增强血脑屏障转运的人源化和稳定化的fc5变体
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2018年10月29日提交的美国临时专利申请号62/751,962的优先权权益，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本公开总体上涉及用于跨血脑屏障递送期望的剂(例如治疗剂、诊断剂)的组合物和使用所述化合物治疗和/或预防神经系统病症的方法。
背景技术：
4.药物向中枢神经系统(cns)的递送一直是治疗神经系统疾病(例如阿尔茨海默病(alzheimer’s disease)和帕金森病(parkinson’s disease))的挑战。为了使药物到达神经系统，它们首先必须穿透血脑屏障(bbb)，这是由bbb的选择性引起的主要挑战。bbb充当半透膜，可防止大多数分子从血液进入神经系统，并且仅允许低分子量(<400da)和亲脂性化合物通过。大多数小分子和大分子，例如单克隆抗体和反义寡核苷酸，都无法穿过这个屏障。由于药物穿过bbb的过程具有挑战性，因此只有一小部分神经系统疾病的治疗剂可以进入临床试验。
5.本领域需要用于将治疗剂递送至cns的改良的组合物和方法。
技术实现要素：
6.本技术涉及包含抗体可变结构域(例如fc5变体)的分子，其可用于跨血脑屏障转运治疗剂。
7.一方面，本公开特征在于一种跨血脑屏障迁移的抗体可变结构域。所述抗体可变结构包含与seq id no:1中所示的序列至少85％同一的氨基酸序列。所述氨基酸序列包含：(i)与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置5、6、14、75、87、88、93、114和117对应的位置中的一个或多个处的氨基酸取代；以及(ii)包含seq id no:47或57中所示的序列的互补决定区(cdr)1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2和包含seq id no:51中所示的序列的cdr3。
8.在一些情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置5、6、14、75、87、88、93、114和117对应的位置中的至少四个处的氨基酸取代。在其它情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置5、6、14、75、87、88、93、114和117对应的位置中的至少五个处的氨基酸取代。在其它情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置5、6、14、75、87、88、93、114和117对应的位置中的至少六个处的氨基酸取代。在一种情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置5、6、14、75、87、88、93、114和117对应的位置中的每一个处的氨基酸取代。
9.在某些情况下，cdr1包含seq id no:47中所示的序列。在其它情况下，cdr1包含
seq id no:57中所示的序列。
10.在一些状况下，所述氨基酸序列包含以下中的一个或多个(即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)：在与seq id no:1的位置5对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置6对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置14对应的位置处的脯氨酸；在与seq id no:1的位置75对应的位置处的丝氨酸；在与seq id no:1的位置87对应的位置处的精氨酸；在与seq id no:1的位置88对应的位置处的丙氨酸；在与seq id no:1的位置93对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置114对应的位置处的谷氨酰胺；或在与seq id no:1的位置117对应的位置处的亮氨酸。
11.在某些状况下，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置5对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置6对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置14对应的位置处的脯氨酸；在与seq id no:1的位置75对应的位置处的丝氨酸；在与seq id no:1的位置87对应的位置处的精氨酸；在与seq id no:1的位置88对应的位置处的丙氨酸；在与seq id no:1的位置93对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置114对应的位置处的谷氨酰胺；以及在与seq id no:1的位置117对应的位置处的亮氨酸。
12.在一些情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、37、44、45、47或79对应的一个或多个(即1个、2个、3个、4个、5个或6个)位置处的取代。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含以下中的一个或多个(即1个、2个、3个、4个、5个或6个)：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置37对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸；或在与seq id no:1的位置79对应的位置处的亮氨酸。在一些状况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置44和45对应的位置处的取代。在某些实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；以及在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸。在其它状况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、44和45对应的位置处的取代。在某些实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；以及在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸。在其它状况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置44、45和47对应的位置处的取代。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；以及在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸。在一些状况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、44、45和47对应的位置处的取代。在某些实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；以及在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸。在某些状况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置37、44、45和47对应的位置处的取代。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置37对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；以及在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸。在其它情况下，所述氨基酸序列包
id no:1的位置117对应的位置处的亮氨酸。
16.在某些情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比与seq id no:1的位置5、6、14、75、87、88、93、114或117对应的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)位置处的取代。在一个实施方案中，所述氨基酸序列包含以下中的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)：在与seq id no:1的位置5对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置6对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置14对应的位置处的脯氨酸；在与seq id no:1的位置75对应的位置处的丝氨酸；在与seq id no:1的位置87对应的位置处的精氨酸；在与seq id no:1的位置88对应的位置处的丙氨酸；在与seq id no:1的位置93对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置114对应的位置处的谷氨酰胺；或在与seq id no:1的位置117对应的位置处的亮氨酸。
17.在其它情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置44和45对应的位置处的取代。在一些实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；以及在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸。
18.在又一情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、44和45对应的位置处的取代。在一个实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；以及在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸。
19.在一些情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置44、45和47对应的位置处的取代。在一个实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；以及在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸。
20.在另一情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、44、45和47对应的位置处的取代。在一个实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；以及在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸。
