0063]
实施例1根据rna序列数据和mrna结构稳定性选择候选启动子
[0064]
为筛选高效启动子，重新分析了fei qi,cai,zhou,和zhang(genomere
‑
annotation,novel strong promoter discovery and sequence analysis of pichiapastoris based on rna
‑
seq.)的rna序列数据，并计算了在葡萄糖、甘油和甲醇三种碳源培养条件下每个基因的rpkm值。rpkm值代表mrna水平。由于mrna水平是由转录和降解决定的，还进行了每个基因的折叠自由能δg的预测，来揭示结构稳定性。δg 的绝对值更大，mrna二级结构通常更不容易降解。因此选择在两种基因表达差异性尽可能高的不同碳源(葡萄糖、甘油、甲醇)培养条件下的候选启动子。最后成功选择了16 种具有潜在有效性的候选启动子(见表2)。这些启动子包括5个甲醇诱导型启动子， 10个非甲醇诱导型启动子(由葡萄糖或甘油诱导)和1个组成型启动子。
[0065]
实施例2启动子克隆
[0066]
实施例1选定的16个启动子基因，基因组dna序列(起始密码子atg上游1000bp)通过pcr扩增(16个启动子基因的定位名称及序列见表2和表3，pcr引物的序列如seqid no.7
‑
seq id no.37所示)。同时，还克隆了p
aox1
和p
gap
启动子以用作后续实验的对照。
[0067]
实施例3构建gs115
‑
启动子
‑
gfp表达菌株和gs115
‑
启动子
‑
amy表达菌株
[0068]
本实施例中所涉及的启动子片段为实施例2获得的16种启动子片段，使用时，分别用于构建表达菌株。每个表达菌株只用一种启动子片段。
[0069]
为构建gs115
‑
启动子
‑
gfp表达菌株，设计一对引物pagr1/pgfpf2(序列分别如seqid no.3和seq id no.6所示)以扩增绿色荧光蛋白(gfp)表达框。通过clonexpressmultis一步克隆试剂盒将gfp片段、启动子片段连接至ppic 9k载体中(克隆含同源臂启动子的引物序列如seq id no.42
‑
seq id no.51所示)。在完成验证(验证的引物序列为h410
‑
amp/3aox，如seq id no.1和seq id no.2所示)和扩增后，ppic 9k
‑
启动子
‑
gfp 载体接着通过sal i线性化并通过电穿孔转化进入到gs115中并筛选gfp表达框的单拷贝菌株(单克隆筛选用的引物的序列如seq id no.4和seq id no.5所示)。
[0070]
为构建gs115
‑
启动子
‑
amy表达菌株，重组α
‑
淀粉酶表达框(amya，深海嗜热菌 geobacillus sp.4j来源)通过pcr扩增(扩增引物的序列如seq id no.38和seq id no.41 所示)并与启动子片段一起连接到ppic 9k载体(克隆含同源臂启动子的引物序列如seqid no.42
‑
seq id no.51所示)中。类似地，ppic 9k
‑
启动子
‑
amy载体经验证和扩增，转化到
gs115中以筛选单拷贝菌株。
[0071]
实施例4使用gfp报告基因检测法验证候选启动子的强度和调控特性
[0072]
实施例1所述的候选启动子强度和启动效率通过细胞内报道蛋白gfp的表达来检测。
[0073]
(1)16种gs115
‑
启动子
‑
gfp菌株在ypd中预生长至2d
600
‑
6od
600
，其中gfp表达相对较低。收获细胞并用无菌水洗涤3次。然后将细胞转移至表达差异高的不同碳源培养基中(ynd、yng或ynm)。30℃下培养12、18和24小时后，收获1ml等分试样，随后用于测量gfp荧光。本实施例使用酶标仪(biotek synergy mx)三次生物学重复测量 od
600
和gfp。所有16个候选启动子的结果如图1和图2所示。基于荧光的交叠最终选择了5个候选启动子进行进一步研究(图1)，包括两个甲醇诱导型启动子p
0547
和p
0374
，两个非甲醇诱导型启动子p
0440
和p
0188
，以及一个组成型启动子p
0472
。
[0074]
(2)gfp的mrna水平通过实时定量pcr(qrt
‑
pcr)进行检测。5种gs115
‑
启动子
ꢀ‑
gfp菌株在ypd中预生长至2
‑
6od
600
后用无菌水洗涤3次。洗涤过的细胞沉淀转移至ynd、 yng或ynm培养基中。30℃培养4h后，收集细胞沉淀，随后用于分离mrna。去除基因组dna并使用revertra ace定量pcr rt试剂盒(toyobo)合成cdna。使用由beacondesigner 7.9设计的引物进行定量pcr(引物序列如seq id no.39和seq id no.40所示)。诱导情况与荧光数据一致(图3),p
