高表达EGR1的PSTT病灶肿瘤相关间质细胞株、构建方法及应用与流程

高表达egr1的pstt病灶肿瘤相关间质细胞株、构建方法及应用
技术领域
1.本发明属于肿瘤生物学技术领域，尤其涉及一种高表达egr1的pstt病灶肿瘤相关间质细胞株、构建方法及应用。


背景技术：

2.目前，妊娠滋养细胞疾病是一大类由于滋养细胞异常增生导致的疾病，主要包括：葡萄胎、绒癌、pstt及着床部位的滋养细胞肿瘤。二十世纪随着化疗药物的开发应用，滋养细胞疾病的治疗取得突飞猛进的进展，绝大多数滋养细胞疾病，甚至绒癌通过化疗均获得较好的治疗效果。然而，大部分pstt对化疗药物耐药，使pstt成为滋养细胞疾病治疗的难点。
3.pstt通常继发于流产、葡萄胎、足月产之后，因其具有恶性潜能，根据nccn临床实践指南，确诊后需要首选全子宫切除，对于有转移pstt患者需辅助化疗。由于90％的pstt患者对化疗耐药，复发和转移pstt患者预后较差，其致死率达10
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20％。pstt根据figo(2000年)分期标准分为i～iv期。i期：病变局限于子宫；ii期：病变局限于生殖器官；iii期：病变转移至肺；iv期：病变伴随远处转移。figo分期是影响pstt预后的主要因素。i期pstt患者进行全子宫切除术即可获得较好的预后，10年生存率甚至可以达到100％。然而对于这些pstt患者，虽然手术后可以痊愈，但是全子宫切术使她们丧失生育能力，给整个家庭带来痛苦。
4.胎盘部位滋养细胞肿瘤特点为对于化疗药物不敏感，主要的治疗方式为手术切除。对于低危型患者主要采取手术治疗，高危型患者采取手术联合化疗。化疗多采用联合化疗的方案，即依托泊苷、甲氨蝶呤、放射菌素
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d、长春新碱、环磷酰胺(ema
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co)。化疗耐药性是目前滋养细胞肿瘤治疗中遇到的共同难题。
5.引起化疗耐药的分子机制很多，如基因突变、表观遗传学调控、药物对耐药肿瘤细胞的筛选、肿瘤代谢改变及肿瘤微环境(tumor microenvironment，tme)等。其中，肿瘤微环境对肿瘤化疗药物敏感性的调控愈来愈受到关注，tme显著影响化疗药物治疗效果并与肿瘤化疗后的复发关系密切。
6.肿瘤微环境主要由肿瘤相关的成纤维细胞(cancer
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associated fibroblasts，cafs)、细胞外基质、免疫细胞(自然杀伤细胞、t细胞及巨噬细胞)组成。cafs来源于多种细胞类型，如静息状态成纤维细胞、内皮细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)及星状细胞(stellate cells)等等。来自肿瘤细胞的细胞因子可促进cafs活化，活化的cafs分泌大量的生长因子、趋化因子、胶原蛋白及与细胞外基质相关的酶，共同构成三维的细胞外基质的网络，调控肿瘤的侵袭、转移及药物敏感性。cafs已经证实参与多种肿瘤耐药，如卵巢癌、胰腺癌、结肠癌等。前期研究证实，pstt病灶的cafs高表达早期生长应答因子(early growth response 1，egr1)。egr1是锌指结构的转录因子，最早由成纤维细胞内发现,其活化后可以促进il
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6及外泌体的分泌，参与肿瘤血管形成与耐药。
7.大多数pstt对化疗耐药，复发及转移女性预后差。因此，pstt首选治疗方式为全子
宫切除，这使许多年轻女性因此丧失生育能力；然后目前关于pstt基础性研究较少，导致pstt耐药的分子机制并不清楚。本项目构建pstt来源的egr1高表达间质细胞株，可用于pstt耐药分子机制研究，这对发现新的治疗靶点，改善滋养细胞肿瘤化疗的敏感性具有重要意义。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种高表达egr1的pstt病灶肿瘤相关间质细胞株、构建方法及应用。
9.本发明是这样实现的，一种pstt病灶肿瘤相关间质细胞株，所述pstt病灶肿瘤相关间质细胞株包括：
10.本发明的另一目的在于提供一种构建所述pstt病灶肿瘤相关间质细胞株的pstt病灶肿瘤相关间质细胞株构建方法，所述pstt病灶肿瘤相关间质细胞株构建方法包括：
11.步骤一，获取pstt新鲜组织标本；
12.步骤二，对获取的pstt新鲜组织标本进行剪切、胰酶消化，去除混杂细胞，获得cafs原代培养细胞株；
13.步骤三，对构建的cafs原代培养细胞株进行免疫荧光检测α
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sma，fap，fsp1及其他标志蛋白表达验证构建的cafs原代培养细胞株；
14.步骤四，对构建的cafs进行流式细胞技术筛选，将高表达egr1细胞株筛选出来，并建系保存。
15.本发明的另一目的在于提供一种所述pstt病灶肿瘤相关间质细胞株在构建分析pstt对化疗药物耐药的细胞模型中的应用。
16.结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明利用依托单位新鲜的pstt样本，构建多株cafs原代培养细胞株，并确定这些体外培养细胞株表达cafs的主要分子标志，如α