21.在某些情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置37、44、45和47对应的位置处的取代。在一个实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置37对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；以及在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸。
22.在一些情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、37、44、45和47对应的位置处的取代。在一个实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置37对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；以及在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸。
23.在另一情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置37、44、45、47和79对应的位置处的取代。在一个实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置37对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨
酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸；以及在与seq id no:1的位置79对应的位置处的亮氨酸。
24.在某些情况下，所述氨基酸序列包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、37、44、45、47和79对应的位置处的取代。在一个实施方案中，所述氨基酸序列包含：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置37对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸；以及在与seq id no:1的位置79对应的位置处的亮氨酸。
25.在一个实施方案中，所述氨基酸序列为seq id no:20中所示的序列。在另一实施方案中，所述氨基酸序列为seq id no:21中所示的序列。在又一实施方案中，所述氨基酸序列为seq id no:22中所示的序列。在另一实施方案中，所述氨基酸序列为seq id no:23中所示的序列。在另一实施方案中，所述氨基酸序列为seq id no:24中所示的序列。在另一实施方案中，所述氨基酸序列为seq id no:25中所示的序列。在另一实施方案中，所述氨基酸序列为seq id no:26中所示的序列。在另一实施方案中，所述氨基酸序列为seq id no:27中所示的序列。在又一实施方案中，所述氨基酸序列为seq id no:28中所示的序列。
26.在另一方面，本发明特征在于一种嵌合分子，所述嵌合分子包含上述任一种抗体可变结构域。
27.在某些情况下，嵌合分子包含抗体fc区。在一些情况下，嵌合分子包含抗体、抗体的抗原结合片段(例如fab)、单链抗体、双功能抗体、纳米抗体、酶、核酸(例如反义寡核苷酸)、小分子药物或者包封核酸(例如反义寡核苷酸)、小分子药物或肽的脂质体或脂质纳米粒子。在一些情况下，嵌合分子包含展示支架，例如锚蛋白重复序列(darpin)、纤连蛋白(adnectin)、蛋白a(affibody)或stefin a(affimer)。
28.在一些情况下，在嵌合分子中，抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至抗体的铰链区的n端。铰链区的c端与fc部分融合。在某些实施方案中，嵌合分子就抗体可变结构域而论是二价的(即，其包含两个抗体可变结构域，每个直接或经由间插氨基酸序列连接至抗体的铰链区n端，并且其中铰链区的c端与fc部分融合)。
29.在某些状况下，铰链区包含序列aepkscd(seq id no:56)、aepkssd(seq id no:59)或kthtcppcp(seq id no:19)。
30.在一些状况下，间插氨基酸序列包含：抗体的重链可变区；抗体的轻链可变区；酶；肽或包含氨基酸序列3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g的接头。
31.在一些状况下，fc部分是higg1 fc、higg2 fc、higg3 fc、higg4 fc、higg1agly fc、higg2 saa fc、higg4(s228p)fc、higg4(s228p)/g1agly fc(在将效应功能最小化的此格式中，ch1和ch2结构域是具有
‘
固定’铰链(s228p)的igg4，并且是无糖基化的。ch3结构域是higg1或higg4(s228p)agly fc。
32.在某些状况下，fc部分直接或经由第二间插氨基酸序列连接至包含第二抗体可变结构域的多肽(例如治疗性抗体的可变结构域)；fab；scfv；单结构域抗体；纳米抗体、双功能抗体、肽；酶；或核酸(例如反义寡核苷酸)。
33.在一些状况下，在嵌合分子中，铰链区连接至核酸。在一些状况下，在嵌合分子中，铰链区化学缀合于核酸。在某些实施方案中，核酸为反义寡核苷酸。
34.在另一方面，本发明提供一种嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至脂质体、聚合物纳米运载体或脂质纳米粒子。
35.在一些情况下，脂质体、聚合物纳米运载体或脂质纳米粒子包封小分子或核酸。在一些情况下，脂质体、聚合物纳米运载体或脂质纳米粒子包封肽。在一些情况下，脂质体、聚合物纳米运载体或脂质纳米粒子包封酶。在一些情况下，脂质体、聚合物纳米运载体或脂质纳米粒子包封抗体或抗体片段(包括fab、fab’2、scfv)。在一些情况下，脂质体、聚合物纳米运载体或脂质纳米粒子包封纳米抗体。在一些情况下，脂质体、聚合物纳米运载体或脂质纳米粒子包封反义寡核苷酸。在一些实施方案中，反义寡核苷酸是缺口聚物。在其它实施方案中，反义寡核苷酸是剪接转换反义寡核苷酸。
36.在另一方面，本发明提供一种嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，其中所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至全抗体。在一些实施方案中，全抗体是结合于人lingo
‑
1、人lingo
‑
2、人lingo
‑
3、人lingo
‑
4、人nogo受体人trem2、如从人染色体9开放阅读框72(c9orf72)基因翻译的具有至少6个重复(ga)6的聚甘氨酸
‑
丙氨酸(ga)的二肽重复序列(dpr)(人c9orf72 dpr)、人tweak、人tweak受体、人β淀粉样蛋白、人τ蛋白、人α
‑
突触核蛋白、人tdp
‑
43、人dr6、人sod1、dr6、jc病毒(或其他感染性疾病标靶)或人erbb2、vegf、cd20、her2(或其它人脑癌标靶)的抗体。在一些情况下，全抗体是贝伐单抗(bevacizumab)、利妥昔单抗(rituximab)、曲妥珠单抗(trastuzumab)、抗pd1抗体或抗pdl
‑
l1抗体。
37.在另一方面，本发明提供一种嵌合分子，其包含本文所述的抗体可变结构域和人血清白蛋白或人血清白蛋白结合部分。在一些情况下，此嵌合分子还包含治疗剂。在一个实施方案中，治疗剂是抗体可变结构域(例如治疗性抗体的可变结构域)；fab；scfv；单结构域抗体；纳米抗体、双功能抗体、肽；酶；核酸(例如反义寡核苷酸)。
38.在另一方面，本发明提供一种嵌合分子，所述嵌合分子涵盖图49中所示的任一种分子。在一些状况下，所示分子的fc区被人血清白蛋白替换，并且这些嵌合分子也是本公开的一部分。在一些情况下，货物使用化学缀合，例如巯基(顺丁烯二酰亚胺、碘基、乙烯砜)连接。
39.在又一方面，本发明提供一种嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至含有治疗性载体的病毒衣壳(例如aav)。参见例如naso等人,biodrugs.2017；31(4):317
‑
334。
40.在另一方面，本发明特征在于一种组合物，所述组合物包含：(1)嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含(i)本文所述的抗体可变结构域和(ii)第一蛋白质，所述第一蛋白质包含抗体的第一铰链区和第一fc部分，其中第一铰链区的c端连接至第一fc部分的n端，并且其中抗体可变结构域的c端直接或经由间插氨基酸序列与第一铰链区的n端融合；(2)第二蛋白质，所述第二蛋白质包含抗体的第二铰链区和第二fc部分，其中第二铰链区的c端连接至第二fc部分的n端，其中第二蛋白质与第一蛋白质配对；以及(3)治疗剂。在一些情况下，接头将第一抗体可变结构域连接至第一蛋白质；和/或嵌合蛋白连接至治疗剂。在一些状况下，接头为3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g。
41.在另一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含：(1)第一嵌合蛋白，所述第
一嵌合蛋白包含(i)本文公开的任一种抗体可变结构域的第一抗体可变结构域；和(ii)第一蛋白质，所述第一蛋白质包含抗体的第一铰链区和第一fc部分，其中第一铰链区的c端连接至第一fc部分的n端，并且其中第一抗体可变结构域的c端直接或经由间插氨基酸序列与第一铰链区的n端融合；(2)第二嵌合蛋白，所述第二嵌合蛋白包含(i)本文公开的任一种抗体可变结构域的第二抗体可变结构域；和(ii)第二蛋白质，所述第二蛋白质包含抗体的第二铰链区和第二fc部分，其中第二铰链区的c端连接至第二fc部分的n端，并且其中第二抗体可变结构域的c端直接或经由间插氨基酸序列与第二铰链区的n端融合，并且其中第二蛋白质与第一蛋白质配对；以及(3)治疗剂。在一些情况下，接头将第一抗体可变结构域连接至第一蛋白质；和/或第二抗体可变结构域连接至第二蛋白质；和/或嵌合蛋白连接至治疗剂。在一些状况下，接头是3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g。
42.在另一方面，本发明特征在于一种组合物，所述组合物包含：(1)第一嵌合蛋白，所述第一嵌合蛋白包含(i)本文公开的任一种抗体可变结构域的第一抗体可变结构域；和(ii)第一蛋白质，所述第一蛋白质包含抗体的第一铰链区和第一fc部分，其中第一铰链区的c端连接至第一fc部分的n端，并且其中第一抗体可变结构域的c端经由第一间插氨基酸序列与第一铰链区的n端融合；(2)第二嵌合蛋白，所述第二嵌合蛋白包含(i)本文公开的任一种抗体可变结构域的第二抗体可变结构域；和(ii)第二蛋白质，所述第二蛋白质包含抗体的第二铰链区和第二fc部分，其中第二铰链区的c端连接至第二fc部分的n端，并且其中第二抗体可变结构域的c端经由第二间插氨基酸序列与第二铰链区的n端融合，并且其中第二蛋白质与第一蛋白质配对；其中第一间插氨基酸序列和第二间插氨基酸序列包含作为治疗剂的fab。在一些情况下，接头将第一抗体可变结构域连接至第一蛋白质；和/或第二抗体可变结构域连接至第二蛋白质；和/或嵌合蛋白连接至治疗剂。在一些状况下，接头是3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g。
