一种能高效分化成脂的规模化3D低氧间充质干细胞培养体系的制作方法

increasestheir adip ogenic and osteogenic differentiation potentials. cell prolif.201 2;45(3):225
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238.）研究发现低氧预处理能够促进脂肪间充质干细胞成脂分化。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人脐带间充质干细胞3d低氧培养方法以及分化成脂的方法；所述方法培养的人脐带间充质干细胞的增殖速率、分化能力明显增强。
6.为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：本发明提供了一种人脐带间充质干细胞3d培养的方法，包括以下步骤：1）将人脐带间充质干细胞在2d条件下培养至p2~p4代；2）将获得的p2~p4代脐带间充质干细胞接种3d环境中进行扩增培养至p5~p7代；步骤2）中所述3d环境以玻璃微球为载体；所述3d环境中的氧分压为3%~8%。
7.优选的，所述玻璃微球表面积为4~5mm2。
8.优选的，所述3d环境中的氧分压为4%~6%。
9.优选的，所述3d环境中的氧分压为5%。
10.优选的，所述3d环境由生物反应器提供。
11.优选的，步骤2）中所述接种的密度为103~105个细胞。
12.优选的，步骤2）中所述接种的密度为104个细胞。
13.本发明提供了一种人脐带间充质干细胞成脂分化的方法，包括以下步骤：1）收集所述扩增获得的p5~p7代人脐带间充质干细胞，接种至msc培养基中培养，当细胞汇合度达到80~90%时，将培养基更换为成脂分化培养基；2）每1~3d更换一次新鲜的成脂分化培养基，培养至15~20d。
14.优选的，步骤2）中每2d更换一次新鲜的成脂分化培养基。
15.优选的，步骤2）中培养至18d。
16.本发明的有益效果：本发明提供的人脐带间充质干细胞3d培养的方法，通过将细胞置于3d环境中在低氧的状态下进行规模化培养，能够更好地模拟体内条件，能更紧密地模仿复杂的细胞组织间相互作用以及在体内的微环境，为人脐带间充质干细胞的生长、分化提供了一个合适的微环境；根据实施例的记载可知，3d低氧规模化培养的人脐带间充质干细胞生长状况良好，细胞形态与常氧不同，；并且低氧条件下扩增的人脐带间充质干细胞具有较高成脂分化能力，成脂分化效率高，成脂分化出现时间较早。
17.根据实施例记载，成脂诱导分化后，2d、3d低氧规模化培养的人脐带间充质干细胞由纤维状逐渐缩短、变圆；3d组于第8天出现散在的点状小脂滴，而2d组在第10天才开始出现脂滴，继续培养，脂滴增多增大，3d组两周能够染色，2d组则需要3周才能够染色，油红o染色可见3d组的染色脂滴比2d组多。本发明提供的3d低氧培养方法培养的人脐带间充质干细胞的增殖速率、分化能力、分泌营养因子和抗炎因子的能力明显增强。
附图说明
18.图1为实施例1中第一组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态；图2为实施例1中第二组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态；
图3为实施例1中第三组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态；图4~图7为10倍镜下拍摄成脂分化油红o染色结果，为3d低氧培养的细胞成脂分化结果展示。
19.图8为第一组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态，左图为2d培养细胞，右图为3d培养细胞；图9为第二组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态，左图为2d培养细胞，右图为3d培养细胞；图10为第三组细胞接种后24h在4倍镜下拍摄的细胞状态，左图为2d培养细胞，右图为3d培养细胞；图11为20倍镜下拍摄成脂分化油红o染色结果，左图为第一组2d培养细胞成脂分化染色结果，右图为第一组3d培养细胞成脂分化染色结果；图12为20倍镜下拍摄成脂分化油红o染色结果，左图为第二组2d培养细胞成脂分化染色结果，右图为第二组3d培养细胞成脂分化染色结果；图13为20倍镜下拍摄成脂分化油红o染色结果，左图为第三组2d培养细胞成脂分化染色结果，右图为第三组3d培养细胞成脂分化染色结果。
具体实施方式
20.本发明提供了一种人脐带间充质干细胞3d培养的方法，包括以下步骤：1）将人脐带间充质干细胞在2d条件下培养至p2~p4代；2）将获得的p2~p4代脐带间充质干细胞接种3d环境中进行扩增培养至p5~p7代；步骤2）中所述3d环境以玻璃微球为载体；所述3d环境中的氧分压为3%~8%。
21.在本发明中，将人脐带间充质干细胞在2d条件下培养至p2~p4代。本发明对所述人脐带间充质干细胞的来源没有特殊限定，优选的分离自新生儿脐带组织。
22.本发明对所述人脐带间充质干细胞的分离方法没有特殊限定，采用本领域常规的分离方法即可。在本发明具体实施过程中，优选的包括以下步骤：a）酒精浸泡生理盐水清洗人脐带组织；b）将清洗后的人脐带组织剪断为3~4cm长的组织，洗去血液、剔除静脉，分离脐带间充质；c）将分离获得的脐带间充质剪断为1~2cm长的组织块置于无血清培养基中培养，当组织块周围新生细胞汇合80%后，收集细胞。