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sma，fap，fsp1，通过流式细胞技术筛选，或者高表达egr1的pstt来源cafs。本发明通过实验证明，pstt病灶cafs培养上清及共培养体系显著促进滋养细胞对mtx及acd耐药，但不影响滋养细胞对vp
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16、ctx及vcr等其他化疗药物的敏感性。
17.本发明建立的egr1高表达的pstt病灶cafs，有助于对于分析pstt对化疗药物耐药的分子机制提供良好的细胞模型，同时助于筛选并发现新的导致pstt耐药的新靶点，其为本发明的关键点及保护点。本发明以肿瘤微环境入手，建立pstt病灶cafs，这为pstt药物敏感性的研究提供良好的细胞模型，有助于发现pstt新的治疗靶点及治疗策略。
附图说明
18.为了更清楚地说明本技术实施例的技术方案，下面将对本技术实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
19.图1是本发明实施例提供的pstt病灶肿瘤相关间质细胞株构建方法流程图。
20.图2是本发明实施例提供的cafs表达分子标志示意图。
21.图3流式分选egr1高表达cafs的egr1表达水平鉴定图。
22.图4是本发明实施例提供的pstt病灶分离cafs培养上清处理的滋养细胞htr
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8对mtx及acd药物敏感性示意图。
23.图5是本发明实施例提供的滋养细胞对mtx及acd药物敏感性示意图。
24.图6是本发明实施例提供的滋养细胞对acd及mtx药物敏感性示意图。
25.图7是本发明实施例提供的pstt病灶cafs及正常孕妇蜕膜成纤维细胞il
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6分泌示意图。
26.图8是本发明实施例提供的滋养细胞acd药物敏感性示意图。
具体实施方式
27.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
28.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种pstt病灶肿瘤相关间质细胞株、构建方法及应用，下面结合附图对本发明作详细的描述。本发明的细胞株是原代培养出来的。
29.如图1所示，本发明实施例提供的pstt病灶肿瘤相关间质细胞株构建方法包括以下步骤：
30.s101，获取pstt新鲜组织标本；
31.s102，对获取的pstt新鲜组织标本进行剪切、胰酶消化，去除混杂细胞，获得cafs原代培养细胞株；
32.s103，对构建的cafs原代培养细胞株进行免疫荧光检测α
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sma，fap，fsp1及其他标志蛋白表达验证构建的cafs原代培养细胞株；
33.s104，对构建的cafs进行流式细胞技术筛选高表达egr1细胞，并建系保存。
34.本发明提供的pstt病灶肿瘤相关间质细胞株构建方法业内的普通技术人员还可以采用其他的步骤实施，图1的本发明提供的pstt病灶肿瘤相关间质细胞株构建方法仅仅是一个具体实施例而已。
35.下面结合具体实施例对本发明的技术效果作进一步描述。
36.实施例1：
37.1.pstt病灶来源cafs分离与鉴定，pstt病灶cafs培养上清促进滋养细胞对acd及mtx耐药。
38.图2：本发明前期利用依托单位新鲜pstt样本，获得pstt新鲜组织标本，经过剪切、胰酶消化，去除混杂细胞，获得原代cafs，以免疫荧光检测α
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sma，fap，fsp1等标志蛋白表达。
39.图3：利用egr1及vimentin抗体对建系细胞进行流式分选，分离egr1高表达pstt来源cafs，并进行鉴定。
40.图4：pstt病灶分离cafs培养上清处理滋养细胞htr
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8，cck8分析其对mtx及acd药物敏感性。证实，cafs培养上清及共培养体系显著降低滋养细胞对mtx及acd药物敏感性，但不影响滋养细胞对vp
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16、ctx及vcr等其他化疗药物的敏感性。
41.图5：ii～iv期pstt患者，由其病灶分离出cafs的培养上清，较i期pstt患者病灶cafs的培养上清，显著诱导滋养细胞对acd及mtx耐药，提示pstt病灶cafs形成的肿瘤微环
境调控滋养细胞的化疗敏感性，并与pstt进展有关。
42.图6：pstt病灶cafs较正常孕妇蜕膜成纤维细胞il
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6分泌显著增加。
43.图7：pstt病灶cafs过表达egr1/il
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6促进滋养细胞acd耐药；il
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6阻断性抗体抑制滋养细胞acd耐药。
44.图8：流式细胞分选pstt病灶高表达egr1的cafs亚群，将其与滋养细胞共培养，与其他亚群相比，这一亚群显著促进滋养细胞对acd耐药，对mtx药物敏感性没有影响。
45.以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。