43.在一些情况下，铰链区包含序列aepkscd(seq id no:56)或aepkssd(seq id no:59)。在其它情况下，铰链区包含序列kthtcppcp(seq id no:19)。
44.在某些情况下，第一fc部分和第二fc部分具有相同的氨基酸序列。在其它情况下，第一fc部分和第二fc部分具有不同的氨基酸序列。
45.在一些情况下，第一fc部分和/或第二fc部分是无糖基化的。
46.在某些情况下，第一fc部分和第二fc部分选自由以下组成的组：higg1 fc、higg2 fc、higg3 fc、higg4 fc、higg1agly fc、h igg2 saa fc、higg4(s228p)fc、higg4(s228p)/g1 agly fc和higg4(s228p)agly fc。
47.在一些情况下，上述组合物还包含延长半衰期的部分。在一些状况下，第一fc部分和/或第二fc部分是用来延长半衰期的野生型fc的突变型变体。例如yte和ls的fc变体增强抗体在人中的半衰期。在一些情况下，变异fc区与亲本fc区的不同之处在于变异fc区在位置428和434处包含氨基酸取代，其中所述氨基酸取代是m428l和n434s。参见例如美国专利号8546543和8624007；us20140056879a1；brian j.booth等人,(2018)extending human igg half
‑
life using structure
‑
guided design,mabs,doi:10.1080/19420862.2018.1490119；以及shen y等人,(2017)increased half
‑
life and enhanced potency of fc
‑
modified human pcsk9monoclonal antibodies in primates.plos one 12(8):e0183326.doi.org/10.1371/journal.pone.0183326。在其它状况下，组合物还包含
延长半衰期的hsa突变体。参见例如us8748380；和wo2014179657a1。在一些情况下，hsa变体在一个或多个选自由以下组成的组的残基处突变：y411、v415、v418、t422、l423、v426、l430、l453、l457、l460、v473、r485、f488、l491、f502、f507、f509、k525、a528、l529、l532、v547、m548、f551、k573、l575、v576、s579和l583。在其它状况下，组合物还包含xten。参见例如wo2013130683a2和podust等人,journal of controlled release,第240卷,2016年10月28日,第52
‑
66页。
48.在一些情况下，第一铰链区和第二铰链区具有相同的氨基酸序列。
49.在某些情况下，治疗剂是包含抗体可变结构域的结合分子。在一个实施方案中，结合分子结合于人lingo
‑
1、人lingo
‑
2、人lingo
‑
3、人lingo
‑
4、人trem2、人c9orf72 dpr)、人tweak、人tweak受体、人β淀粉样蛋白、人τ蛋白、人α
‑
突触核蛋白或人tdp
‑
43。在一些状况下，结合分子是fab并且fab的vh或vl结构域的n端连接至第一fc部分的c端。
50.在一些情况下，治疗剂是反义寡核苷酸。在一个实施方案中，反义寡核苷酸是缺口聚物。在其它实施方案中，反义寡核苷酸是剪接转换反义寡核苷酸。在一些状况下，反义寡核苷酸连接至第一铰链区和/或第二铰链区。
51.在某些情况下，治疗剂是被包封在脂质体、聚合物纳米运载体或脂质纳米粒子中的小分子药物、肽、酶、纳米抗体或核酸(例如反义寡核苷酸)。
52.在另一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含：(1)嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含(i)本文所述的任一种抗体可变结构域的抗体可变结构域，和(ii)抗体的轻链，其中抗体可变结构域的c端直接或经由间插氨基酸序列与抗体的轻链的n端融合；和(2)抗体的重链，所述抗体的重链与抗体的轻链配对。
53.在另一方面，本发明特征在于一种组合物，所述组合物包含：(1)嵌合蛋白，所述嵌合蛋白包含(i)本文所述的任一种抗体可变结构域的抗体可变结构域，和(ii)抗体的重链，其中抗体可变结构域的c端直接或经由间插氨基酸序列与抗体的重链的n端融合；和(2)抗体的轻链，所述抗体的轻链与抗体的重链配对。
54.在另一方面，本发明提供一种组合物，所述组合物包含：(1)第一嵌合蛋白，所述第一嵌合蛋白包含(i)本文所述的任一种抗体可变结构域的第一抗体可变结构域，和(ii)抗体的轻链，其中第一抗体可变结构域的c端直接或经由间插氨基酸序列与抗体的轻链的n端融合；和(2)第二嵌合蛋白，所述第二嵌合蛋白包含(i)本文所述的任一种抗体可变结构域的第二抗体可变结构域，和(ii)抗体的重链，其中第二抗体可变结构域的c端直接或经由间插氨基酸序列与抗体的重链的n端融合。
55.在一些情况下，间插氨基酸序列是3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g。
56.在某些情况下，抗体结合于人lingo
‑
1、人lingo
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2、人lingo
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3、人lingo
‑
4、人trem2、人c9orf72 dpr、人tweak、人tweak受体、人β淀粉样蛋白、人τ蛋白、人α
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突触核蛋白或人tdp
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43。在一些实施方案中，抗体包含选自由以下组成的组的抗体的六个cdr：li81、li113、hup2d10、12f6a、12f4、21d11、6c5、40e8、bms
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986168、15o7、5j10、41d1、14w3和51c1。在其它实施方案中，抗体包含选自由以下组成的组的抗体的重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)：li81、li113、hup2d10、12f6a、12f4、21d11、6c5、40e8、bms
‑
986168、15o7、5j10、41d1、14w3和51c1。在其它实施方案中，抗体包含选自由以下组成的组的抗体的重链和轻链：
id no:5)、gg或g接头。在其它情况下，间插氨基酸序列包含抗体的与fc部分融合的铰链区。在一些情况下，抗原结合片段是fab。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含12f6a的六个cdr(参见美国专利号8,906,367)。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含12f6a的vh和vl。
65.在另一方面，本发明提供一种治疗有需要的人类受试者的进行性核上麻痹(psp)疾病的方法。所述方法包括向受试者施用嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至特异性结合人β
‑
淀粉样蛋白的抗体或其抗原结合片段。在某些情况下，间插氨基酸序列是3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g接头。在其它情况下，间插氨基酸序列包含抗体的与fc部分融合的铰链区。在一些情况下，抗原结合片段是fab。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含12f6a的六个cdr(参见美国专利号8,906,367)。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含12f6a的vh和vl。
66.在另一方面，本发明特征在于一种治疗有需要的人类受试者的共核蛋白病(例如帕金森病(parkinson’disease))的方法。所述方法包括向受试者施用嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至特异性结合人α突触核蛋白的抗体或其抗原结合片段。在某些情况下，间插氨基酸序列是3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g接头。在其它情况下，间插氨基酸序列包含抗体的与fc部分融合的铰链区。在一些情况下，抗原结合片段是fab。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含12f4(参见美国专利号8,940,276)或21d11(参见美国专利号9,580,493)的六个cdr。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含12f4或21d11的vh和vl。
67.在另一方面，本发明特征在于一种治疗有需要的人类受试者的τ蛋白病(例如阿尔茨海默病)的方法。所述方法包括向受试者施用嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至特异性结合人τ蛋白的抗体或其抗原结合片段。在某些情况下，间插氨基酸序列是3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g接头。在其它情况下，间插氨基酸序列包含抗体的与fc部分融合的铰链区。在一些情况下，抗原结合片段是fab。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含6c5、40e8(参见美国专利号9,598,484)、4e4(参见美国专利号9,605,059)或bms
‑
986168/hipn002(参见美国专利号9,447,180和美国申请公布号us2017/0174755a1)的六个cdr。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含6c5、40e8、4e4或bms
‑
986168/hipn002的vh和vl。
68.在另一方面，本发明特征在于一种治疗有需要的人类受试者的进行性核上麻痹的方法。所述方法包括向受试者施用嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至特异性结合人τ蛋白的抗体或其抗原结合片段。在某些情况下，间插氨基酸序列是3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g接头。在其它情况下，间插氨基酸序列包含抗体的与fc部分融合的铰链区。在一些情况下，抗原结合片段是fab。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含6c5、40e8(参见美国专利号9,598,484)、4e4(参见美国专利号9,605,059)或bms
‑
986168/hipn002(参见美国专利号9,447,180和美国申请公布号us2017/0174755a1)的六个cdr。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含6c5、40e8、4e4或bms
