一种自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法与流程

1.本发明属于细胞培养领域，特别涉及一种自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法。


背景技术：

2.皮肤的成纤维细胞广泛分布于真皮组织中，成纤维细胞通过分泌多种物质构成细胞外基质,从而形成结缔组织，对机体发挥结构性功能。成纤维细胞在人的一生中发挥重要作用，如在胚胎期指导皮肤形成，器官成熟后参与皮肤稳态的维持,促进损伤部位结构与功能的修复等。
3.目前，自体皮肤成纤维细胞的原代培养方法大致分为2种：酶消化法及组织块贴壁法。酶消化法的消化时间久，操作复杂，并且因为胰酶会对细胞造成不可逆的损伤，从而导致细胞得率低的问题。组织块贴壁法中胰酶依然能对细胞造成伤害，而且组织块容易悬浮,从而使细胞没法爬出,导致细胞得率低。
4.上述两种方法为了得到纯度相对高的成纤维细胞，必须要使用胰酶消化去除表皮层,使细胞受到严重损伤。而且成纤维细胞还要多次传代才能获得高纯度的细胞，从而使得患者等待时间久，细胞原代活性差，疗效显著降低，同时，得到细胞的成功率也较低，使得实验失败，浪费标本，且可能存在潜在致瘤风险。
5.如申请号为201610994328.9的中国发明专利，公开了一种皮肤来源的成纤维细胞的培养方法，包括如下步骤:1)采用两步酶消化法从人皮肤组织获得成纤维细胞；2)用dmem(du ibeccominimumessentialmedium,杜尔伯科极限必需培养基)和f12培养基(ham'sf 12nutrien tmedium，动物细胞培养基)并添加细胞生长因子egf(epi dermalgrow thfactor,表皮生长因子)和/或b
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fgf(basi cfibroblastgrowthfactor,碱性成纤维生长因子)培养成纤维细胞,dmem培养基与f12培养基的比例为1:1。采用上述培养法虽然能促进成纤维细胞的增殖，同时egf和b
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fgf能促进了成纤维细胞的增殖和胶原蛋白分泌的增加。但是前期使用酶消化法去除表皮层对成纤维细胞损伤较大，而且该方法的培养基对成纤维细胞无选择性,杂细胞影响比较大，所培养的原代成纤维细胞纯度低,需要传代多次才能得到纯度高的成纤维细胞。