23.在本发明中，将收集到的细胞进行传代培养，本发明对所述传代培养的具体操作没有特殊限定，采用本领域常规的2d培养法培养即可。在本发明中，所述细胞培养至p2~p4代，更优选的培养至p3代。
24.在本发明中，将获得的p2~p4代脐带间充质干细胞接种3d环境中进行扩增培养至p5~p7代。在本发明中，3d环境由生物反应器提供，所述生物反应器内填充玻璃微球为载体，所述玻璃微球的表面积为4~5mm2，优选的为4.2~4.8mm2，更优选为4.5mm2。在本发明中，所述生物反应器是全自动、全封闭的系统，能够控制ph、od、温度、压力、液位、搅拌速度、可检测葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、氨离子、谷氨酸等；所述生物反应器接种、培养、换液、消化、细胞收集等全部自动化操作。在本发明具体实施过程中，所述生物反应器为比瑞生物科技研发的多功能微型生物反应器b.r.biocell dw 2.6l；在本发明具体实施过程中，使用的生物反应器的容积为2.6l。在本发明中，所述玻璃微球堆积在固定床生物反应器中形成固定床，由固
定床构成微流道载体结构。
25.在本发明中，所述3d环境中的氧分压优选为4%~6%，更优选为5%。在本发明中，所述3d环境中的氧分压优选的通过向生物反应器中充入氧气、氮气、二氧化碳和空气实现，所述氧气、氮气、二氧化碳、空气通过气体控制器处理后，最终氧分压控制在5%，上述的氧含量能够为细胞提供更加接近人体组织内的微观环境。
26.本发明提供了一种人脐带间充质干细胞的成脂分化的方法，包括以下步骤：1）收集所述扩增获得的p5~p7代人脐带间充质干细胞，接种至msc培养基中培养，当细胞汇合度达到80~90%时，将培养基更换为成脂分化培养基；2）每1~3d更换一次新鲜的成脂分化培养基，培养至15~20d。
27.在本发明中，收集所述扩增获得的p5~p7代人脐带间充质干细胞，接种至msc培养基中培养，当细胞汇合度达到80~90%时，将培养基更换为成脂分化培养基。在本发明中，所述msc培养基为市售的人脐带间充质干细胞专用培养基。在本发明中，所述接种用的p5~p7代人脐带间充质干细胞的细胞密度优选为1~2
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107cell/ml，更优选为1.6
×
107cell/ml；在本发明中，优选的每2ml msc培养基中接种4~5
×
105个细胞，更优选为4.5
×
105个细胞。在本发明具体实施过程中，优选的将所述p5~p7代人脐带间充质干细胞接种至6孔板中，置于培养箱中培养；所述培养的温度优选为37℃，所述培养的o2体积浓度优选为5%。本发明优选的将细胞培养至汇合度达到80~90%后，将培养基更换为成脂分化培养基；所述更换具体为将原msc培养基吸出，然后添加脂分化培养基；在本发明中，所述成脂分化培养基优选的为stemcell （mesencult
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adipogenic differentiation medium）成脂分化培养基。
28.在本发明中，每1~3d更换一次新鲜的成脂分化培养基，培养至15~20d。在本发明中，优选的每2d更换一次新鲜的成脂分化培养基，培养至18d。在本发明中优选的通过油红o染液进行染色来检测成脂分化的情况，本发明对所述油红o染液的具体操作没有限定，采用本领域常规的油红o染液操作即可。
29.下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
30.实施例1原料种类：人源脐带间充质干细胞，国家干细胞转化资源库；原料的用量：p5代，4.5
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105个细胞方法步骤：原代细胞提取将人源脐带组织的两端结扎，浸泡于含有的生理盐水瓶子中，2~8℃运输到实验室。
31.在超净工作柜台中打开瓶子，收集瓶中保存液（若细胞污染，取此液体检测，查找污染源）。弃去多余保存液后，向瓶中加入20ml 75%酒精（浸没脐带即可），将收集瓶拧紧后，左右晃动7次后浸泡2min。
32.弃去酒精，加入用20ml生理盐水洗两次，清除酒精残留。
33.用无菌镊子取出脐带，放置于无菌100mm培养皿中，加入10ml生理盐水。用无菌剪刀将脐带分为3
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4cm的小段，用镊子夹住脐带中央向两端推挤，洗去血液（一般3遍）。
34.找到脐静脉，从静脉旁边钝性剥开脐带，剔除静脉。注意：静脉较软，剔除静脉后组
织应该是表面平滑的组织块。
35.分离脐带间充质（胶状），分离出的脐带间充质及时放入生理盐水中，注意剔除脐动脉（2条）。注意：动脉韧性大。
36.将分离出的组织块放入50ml离心管，用长剪子剪碎1
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2cm的小段。取出无血清培养基（含血清替代物）以10ml/瓶的量分装入t75细胞培养瓶，将剪碎的组织块分装入其中。每根脐带可分10瓶左右。