‑
986168/hipn002的vh和vl。
69.在另一方面，本发明特征在于一种治疗有需要的人类受试者的额颞叶痴呆的方
法。所述方法包括向受试者施用嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至特异性结合人tdp
‑
43的抗体或其抗原结合片段。在某些情况下，间插氨基酸序列是3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g接头。在其它情况下，间插氨基酸序列包含抗体的与fc部分融合的铰链区。在一些情况下，抗原结合片段是fab。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含41d1、14w3、51c1(参见美国专利号9,587,014)或c9orf72 dpr的六个cdr。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含41d1、14w3、51c1或抗c9orf72dpr抗体(例如本文公开的那些)的vh和vl。
70.在另一方面，本发明特征在于一种治疗有需要的人类受试者的肌萎缩侧索硬化(als)的方法。所述方法包括向受试者施用嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至特异性结合人sod1、dr6或c9orf72 dpr的抗体或其抗原结合片段。在某些情况下，间插氨基酸序列是3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g接头。在其它情况下，间插氨基酸序列包含抗体的与fc部分融合的铰链区。在一些情况下，抗原结合片段是fab。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含以下中的任一个中所述的抗体的六个cdr：美国专利号9,283,271；8,759,029；或broering等人,doi.org/10.1371/journal.pone.0061210。
71.在另一方面，本发明提供一种治疗有需要的人类受试者的多发性硬化的方法。所述方法包括向受试者施用嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至特异性结合人lingo
‑
1的抗体或其抗原结合片段。在某些情况下，间插氨基酸序列是3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g接头。在其它情况下，间插氨基酸序列包含抗体的与fc部分融合的铰链区。在一些情况下，抗原结合片段是fab。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含li81(参见美国专利号8,128,926)或li113(参见美国专利号8,058,406)的六个cdr。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含li81或li113的vh和vl。
72.在另一方面，本发明提供一种治疗有需要的人类受试者的视神经炎(例如aon)的方法。所述方法包括向受试者施用嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至特异性结合人lingo
‑
1的抗体或其抗原结合片段。在某些情况下，间插氨基酸序列是3x(g4s)(seq id no:60)、g4s(seq id no:5)、gg或g接头。在其它情况下，间插氨基酸序列包含抗体的与fc部分融合的铰链区。在一些情况下，抗原结合片段是fab。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含li81(参见美国专利号8,128,926)或li113(参见美国专利号8,058,406)的六个cdr。在一些状况下，抗体或抗原结合片段包含li81或li113的vh和vl。
73.在又一方面，本发明特征在于一种治疗有需要的人类受试者的脊髓性肌萎缩的方法。所述方法包括向受试者施用嵌合分子，所述嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域，所述抗体可变结构域直接或经由间插氨基酸序列连接至诺西那生钠(nusinersen)(cas登记号1258984
‑
36
‑
9；unii:5z9sp3x666)。在一些状况下，诺西那生钠包封在脂质体、聚合物纳米运载体或脂质纳米粒子中。在其它状况下，间插氨基酸序列包含与fc部分融合的铰链区并且诺西那生钠连接至铰链区、嵌合分子(例如铰链区)中的工程化半胱氨酸(例如s442c)或非标靶位点(例如使用胺化学)。
74.在另一方面，本发明特征在于一种评估抗体可变结构域的不稳定性的方法。所述
方法涉及提供抗体可变结构域。将抗体可变结构域加入至血清样品中以产生混合物。将混合物孵育。将抗体可变结构域纯化并进行肽图谱分析。
75.在另一方面，本发明特征在于一种筛选fc5的稳定化形式的方法。所述方法涉及提供包含fc5变体的抗体可变结构域，所述fc5变体在一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、31个、32个、33个、34个、35个、36个、37个、38个、39个、40个、41个、42个、43个、44个、45个、46个、47个、48个、49个、50个、51个、52个、53个、54个、55个、56个、57个、58个、59个、60个、61个、62个、63个、64个、65个)氨基酸处与seq id no:1不同，或包含与seq id no:1至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％同一的氨基酸序列。将抗体可变结构域加入至血清样品中以产生混合物。将混合物孵育。将抗体可变结构域纯化并进行肽图谱分析。选择展现增加的肽回收率的抗体可变结构域作为fc5的稳定化形式。
76.在以上两个方面的一些情况下，血清样品是大鼠血清。在其它情况下，血清样品是人血清。在某些情况下，抗体可变结构域在血清中，浓度为约0.01至1mg/ml。在某些情况下，抗体可变结构域在血清中，浓度为约0.05至0.5mg/ml。在某些情况下，抗体可变结构域在血清中，浓度为约0.05mg/ml。在某些情况下，抗体可变结构域在血清中，浓度为约0.1mg/ml。在某些情况下，抗体可变结构域在血清中，浓度为约0.5mg/ml。在一些状况下，将混合物在约25至37℃下孵育约10至100小时。在一种状况下，将混合物在约37℃下孵育约70小时。在一个实施方案中，抗体可变结构域包含fc5变体。在一些状况下，fc5变体是人源化fc5。在另一状况下，fc5变体包含二硫化物稳定化的fc5。在另一状况下，fc5变体包含人源化和二硫化物稳定化的fc5。
77.除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文所述的那些方法和材料类似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但是以下描述示例性方法和材料。本文提及的所有公布、专利申请、专利以及其他参考文献都通过引用整体并入。在发生冲突的情况下，以本技术(包括定义)为准。所述材料、方法以及实施例仅是说明性的并且不意图是限制性的。
78.本发明的其它特征和优点将从以下详细描述和权利要求书中显而易见。
附图说明
79.图1提供了野生型fc5单结构域抗体的氨基酸序列(seq id no:1)。还提供了fc5氨基酸序列中的每个氨基酸的位置(根据原始序列编号)。cdr在位置23
‑
35(cdr1)、50
‑
66(cdr2)和97
‑
111(cdr3)处。cdr 1和cdr3是根据north等人(north,b.,lehmann,a.和dunbrack,r.l.,jr,“a new clustering of antibody cdr loop conformations”,j.mol.biol.,406:228
‑
256(2011))定义以说明结构变化性，并且cdr2根据kabat等人的定义(kabat,e.a.,wu,t.t.,perry,h.m.,gottesman,k.s.和foeller,c.(1991).sequences of proteins of immunological interest,第5版.national institutes of health,bethesda,md)与north等人的联合来定义以说明结构和序列变化性。
80.图2提供了li81的轻链(seq id no:2)、fc5
‑
3x(g4s)
‑
hc li81的重链(seq id no:3)和fc5
‑
3x(g4s)
‑
lc li81的轻链(seq id no:4)的氨基酸序列。这些是用于产生构建体
3014、3015和3016的构建体的序列。信号肽序列以较轻的字体展示。
81.图3示出了sds
‑
page对fc5
‑
(g4s)3
‑
li81样品的表征。在来自invitrogen的4
‑
20％tris
‑
甘氨酸梯度凝胶上，样品进行sds
‑
page。在分析之前将非还原样品在95℃下加热2分钟(左图)。将还原的样品用含有2％2
‑
巯基乙醇的样品缓冲液处理并加热(右图)。泳道1，fc5 li81 hc、wt lc(4d#3014)；泳道2，li81 wt hc、fc5 li81 lc(4d#3015)；泳道3，fc5 li81 hc、fc5 li81 lc(4d#3016)；泳道s，高分子量标记。
82.图4描绘了构建体3014的还原的样品的轻链(顶部)和重链(底部)的去卷积质谱。
83.图5示出了构建体3015的还原的样品的重链和轻链的去卷积质谱。
84.图6描绘了构建体3016的还原的样品的重链和轻链的去卷积质谱。
85.图7示出了sds
‑
page对fc5
‑
(g4s)1
‑
li81样品的表征。在来自invitrogen的4
‑
20％tris
‑
甘氨酸梯度凝胶上，样品进行sds
‑
page。在分析之前将非还原样品在95℃下加热2分钟。左图：泳道1，fc5(g4s)1
‑
li81(id#3438)；泳道2，fc5
‑
fc(g4s)1
‑
li81长铰链(id#3440)；泳道3，fc5
‑
fc(g4s)1
‑
li81短铰链(id#3441)；泳道4异二聚体id#3442；泳道5异二聚体id#3443；泳道6异二聚体id#3444；泳道7异二聚体id#3443(第2批)；泳道s，高分子量标记。右图，通过sec纯化异二聚体id#_3443：泳道1，柱负载；泳道2
‑
11，连续洗提部分；泳道s，高分子量标记。
86.图8提供了用于产生fc5
‑
(g4s)1
‑
li81构建体的构建体的氨基酸序列。li81的轻链(seq id no:2)、fc5
‑
(g4s)1
‑
li81 huigg1 agly的重链(seq id no:7)、fc5
‑
fc
‑
(g4s)1
‑
li81 huigg1 agly长铰链的轻链(seq id no:8)和fc5
‑
fc
‑
(g4s)1
‑
li81 huigg1 agly短铰链(seq id no:9)。信号肽序列以较轻的字体展示。
87.图9描绘了fc5
‑
(g4s)1
‑
li81构建体的重链的去卷积质谱。li81/fc5变体1
‑
fc5
‑
(g4s)1
‑
li81；li81/fc5变体3
‑
fc5
‑
fc
‑
(g4s)1
‑
li81长铰链；li81/fc5变体4fc5
‑
fc
‑
(g4s)1
‑