技术实现要素：

6.本发明的目的是针对现有技术的缺陷，提供一种在在组织标本量较少的情况下，取得最高的原代成纤维细胞培养成功率，大量获得成纤维细胞，无需胰酶或分散酶等消化去除表皮层，对成纤维细胞具有选择性，成纤维细胞能够快速生长增殖的体外细胞培养方法。
7.为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：一种用皮肤成纤维前体细胞制备自体成纤维细胞的方法，包括以下步骤：
8.(1)取自体皮肤，分为多个组织块，hbss漂洗后剪除脂肪组织和其他混杂组织，剩余的真皮组织块被剪碎至乳糜状，往乳糜状的真皮组织加入i型胶原蛋白酶消化，37℃条件
下继续消化2～3h；
9.(2)将消化后的乳糜状组织用70μm孔径过滤刷过滤后，将上清液用完全培养液将细胞沉淀混悬，400g/min离心5min，将离心后的细胞加入成纤维细胞选择培养基重悬培养，将重悬后的培养液铺于第一培养皿中；同时将70μm过滤刷中的组织块取出，放入第二培养皿中，将其分散开，随后置于培养箱中，37℃条件下培养约3h后加入成纤维细胞选择培养基重悬培养，将重悬后的培养液铺于第二培养皿中；在第一培养皿和第二培养皿中加入成纤维细胞选择培养基，随后将培养皿放入培养箱中培养至成纤维细胞融合完成；
10.(3)将第一培养皿和第二培养皿从培养箱中取出，加入胰酶消化，使成纤维细胞从培养皿中脱落，得到的成纤维细胞使用完全培养基接种至培养瓶中，并使成纤维细胞密度达到90％，得到原代成纤维细胞；
11.(4)将原代成纤维细胞传代扩瓶培养。
12.进一步的，步骤(1)中乳糜状的真皮组织和i型胶原蛋白酶的体积比为1：30。
13.进一步的，步骤(2)和(3)中的完全培养液采用dmem培养基和胎牛血清按照体积比10：1制备而成。
14.进一步的，步骤(2)中的成纤维细胞选择培养基采用dmem培养基内加入5ng/ml重组人碱性成纤维细胞生长因子、0.5ug/ml的重组人胰岛素、1μg/ml的氢化可的松半琥珀酸脂和50μg/ml的抗坏血酸，并将上述加入细胞因子的培养基和胎牛血清按照体积比10：1制备而成。
15.进一步的，步骤(2)中的培养箱的空气环境为95％空气和5％co2。
16.进一步的，步骤(2)中第一培养皿放入培养箱中培养，24h后将成纤维细胞选择培养基全量换液，之后每隔3～5d更换成纤维细胞选择培养基。
17.进一步的，步骤(2)中第二培养皿放入培养箱中培养，每隔3～5d将成纤维细胞选择培养基全量换液。
18.进一步的，步骤(3)中第一培养皿和第二培养皿用pbs清洗两次后再加入胰酶溶液，胰酶溶液的重量百分比为0.25％，在37℃条件下消化3min，用完全培养基终止消化。
19.进一步的，步骤(3)中成纤维细胞使用完全培养基接种后放入培养箱中，37℃条件下，空气环境为95％空气和5％co2，隔1d更换完全培养基。
20.进一步的，步骤(4)中原代成纤维细胞传代扩瓶培养采用以下步骤：
21.(4.1)将步骤(3)中的培养瓶使用pbs清洗二遍后，加入重量百分比为0.25％的胰酶溶液，37℃消化3min，并用完全培养基终止消化，得到细胞悬液；
22.(4.2)将细胞悬液收集到离心管中离心后，用完全培养基将重悬细胞接种到10个洁净的培养瓶中，接着放入气体环境为95％空气和5％co2，温度为37℃的培养箱中培养；
23.(4.3)此后每3天用完全培养基全量换液，每3天按1传10的比例进行传代，传代步骤为上述步骤(4.1)和(4.2)，10天后即可收获1x109个的成纤维细胞。
24.为了在组织标本量有限的情况下，取得最高的原代成纤维细胞培养成功率，大量获得成纤维细胞，提高实验效率，传统方法中本可丢弃的组织进行了再利用，重新铺于培养皿中。为了防止组织块在换液过程中被吹起,并且避免细胞代谢产物杂细胞爬出，培养皿中的成纤维细胞选择培养基每隔3～5天换一次液。为了提供细胞增殖所需的物质，去除传代过程中未丢弃的组织块。在保证成纤维细胞活力和增值速度的同时，最大限度地提高细胞
数量，成纤维细胞按照每3天1瓶传10瓶传代扩瓶培养。
25.与现有技术相比，本发明的优点在于只需取人体2～2.5mm2的皮肤，创伤远小于其他方法。本法细胞得率高；成纤维细胞选择培养基对成纤维细胞具有选择性，提高成纤维细胞的纯度，有效缩短细胞传代数；细胞增殖速度快，2～3周便可扩增1000倍，使得传统成纤维细胞培养方法中耗时长、效率低、纯度低、原代活性差等缺点得到解决。
附图说明
26.图1是实施例的自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法的培养皿1的细胞爬出的示意图。
27.图2为实施例的自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法的培养皿1的细胞融合的示意图。
28.图3为实施例的自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法的培养皿2的细胞爬出的示意图。
29.图4是实施例的自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法的培养皿2的细胞融合的示意图。
30.图5是实施例的自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法的在原代成纤维细胞培养步骤中使用成纤维细胞选择培养基的细胞生长情况示意图。
31.图6是实施例的自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法的在原代成纤维细胞培养步骤中未使用成纤维细胞选择培养基，用普通培养基的细胞生长情况示意图。
32.图7是实施例的自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法的在原代成纤维细胞培养步骤中vimentin抗体染色结果示意图。
33.图8是实施例的自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法的在原代成纤维细胞培养步骤中dapi复染细胞核结果示意图。
34.图9是实施例1的自体皮肤来源的成纤维细胞培养方法的在原代成纤维细胞培养步骤中vimentin/dapi染色结果示意图。
具体实施方式：