37.将组织块摇晃分布均匀后，放入37℃、5% co2、饱和湿度的培养箱培养5d后换液。
38.显微镜观察组织块周围，每5d更换培养基，约9d组织块周围爬出细胞，待细胞汇合80%后，收集细胞传代，进行2d培养至p4代。
39.2.6l生物反应器扩增比瑞生物科技研发的多功能微型生物反应器b.r.biocell dw 12l是全自动、全封闭系统，可控制ph、od、温度、压力、液位、搅拌速度、葡萄糖、可检测乳酸、谷氨酰胺、氨离子、谷氨酸等，接种、培养、换液、消化、细胞收集等全部自动化操作。多个微球堆积在固定床生物反应器中形成固定床，由固定床构成微流道载体结构。低氧环境是往生物反应器中充入氧气、氮气、二氧化碳、空气每分钟0.5l，最终氧分压控制在5%，为细胞提供更加接近人体组织内的微观环境。
40.生物反应器中载体（玻璃微球）泉州精密玻璃珠工厂购买，为玻璃材质，透明球体，表面积为4.5mm2。
41.选取2d培养至p4代人间充质干细胞，以1
×
104个/cm2，取1
×
108个细胞接种至2.6l生物反应器中进行扩增。
42.7天扩增20倍，收获细胞2
×
109个。
43.收集细胞，进行质量检。
44.成脂分化检测方法（1）细胞准备：制备1.6
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107cell/ml msc细胞悬液；（2）细胞接种：取4.5
×
105细胞接种到装有2ml msc培养基的6孔板中。接种完毕，即将细胞置于37℃，培养箱中培养；（3）细胞诱导：待细胞长到基本融合的时候，吸去6孔板中的msc培养基，并加入2ml msc成脂分化培养基；（4）细胞换液：每隔2天换一次msc成脂分化培养基；（5）细胞染色：培养18d，用油红o染液进行染色；油红o染色：（2.1）吸走6孔板中的msc细胞成脂肪诱导分化培养基，用2ml 1
×
pbs冲洗2次。每孔加入1ml 4%多聚甲醛溶液，固定30min。
45.（2.2）吸走4%多聚甲醛溶液，用1
×
pbs冲洗2次。每孔中加入1ml油红o工作液（工作液配制方法，体积比：油红o贮存液:蒸馏水为3:2，混匀后用中性滤纸过滤即可）染色30min。
46.（2.3）吸走油红o染液，用1
×
pbs冲洗3次。
47.（2.4）将培养板置于显微镜下观察成脂染色的效果。
48.对照组为2d常氧p5代，3组，观察细胞生长状况，记录细胞接种后的贴壁率，按照上述记载的方法进行成脂分化。
49.实验组为3d低氧规模化p5代，3组，观察细胞生长状况，记录细胞接种后的贴壁率，按照上述记载的方法进行成脂分化。
50.实验结果：选取3组3d低氧规模化p5代细胞进行贴壁培养，如图1~3所示，其生长状况良好，细胞形态与常氧明显不同，均呈梭形和多棱形；细胞增殖速度快，细胞倍增时间比常氧组短(p均<0.05)，成脂分化效率高，出现时间较早。
51.成脂诱导分化后，如图4~7所示，3d低氧规模化培养的mscs由纤维状逐渐缩短、变圆。第8天出现散在的点状小脂滴，继续培养至第16天，脂滴增多增大，油红o染色可见脂滴数量较多。
52.实验组和对照组的对比结果：细胞形态：2d培养、3d培养细胞形态如图8~图10所示，照片拍摄于细胞接种后24h在4倍镜拍摄。可见，3d低氧规模化培养的mscs生长状况良好，细胞形态与常氧不同，均呈梭形和多棱形。
53.细胞贴壁率（1）2d培养第一例：接种细胞数量4.5
×
105个，接种24h后收集死细胞数量：1.2
×
105个，细胞贴壁率：73.3%；第二例：接种细胞数量4.5
×
105个，接种24h后收集死细胞数量：1.08
×
105个，细胞贴壁率：76%；第三例：接种细胞数量4.5
×
105个，接种24h后收集死细胞数量：9.71
×
104个，细胞贴壁率：78.4%。
54.（2）3d低氧培养第一例：接种细胞数量4.5
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105个，接种24h后收集死细胞数量：9.14
×
104个，细胞贴壁率：79.7%；第二例：接种细胞数量4.5
×
105个，接种24h后收集死细胞数量：6.05
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104个，细胞贴壁率：86.6%；第三例：接种细胞数量4.5
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105个，接种24h后收集死细胞数量：5.53
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104个，细胞贴壁率：87.7%。
55.成脂分化2d培养和3d低氧培养的细胞的成脂分化情况如图11~图13所示，照片拍摄于：油红染色后、由20倍镜拍摄。
56.成脂诱导分化后，2d、3d低氧规模化培养的mscs由纤维状逐渐缩短、变圆。3d低氧培养组于第8天出现散在的点状小脂滴，而2d培养组在第10天开始出现脂滴，继续培养，脂滴增多增大，3d组15天左右染色，2d组则需要3周，油红o染色可见3d低氧培养组的染色脂滴比2d培养组多。
57.以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应
视为本发明的保护范围。