li81短铰链；li81/fc5变体5双重单价fc5
‑
fc
‑
(g4s)1
‑
li81长铰链；li81/fc5变体6双重单价fc5
‑
fc
‑
(g4s)1
‑
li81短铰链；以及li81/fc5变体7单fab fc5
‑
fc
‑
(g4s)1
‑
li81短铰链样品。
88.图10示出了对fc5
‑
(g4s)1
‑
li81构建体效力的评估。通过直接结合elisa测量fc5
‑
(g4s)1
‑
li81样品对lingo
‑
1的表观亲和力。将数据绘制为在405nm下的吸光度相对于浓度的图。
89.图11描绘了在体外bbb细胞培养测定中fc5
‑
li81样品的表征。通过mrm
‑
ilis测定底部腔室中的抗体水平(15、30、60和90分钟)。值是p
app
的平均值
±
sd。
90.图12示出了在炎性疼痛的哈格里夫斯模型(hargreaves model)中，与达拉根(dalargin，dal)交联的fc5
‑
li81融合物对热痛觉过敏的作用。顶图：在单次静脉内(i.v.)给与13mg/kg测试分子或pbs后，在4小时内每隔15分钟间隔，测量对照完整爪或发炎爪对热刺激缩回的潜伏期。数据显示为平均值(2只动物/组；误差线表示单个测量值)。底图：从顶图的综合曲线下面积(auc)数据表示为对照爪的最大可能效应(mpe)百分比。
91.图13a示出了在炎性疼痛的哈格里夫斯模型中，与dal交联的fc5
‑
li81融合物对热痛觉过敏的作用。单次静脉内注射递增剂量的li81和fc5
‑
li81可达到止痛效果。数据是响应持续时间(4小时)内的综合auc，表示为对照爪的mpe百分比(如所述的2只或5只动物/组的平均值
±
标准偏差)。
no:11)和h62(seq id no:15)的序列比对和计算结构模型。模型中的侧链的浅色阴影和比对中的氨基酸一字母代码表示骆驼科动物的起源，而深色阴影表示人的起源。h12具有完全人源化的补丁(虚线)，对应于常规抗体中的vh/vl界面。这个界面在常规抗体中被轻链覆盖，但在单结构域抗体中暴露。引入m34t突变可避免蛋氨酸氧化。
105.图26描绘了通过微流体毛细管电泳变性对fc5
‑
hfc人源化变体的表征。1)h11。2)h12。3)h31。4)h32。5)h61。6)h62。7)h71。8)h72。左：非还原样品。右：还原样品。分子量标记在两侧均以kda表示。使用仪器软件，使用下部标记(lm)将电泳图以2d形式显示为虚拟凝胶，以进行比对。sp＝系统峰值
106.图27示出了还原的fc5
‑
hfc人源化变体样品的去卷积完整质谱。h11：预测质量38553.7da，观测质量38551。h12：预测质量38523.6da，观测质量38521da。h31：预测质量38548.6da，观测质量38544da。h32：预测质量38518.6da，观测质量38516da。h61：预测质量38649.7da，观测质量38645da。h62：预测质量38619.6da，观测质量38617da。h71：预测质量38677.8da，观测质量38674da。h72：预测质量38647.7da，观测质量38645da。
107.图28示出了fc5
‑
hfc的人源化变体的分析型尺寸排阻色谱法的结果。变体h61、h62和h71洗脱为约17.3min下的均质峰，而其它变体按列出的顺序显示延迟的洗脱时间。将数据归一化以得到恒定的峰高。
108.图29是在体外大鼠bbb细胞培养transwell测定中fc5
‑
hfc的人源化变体的表征。通过mrm测定底部腔室中的抗体水平(15、30和60分钟)。值是p
app
的平均值
±
sd。
109.图30示出了在炎性疼痛的哈格里夫斯模型中，与达拉根交联的fc5
‑
hfc人源化变体对热痛觉过敏的作用。左图：在单次静脉内给与约5mg/kg测试分子或pbs后，在4小时内每隔15分钟间隔，测量对照完整爪或发炎爪对热刺激缩回的潜伏期。数据显示为平均值(2只动物/组的sd)。右图：从左图的综合响应(auc)数据表示为对照爪的mpe百分比。
110.图31示出了fc5中稳定其结构的二硫键工程化。通过计算模型化可以确定半胱氨酸突变的位置之间的适当距离以及对蛋白质内部的最小破坏。顶图示出了所指示的半胱氨酸的位置，而底图示出了形成了二硫化物的模型。
111.图32描绘了通过sds
‑
page对fc5
‑
(g4s)1
‑
li81样品的表征。在来自invitrogen的4
‑
20％tris
‑
甘氨酸梯度凝胶上，样品进行sds
‑
page。在分析之前将非还原样品在95℃下加热2分钟。将还原样品用含有2％2
‑
巯基乙醇的样品缓冲液处理并加热。泳道1，4d 4662；泳道2，4d 4663；泳道3，4d 4664；泳道4，4d 4665；泳道5，4d 4666；泳道6，4d 4667；泳道7，4d 4668；泳道8，4d 4669；泳道9，4d 4670；泳道10，高分子量标记。
112.图33显示了在体外bbb细胞培养transwell测定中对二硫化物稳定化的fc5
‑
(g4s)1
‑
li81样品的表征。通过mrm
‑
ilis测定底部腔室中的抗体水平(15、30、60和90分钟)。值是p
app
的平均值
±
sd。
113.图34是通过sds
‑
page对fc5
‑
(g4s)1
‑
li81样品对蛋白水解的敏感性的评估。在来自invitrogen的4
‑
20％tris
‑
甘氨酸梯度凝胶上，样品进行sds
‑
page。在分析之前将非还原样品在95℃下加热2分钟。将还原样品用含有2％2
‑
巯基乙醇的样品缓冲液处理并加热。泳道1，h32(t34c/v79c)
‑
g4s
‑
li81；泳道2，h32(t34c/v79c)
‑
g4s
‑
li81 胃蛋白酶；泳道3，h32(t33c/t103c)
‑
g4s
‑
li81；泳道4，h32(t33c/t103c)
‑
g4s
‑
li81 胃蛋白酶；泳道5，li81；泳道6，li81 胃蛋白酶；泳道7，fc5
‑
h32
‑
g4s
‑
li81；泳道8，fc5
‑
h32
‑
g4s
‑
li81 胃蛋白酶；泳道9，
高分子量标记。
114.图35是通过sds
‑
page对fc5
‑
(g4s)1
‑
li81样品对蛋白水解的敏感性的评估。在来自invitrogen的4
‑
20％tris
‑
甘氨酸梯度凝胶上，样品进行sds
‑
page。在分析之前将非还原样品在95℃下加热2分钟。将还原样品用含有2％2
‑
巯基乙醇的样品缓冲液处理并加热。泳道1，fc5
‑
h62(s49c/i70c)
‑
g4s
‑
li81；泳道2，fc5
‑
h62(s49c/i70c)
‑
g4s
‑
li81 胃蛋白酶；泳道3，fc5
‑
h62(t34c/v79c)
‑
g4s
‑
li81 胃蛋白酶；泳道4，fc5
‑
h62(t33c/s102c)
‑
g4s
‑
li81 胃蛋白酶；泳道5，fc5
‑
h62(t33c/t103c)
‑
g4s
‑
li81 胃蛋白酶；泳道6，fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
g4s
‑
li81 胃蛋白酶；泳道7，fc5
‑
h62(t33c/t105c)
‑
g4s
‑
li81 胃蛋白酶；泳道8，fc5
‑
h32
‑
li81
‑
g4s
‑
li81 胃蛋白酶；泳道9，li81 胃蛋白酶；泳道10，h62
‑
fc5
‑
fc；泳道11，h62
‑
fc5
‑
fc 胃蛋白酶；泳道12，h32
‑
fc5
‑
fc；泳道13，h32
‑
fc5
‑
fc 胃蛋白酶；泳道14，高分子量标记。为便于分析样品，底图示出了非还原sds
‑
page的100
‑
150kda区域中泳道1
‑
9的放大图。
115.图36显示了还原样品4662、4665、4667和4668的重链的去卷积质谱。
116.图37显示了还原样品4662、4665、4667和4668的轻链的去卷积质谱。
117.图38示出了在非还原和还原肽图中重链肽的回收。将回收％(y轴)相对于对照样品中的相应肽进行归一化。表征的hc肽在x轴上指示。回收不良的肽，hc 215
‑
249；疏水肽，hc 171
‑
192和hc 276
‑
338。
118.图39示出了在非还原和还原肽图中轻链肽的回收。将回收％(y轴)相对于对照样品中的相应肽进行归一化。表征的lc肽在x轴上指示。
119.图40描绘了对fc5
‑
li81的血清和csf pk评估。分别通过尾静脉以65nmol/kg静脉内施用样品，并且测定血清样品(顶图)和来自小脑延髓池的csf样品(中图)中注射后指定时间点的抗体水平。每个时间点的配对的csf/血清比率(％)都绘制在底图中。结果是2只独立动物的平均值。
120.图41示出了三种显示体外稳定性得到最大改善的二硫化物稳定化的fc5
‑
li81变体的血清pk评估。分别通过尾静脉以65nmol/kg静脉内施用样品，并且测定血清中注射后指定时间点的抗体水平。结果是2只独立动物的平均值。
121.图42a描绘了三种显示体外稳定性得到最大改善的二硫化物稳定化的fc5
‑
li81变体的脑水平评估。分别通过尾静脉以65nmol/kg静脉内施用样品，并且测定血清样品中注射后指定时间点的抗体水平。
122.图42b描绘了三种显示体外稳定性得到最大改善的二硫化物稳定化的fc5
‑
li81变体的csf水平评估。分别通过尾静脉以65nmol/kg静脉内施用样品，并且测定来自小脑延髓池的csf样品中注射后指定时间点的抗体水平。
123.图42c示出了每个时间点三种二硫化物稳定化的fc5
‑
li81变体的配对的csf/血清比率(％)的曲线图。结果是2只独立动物的平均值。
124.图42d描绘了在24小时时间点测量的三种二硫化物稳定化的fc5
‑
li81变体的脑水平。
125.图43a示出了对大鼠中fc5
‑
li81的血清和csf pk评估。分别通过尾静脉以65nmol/kg静脉内施用样品，并且通过mrm测定血清样品中注射后指定时间点的抗体水平。结果是2
‑
3只独立动物的平均值。分子设计示意图显示在左侧。
higg1融合的fc5
‑
h62(t33c/a104c)或fc5
‑
h32的胃蛋白酶消化物(37℃下2.5小时)的sds
‑
page分析。
137.图49是非限制性的示例性二价fc5融合格式的示意图。
具体实施方式
138.药物向中枢神经系统(cns)的递送已成为治疗神经系统疾病的主要问题，因为血脑屏障(bbb)是阻止大多数治疗性分子进入大脑的障碍。如果没有进入大脑，这些分子的治疗潜力可能会受损或消除。
139.本公开部分地基于包含人源化fc5以及二硫化物工程化的fc5的分子。这些分子可用于将感兴趣的“货物”(例如抗体、抗原结合片段、肽、酶和核酸(例如反义寡核苷酸))转运至cns。在一些实施方案中，这些分子跨bbb进行胞吞转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达(或被修饰成不表达)tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。本公开涵盖每一种fc5治疗剂(例如抗体)格式，包括图48中示意性示出的单价fc5格式。
140.人源化fc5
141.fc5是一种骆驼科单结构域抗体，可以跨bbb进行胞吞转移，并且可以将生物活性分子递送至cns(参见例如muruganandam等人,faseb j.,16:240
‑
242(2002)；abulrob等人,j neurochem.,95:1201
‑
1214(2005)；haqqani等人,mol.pharmaceutics,10:1542
‑
1556(2013)；farrington等人,faseb j.,28:4764
‑