35.为了使本技术领域的人员更好地理解本技术方案，下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本技术保护的范围。
36.需要说明的是，本技术的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
37.实施例1
38.成纤维细胞培养
39.1)配置成纤维细胞选择培养基：
40.dmem培养基为基础培养基，接着在基础培养基中添加5ng/ml的rhfgf
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b(重组人碱性成纤维细胞生长因子)、0.5μg/ml的rhnsulin,(重组人胰岛素)、1μg/ml的hydrocortisone hemisuccinate(氢化可的松半琥珀酸脂)、50μg/ml的ascorbic aid(抗坏血酸)后，再将上述添加各细胞因子的培养基与胎牛血清按照体积比10:1制成成纤维细胞选择培养基，用于加快成纤维细胞的增殖速率，并且能够抑制其他细胞的生长。
41.其中，dmem培养基的高浓度营养成分的优点，使成纤维细胞增殖速率快并且。胎牛血清用于提供成纤维细胞增殖时所需的营养物质，促进成纤维细胞增殖。rhfgf
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b可以促进成纤维细胞生长，抑制表皮细胞生长。rhnsulin促进细胞生长,维持细胞形态,使得成纤维细胞不会分化，加上ascorbic aid与hydrocortisone hemisuccinate，使成纤维细胞选择培养基对成纤维细胞具有选择性，促进成纤维细胞生长的同时抑制其他杂细胞的生长，从而能获得高纯度的成纤维细胞。
42.2)用高压灭菌眼科剪剪除组织块中脂肪组织和其他混杂组织，将修剪后真皮组织剪成2～3mm细条或细块。
43.按1mg/ml的比例配制30ml胶原酶i。
44.3)取样：
45.取剪成2～3mm细条或细块数块，在细胞台中将真皮组织置于1.5ml ep管中剪成乳糜状大小(组织块过大细胞爬出量低或者无法爬出)，将真皮组织置于1.5ml ep管中剪成乳糜状大小放入配好的含有胶原酶i溶液试管中，将试管水浴加热3h，随后滤过的真皮组织消化液，按照400g，5min方法离心后，再加成纤维细胞选择培养基重悬培养，将重悬后的培养液铺于培养皿1中。再将过滤刷中的真皮组织，用眼科镊于新的大皿中分离平铺，随后放入气体环境为95％空气和5％co2，温度为37℃培养箱中静置中培养约3h((此为干法培养))后，再加成纤维细胞选择培养基重悬培养，将重悬后的培养液铺于培养皿2中。由于此法铺板此时的组织块已经充分浸润，组织块不易干燥，加上胶原酶的使用，促进了成纤维细胞爬出。
46.4)原代成纤维细胞培养：
47.将步骤3)中的培养皿从培养箱中拿出，沿培养皿壁缓慢加入步骤1)中的成纤维细胞选择培养基，随后将培养皿放入气体环境为95％空气和5％co2，温度为37℃的培养箱中培养。培养皿1在24h后将成纤维细胞选择培养基全量换液，之后每隔5天更换成纤维细胞选择培养基。培养皿2每隔5天培养基中的成纤维细胞选择培养基全量换液。直至细胞融合。在本实施例中的培养条件下，成纤维细胞在第3～5天时细胞爬出(如图1和3)，在第14天时细胞融合(如图2和4)，细胞融合后的成纤维细胞即为原代细胞。此时观察细胞的生长情况，结果如图2和4所示。
48.将细胞融合后的培养皿取出，使用pbs清洗二遍后，加入含有重量百分比为0.25％的胰酶的溶液在37℃下消化3分钟，使细胞从培养皿中脱落，然后使用步骤1)的基础培养基和胎牛血清按照体积比10:1制成的完全培养基终止消化，得到细胞悬液.将细胞悬液收集到离心管中离心后，用完全培养基将重悬细胞接种到1个洁净的培养瓶中，接着放入气体环境为95％空气和5％co2，温度为37℃的培养箱中培养。第二天用完全培养基全量换液，5天后细胞密度即可达90％。
49.5)传代成纤维细胞培养:.
50.将步骤4)中的培养瓶使用pbs清洗.二遍后，加入0.25％的胰酶溶液(即浓度为2.5g/l的胰酶溶液，下同)，37℃消化3分钟，并用完全培养基终止消化，得到细胞悬液。将细胞悬液收集到离心管中离心后，用完全培养基将重悬细胞接种到10个洁净的培养瓶中。
51.接着放入气体环境为95％空气和5％co2，温度为37℃的培养箱中培养。此后每3天用完全培养基全量换液，每3天按1传10的比例进行传代，传代步骤均为上述操作步骤，10天后即可收获1x109个的成纤维细胞。
52.验证实验a
53.第二代成纤维细胞荧光染色实验
54.为了验证所培养的细胞为成纤维细胞，采取成纤维细胞荧光染色实验。
55.因为本成纤维细胞培养方法具有成纤维细胞选择性，该方法所培养的原代成纤维细胞即具有很高的纯度。
56.1)取前述第二代成纤维细胞的培养基，用磷酸盐缓冲液(phosphatebufferedsolut ion,pbs)清洗二遍。
57.2)在两个培养皿中均加入0.25％的胰酶的溶液37℃下消化至细胞脱落，然后用普通培养基终止消化，得到细胞悬液。
58.3)将两种细胞悬液分别转移至15ml离心管中，加入生理盐水，400g离心5min，弃上清液。
59.4)将步骤3)中得到的细胞悬液沉淀分别按照每孔1
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105接种到24孔板的2个反应孔中，其中两个反应孔中接种实验组的细胞，另外两个接种对照组的细胞：另外加入阴性对照2孔。
60.5)根据标准换液流程进行换液直至细胞融合到90％时。在含有细胞的两个反应孔中，加入兔抗人vimentin抗体(1：500)，室温孵育1h；
61.6)随后加入alex flour@488标记山羊抗兔igg，最后加入dapi复染细胞核，避光保存，用荧光显微镜观察细胞形态，计数vimentin阳性细胞。
62.7)w荧光显微镜观察,结果如图7至9所示。
63.结果及分析：
64.如图7至9所示，分别是第二代成纤维细胞的vimentin及dapi荧光染色情况，其成纤维细胞纯度大于95％。
65.综上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。