0547
，p
0374
，p
0440
，p
0188
和p
0472
为可进行进一步实验的候选启动子。
[0075]
(3)为更好地分析甲醇诱导型和组成型候选启动子的强度，用常见启动子p
aox1
和 p
gap
作为对照(图4)。在以甲醇为碳源的条件下，p
0547
诱导的gs115
‑
p0547
‑
gfp菌株gfp 荧光强度比p
aox1
强20％，p0374的诱导强度仅达到p
aox1
的三分之一(图4a)。这表明p
0547
可能是值得进一步研究的强启动子。
[0076]
对于组成型启动子p
0472
，其gfp荧光强度略低于p
gap
(图4b)。由于gfp荧光强度不能完全代表启动子表达分泌型重组蛋白的强度，用重组α
‑
淀粉酶(amy)进一步检测五种候选启动子的强度和调控特性。
[0077]
实施例5确定表达重组α
‑
淀粉酶(amy)的启动子活性
[0078]
本发明选择重组α
‑
淀粉酶作为分泌型重组蛋白，以进一步分析启动子活性。构建了单拷贝gs115
‑
启动子
‑
amy菌株(gs115
‑
p
0547
‑
amy、gs115
‑
p
0472
‑
amy、gs115
‑
p
0440
‑
amy、 gs115
‑
p
0188
‑
amy和gs115
‑
p
0472
‑
amy)于ynd中30℃、200rpm预生长至2d
600
‑
6od
600
。收获细胞并用无菌水洗涤3次后转移至初始od
600
＝1的bmdy、bmgy或bmmy培养基中。30℃培养24、48和72小时后，收获1ml等分试样，通过dns方法测量淀粉酶的酶活性。并计算比活性(每单位od的酶活性)。
[0079]
如图5(a和b)所示，gs115
‑
p
0374
‑
amy和gs115
‑
p
0547
‑
amy菌株在甲醇(bmmy)诱导条件下的淀粉酶活性比在以葡萄糖(bmdy)为碳源条件下高得多，表明这两个启动子 p
0374
和p
0547
具有严格的甲醇诱导和葡萄糖抑制机制。为进一步检测p
0374
和p
0547
的强度，将其与传统甲醇诱导型启动子p
aox1
进行比较(图6)。以淀粉酶的酶促活性和比活性为代表，p
0547
的强度与p
aox1
的强度相当。
[0080]
gs115
‑
p
0188
‑
amy在葡萄糖(bmdy)和甲醇(bmmy)培养条件下的表达能力几乎相同(图5c)，而gs115
‑
p
0440
‑
amy在葡萄糖(bmdy)中的表达能力约为在甲醇(bmmy)中的两倍(图5d)，表明这两个启动子p
0188
和p
0440
的调节特性不如实施例4筛选的两个甲醇诱导型启动子。
尽管这限制了它们在大规模重组蛋白表达中的应用，但其仍具备可用于解决特殊科学问题的能力。
[0081]
关于组成型启动子p
0472
，本实施例验证了其在三种不同碳源(葡萄糖、甘油和甲醇)下的组成型特性，淀粉酶表达水平与传统启动子(p
gap
)相当(图5e和图5f)。因此， p
0472
也是一种潜在有效的组成型启动子，可用补料分批培养进一步评估其在驱动大规模蛋白质表达方面的潜力。
[0082]
实施例6生物反应器培养
[0083]
本实施例建立了一个补料分批培养系统(5l生物反应器)，并检测了两个启动子 p
0472
和p
0547
于更大规模体系中诱导重组蛋白表达的能力。gs115
‑
p
0547
‑
amy在甘油培养基中分批生长约20小时。甘油耗尽后，甘油生长期结束，然后切换至甲醇诱导阶段。 gs115
‑
p
0472
‑
amy在甘油或葡萄糖培养基上生长。gs115
‑
p
aox1
‑
amy和gs115
‑
p
gap
‑
amy作为对照。每24小时收获1ml等分培养基以测量od、湿细胞重量和酶活性。gs115
‑
p
0472
‑
amy 菌株的细胞生长和淀粉酶活性如图7(a)所示。将gs115
‑
p
0472
‑
amy的分批补料培养曲线与gs115
‑
p
gap
‑
amy菌株进行比较，结果表明，p
0472
所驱动的淀粉酶酶活和比活性均比p
gap
驱动的高25
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30％(图7b)。
[0084]
gs115
‑
p
0547
‑
amy菌株的细胞生长和淀粉酶活性如图7(c)所示，并与gs115
‑
p
aox1
‑
amy 进行比较。在甲醇培养条件下，gs115
‑
p
0547
‑
amy中淀粉酶的酶活性和比活性均高出5
‑
10％。综上所述，p
0547
和p
0472
分别是毕赤酵母中良好的诱导型或组成型启动子，可以用于大规模的重组蛋白表达。
[0085]
以上所述仅是本发明的实施方式的举例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。