4778(2014)；美国专利号9,676,849)。野生型fc5的氨基酸序列提供于seq id no:1中。
142.fc5具有物种交叉反应性，可以与大鼠、小鼠和人脑内皮细胞结合。本公开的特征尤其是人源化的fc5抗体可变结构域。这些人源化的fc5抗体可变结构域降低了人类对fc5免疫原性的潜在风险，同时保持了溶解度和稳定性。fc5序列抗体可变结构域与人vh3共有框架具有不同程度的同源性。
143.骆驼科动物vhh结构域框架与人vh3家族的重链可变结构域框架高度同源。为了构建人vh3共有框架，使用clustal omega获得了多序列比对(msa)(www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/)，它总结了截至2014年8月25日存放在imgt中的所有人类功能和orf vh3基因。共有框架被定义为msa每个位置最高频率的氨基酸序列，并与人jh4基因的第一个等位基因组合(ighj4*01，imgt术语)以获得完整的vh结构域的框架。在1、2、3框架区，共有框架与人vh3基因第四个等位基因ighv3
‑
23*04的构架相同。fc5具有15个不同于人vh3共有框架的框架残基。骆驼科动物残基37、44、45和47位于与人igg中vh/vl界面对应的表面上。这些残基可以强烈影响单结构域抗体的溶解度、表达水平或结合亲和力，但是这些作用还取决于每个单独的单结构域抗体的cdr。
144.野生型fc5的互补决定区(cdr)位于seq id no:1的位置23
‑
35(cdr1)、50
‑
66(cdr2)和97
‑
111(cdr3)处且提供于下文中：
145.野生型fc5 cdr1：aasgfkithytmg(seq id no:47)
146.野生型fc5 cdr2：ritwggdntfysnsvkg(seq id no:50)
147.野生型fc5 cdr3：aagststatplrvdy(seq id no:51)。
148.在一些实施方案中，本公开的fc5多肽具有选自以下所列的氨基酸序列中的一种的cdr1。
149.aasgfkithyttg(seq id no:57)
150.aasgfkithytcg(seq id no:48)
151.aasgfkithycmg(seq id no:58)
152.aasgfkithyctg(seq id no:49)
153.在某些实施方案中，本公开的fc5多肽具有选自以下所列的氨基酸序列中的一种的cdr3。
154.aagstctatplrvdy(seq id no:52)
155.aagstscatplrvdy(seq id no:53)
156.aagststctplrvdy(seq id no:54)
157.aagststacplrvdy(seq id no:55)
158.在某些实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:47中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的具有两个或更少的(例如2个、1个、0个)氨基酸取代的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的具有两个或更少的氨基酸取代的cdr2和包含seq id no:51中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的具有两个或更少的氨基酸取代的cdr3。在一些实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:47中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的具有两个或更少的(例如2个、1个、0个)氨基酸取代的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:51中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的具有两个或更少的氨基酸取代的cdr3。在某些实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:47中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的具有一个或无氨基酸取代的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的具有一个或无氨基酸取代的cdr2和包含seq id no:51中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的具有一个或无氨基酸取代的cdr3。在一些实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:47中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的具有一个或无氨基酸取代的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:51中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的具有一个或无氨基酸取代的cdr3。上述抗体可变结构域可以人源化。在一些情况下，在所有上述实施方案中，氨基酸取代发生在seq id no:1的位置33、34、102、103、104或105中的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个)处。在一些实施方案中，这些分子跨bbb进行胞吞转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
159.在某些实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:57中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:52中所示的氨基酸
序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:57中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:53中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:57中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:54中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:57中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:55中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在一些实施方案中，这些分子跨bbb进行胞吞转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
160.在某些实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:48中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:52中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:48中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:53中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:48中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:54中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:48中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:55中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在一些实施方案中，这些分子跨bbb进行胞吞转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
161.在某些实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:58中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:52中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:58中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含
seq id no:53中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:58中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:54中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:58中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:55中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在一些实施方案中，这些分子跨bbb进行胞吞转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
162.在某些实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:49中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:52中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:49中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:53中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:49中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:54中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在其它实施方案中，本公开的抗体可变结构域包含一种多肽，所述多肽包含：包含seq id no:49中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr1、包含seq id no:50中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr2和包含seq id no:55中所示的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成的cdr3。在一些实施方案中，这些分子跨bbb进行胞吞转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达(或被修饰成不表达)tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
163.在一些情况下，本公开的人源化fc5多肽包含与seq id no:1中所示的序列至少80％(例如至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％)同一的氨基酸序列。在一种情况下，人源化fc5多肽包含与seq id no:1中所示的序列至少85％同一的氨基酸序列。这些人源化fc5多肽能够跨越血脑屏障转移，因此可以运送“货物”(例如生物活性部分，诸如抗体或其抗原结合片段、小分子药物、反义寡核苷酸、酶、肽)至cns。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a (uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达(或被修饰成不表达)tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野
生型fc5(seq id no:1)相比降低。在一些实施方案中，这些fc5多肽具有与seq id no:1相比在seq id no:1的三十个或更少(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)氨基酸处的氨基酸取代。在某些实施方案中，这些fc5多肽具有与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置5、6、14、75、87、88、93、114和117对应的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)位置处的氨基酸取代。本公开涵盖在seq id no:1的上述九个位置的所有可能变换处具有取代的fc5抗体可变结构域。可取代的seq id no:1的位置的非限制性实例包括：5和6；5、6和14；5、6、14和75；5、6、14、75和87；5、6、14、75、87和88；5、6、14、75、87、88和93；5、6、14、75、87、88、93和114；5、6、14、75、87、88、93、114和117；5和14；5、14和75；5、14、75和87；5、14、75、87和88；5、14、75、87、88和93；5、14、75、87、88、93和114；5、14、75、87、88、93、114和117；5和75；5、75和87；5、75、87和88；5、75、87、88和93；5、75、87、88、93和114；5、75、87、88、93、114和117；5和87；5、87和88；5、87、88和93；5、87、88、93和114；5、87、88、93、114和117；5和88；5、88和93；5、88、93和114；5、88、93、114和117；5和93；5、93和114；5、93、114和117；5和114；5、114和117；以及5和117。在一些实施方案中，上述抗体可变结构域还包括包含seq id no:47中所示的序列的cdr1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2和包含seq id no:51中所示的序列的cdr3。在其它实施方案中，这些抗体可变结构域还包括cdr1包含seq id no:57中所示的序列、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2和包含seq id no:51中所示的序列的cdr3。在一些实施方案中，抗体可变结构包含以下中的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或9个)：在与seq id no:1的位置5对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置6对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置14对应的位置处的脯氨酸；在与seq id no:1的位置75对应的位置处的丝氨酸；在与seq id no:1的位置87对应的位置处的精氨酸；在与seq id no:1的位置88对应的位置处的丙氨酸；在与seq id no:1的位置93对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置114对应的位置处的谷氨酰胺；或在与seq id no:1的位置117对应的位置处的亮氨酸。上述抗体可变结构域可以包含其它氨基酸取代，例如下文所述的那些。
164.在某些实施方案中，抗体可变结构具有与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、37、44、45、47和79对应的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个)位置处的氨基酸取代。本公开涵盖在seq id no:1的上述六个位置的所有可能变换处具有取代的抗体可变结构域。
165.在一些情况下，上述抗体可变结构域还包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置44和45对应的位置中的一个或多个处的氨基酸取代。在一些状况下，所述氨基酸序列包含在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸和/或在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸。这些抗体可变结构域能够跨越血脑屏障转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
166.在某些情况下，本公开的抗体可变结构还包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、44和45对应的位置中的一个或多个处的氨基酸取代。在一些状况下，所述氨
基酸序列包含以下中的一个或多个(例如1、2或3个)：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；或在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸。这些抗体可变结构域能够跨越血脑屏障转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
167.在其它情况下，本公开的抗体可变结构还包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置44、45和47对应的位置中的一个或多个处的氨基酸取代。在一些状况下，所述氨基酸序列包含以下中的一个或多个(例如1、2或3个)：在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；或在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸。这些抗体可变结构域能够跨越血脑屏障转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
168.在一些情况下，本公开的抗体可变结构另外包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、44、45和47对应的位置中的一个或多个处的氨基酸取代。在一些状况下，所述氨基酸序列包含以下中的一个或多个(例如1、2、3或4个)：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；或在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸。这些抗体可变结构域能够跨越血脑屏障转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
169.在某些情况下，本公开的抗体可变结构还包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置37、44、45和47对应的位置中的一个或多个处的氨基酸取代。在一些状况下，所述氨基酸序列包含以下中的一个或多个(例如1、2、3或4个)：在与seq id no:1的位置37对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；或在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸。这些抗体可变结构域能够跨越血脑屏障转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
170.在一些情况下，本公开的抗体可变结构另外包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、37、44、45和47对应的位置中的一个或多个处的氨基酸取代。在一些状况下，所述氨基酸序列包含中的一个或多个(例如1、2、3、4或5个)：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置37对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；或在
与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸。这些抗体可变结构域能够跨越血脑屏障转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
171.在其它情况下，本公开的抗体可变结构还包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置37、44、45、47和79对应的位置中的一个或多个处的氨基酸取代。在一些状况下，所述氨基酸序列包含中的一个或多个(例如1、2、3、4或5个)：在与seq id no:1的位置37对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸；或在与seq id no:1的位置79对应的位置处的亮氨酸。这些抗体可变结构域能够跨越血脑屏障转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
172.在一些情况下，上述抗体可变结构域还包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、37、44、45、47或79对应的位置中的一个或多个处的氨基酸取代。在一些状况下，所述氨基酸序列包含以下中的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个)：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置37对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸；或在与seq id no:1的位置79对应的位置处的亮氨酸。这些抗体可变结构域能够跨越血脑屏障转移。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
173.人源化fc5分子的示例性非限制性实例描述于本公开的实施例4中。在某些情况下，人源化fc5多肽包含与seq id no.:10
‑
17中的任一个中所示的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的氨基酸序列，其中人源化fc5分子可以跨bbb进行胞吞转移。在一个实施方案中，人源化fc5多肽包含seq id no:10中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，人源化fc5多肽包含seq id no:11中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，人源化fc5多肽包含seq id no:12中所示的氨基酸序列。在又一实施方案中，人源化fc5多肽包含seq id no:13中所示的氨基酸序列。在不同实施方案中，人源化fc5多肽包含seq id no:14中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，人源化fc5多肽包含seq id no:15中所示的氨基酸序列。在又一实施方案中，人源化fc5多肽包含seq id no:16中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，人源化fc5多肽包含seq id no:17中所示的氨基酸序列。人源化fc5变体的生物活性可以使用例如体外bbb transwell细胞培养分析，使用sv
‑
arbec细胞，如本公开的实施例2中所述来评估。
174.fc5的稳定化
175.如本公开的实施例3中所示，fc5在血清中可能不稳定。当暴露于血清时，蛋白水解可能发生在fc5内的一个或多个位点。稳定fc5可以降低其对蛋白水解降解的敏感性，因此fc5可以开发用于临床。在一个实施方案中，通过在fc5分子内引入第二个二硫键来稳定本公开的fc5分子。
176.从未处理的美洲驼单结构域抗体库中分离的fc5包含单个二硫键。在所有骆驼科动物的vhh种系中，大约有一半含有第三个半胱氨酸，因此可以在体细胞高突变过程中获得第四个半胱氨酸，而且许多骆驼科vhh具有两个二硫键。
177.除了由cys22和cys96形成的半胱氨酸(所有免疫球蛋白可变结构域共有)之外，还采取了几种策略向fc5添加第二个二硫键。在第一种策略中，fc5被工程化成在位置34和79(位置编号基于图1)上包括半胱氨酸形成的第二个二硫键，分别连接框架区2和3中的β链c和e。c34在cdr
‑
h1的末端，在β链c的开头。这种二硫键位于蛋白质小球的内部，可以提高4至18℃之间的热解链温度(tm)。第二种策略涉及将可以容纳形成二硫化物的半胱氨酸的空间上接近的内部位置组合。这种策略依赖于位置49和70(位置编号基于图1)，它们再次连接框架区2和3中的链c'和e。对于这种策略，可以提高6至19℃之间的tm。第三种二硫化物稳定策略是将cdr
‑
h1中的面向外部的位置33与cdr
‑
h3中的各个位置(位置102、103、104和105)相连，在vhh中，这些位置通常折叠在与常规抗体中的vh/vl界面对应的侧面上。因此，这个环间二硫键是部分暴露于溶剂的。
178.本发明特征在于一种抗体可变结构域，所述抗体可变结构域跨血脑屏障迁移并且与seq id no:1至少80％同一(例如至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少95％、至少97％或100％同一)。在一些情况下，所述抗体可变结构域包含：包含seq id no:47中所示的序列的cdr1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2、包含seq id no:51中所示的序列的cdr3，并且所述氨基酸序列在与seq id no:1的位置49和70对应的位置处包含半胱氨酸。在其它情况下，所述抗体可变结构域包含：包含seq id no:48中所示的序列的cdr1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2、包含seq id no:51中所示的序列的cdr3，并且所述氨基酸序列在与seq id no:1的位置79对应的位置处包含半胱氨酸。在某些情况下，所述抗体可变结构域包含：包含seq id no:49中所示的序列的cdr1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2和包含seq id no:52中所示的序列的cdr3。在一些情况下，所述抗体可变结构域包含：包含seq id no:58中所示的序列的cdr1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2和包含seq id no:52中所示的序列的cdr3。在某些情况下，所述抗体可变结构域包含：包含seq id no:49中所示的序列的cdr1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2和包含seq id no:53中所示的序列的cdr3。在某些情况下，所述抗体可变结构域包含：包含seq id no:58中所示的序列的cdr1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2和包含seq id no:53中所示的序列的cdr3。在一些情况下，所述抗体可变结构域包含：包含seq id no:49中所示的序列的cdr1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2和包含seq id no:54中所示的序列的cdr3。在某些情况下，所述抗体可变结构域包含包含seq id no:58中所示的序列的cdr1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2和包含seq id no:54中所示的序列的cdr3。在某些情况下，所述抗体可变结构域包含：包含seq id no:49中所示的序列的cdr1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2和包含seq id no:55中所示的序列的cdr3。在又一状况下，所述抗体可变结构域包含：包含seq id no:58中所示
的序列的cdr1、包含seq id no:50中所示的序列的cdr2和包含seq id no:55中所示的序列的cdr3。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
179.上述抗体可变结构域相对于seq id no:1中所示的氨基酸序列可以包括三十个或更少(例如30个、29个、28个、27个、26个、25个、24个、23个、22个、21个、20个、19个、18个、17个、16个、15个、14个、13个、12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个、3个、2个或1个)氨基酸取代。在某些状况下，氨基酸取代是保守氨基酸取代。在一些情况下，所述抗体可变结构域包含与seq id no:1相比在与seq id no:1的位置1、5、6、14、37、44、45、47、75、87、88、93、114或117对应的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个)位置处的取代。在某些情况下，所述氨基酸序列包含以下中的一个或多个(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个)：在与seq id no:1的位置1对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置5对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置6对应的位置处的谷氨酸；在与seq id no:1的位置14对应的位置处的脯氨酸；在与seq id no:1的位置37对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置44对应的位置处的甘氨酸；在与seq id no:1的位置45对应的位置处的亮氨酸；在与seq id no:1的位置47对应的位置处的色氨酸；在与seq id no:1的位置75对应的位置处的丝氨酸；在与seq id no:1的位置87对应的位置处的精氨酸；在与seq id no:1的位置88对应的位置处的丙氨酸；在与seq id no:1的位置93对应的位置处的缬氨酸；在与seq id no:1的位置114对应的位置处的谷氨酰胺；或在与seq id no:1的位置117对应的位置处的亮氨酸。在一些实施方案中，这些分子可以直接或间接结合于人tmem30a(uniprotkb
‑
q9nv96)。在某些实施方案中，与不表达tmem30a或被修饰成不表达tmem30a的细胞相比，这些分子更好地结合表达tmem30a的细胞。在一些实施方案中，这些分子在人血清中的不稳定性与野生型fc5(seq id no:1)相比降低。
180.二硫化物稳定化策略可以用于野生型fc5或人源化fc5分子。本公开的实施例5提供了二硫化物稳定化的抗体可变结构域的非限制性实例。本公开涵盖一种抗体可变结构域，所述抗体可变结构域包含与seq id no.:20
‑
28中的任一个至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的氨基酸序列，其中所述抗体可变结构域可以跨bbb进行胞吞转移。在一个实施方案中，二硫化物稳定化的抗体可变结构域具有seq id no:20中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，二硫化物稳定化的抗体可变结构域具有seq id no:21中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，二硫化物稳定化的抗体可变结构域具有seq id no:22中所示的氨基酸序列。在又一实施方案中，二硫化物稳定化的抗体可变结构域具有seq id no:23中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，二硫化物稳定化的抗体可变结构域具有seq id no:24中所示的氨基酸序列。在一些实施方案中，二硫化物稳定化的抗体可变结构域具有seq id no:25中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，二硫化物稳定化的抗体可变结构域具有seq id no:26中所示的氨基酸序列。在另一实施方案中，二硫化物稳定化的抗体可变结构域具有seq id no:27中所示的氨基酸序列。在某些实施方案中，二硫化物稳定化的抗体可变结构域具有seq id no:28中所示的氨基酸序
列。
181.嵌合分子
182.本公开的特征还在于包含本文公开的任何抗体可变结构域(例如人源化、二硫化物稳定化或人源化和二硫化物稳定化的抗体可变结构域)的嵌合分子。在某些实施方案中，嵌合分子包含二聚体部分(例如fc)或其它融合蛋白(例如人血清白蛋白(hsa)
–
注意，白蛋白不是二聚体，但可以在其n端和/或c端融合)。在一些情况下，本文公开的抗体可变结构域的c端直接或间接连接至二聚体部分的每个成员的n端。在某些状况下，嵌合分子包含抗体、抗体的抗原结合片段、单链抗体、肽、酶、核酸(例如反义寡核苷酸)、小分子药物或者包封生物活性部分，例如核酸、小分子药物或肽的脂质体或脂质纳米粒子。图48中以示意图形式提供了本公开的嵌合融合物的非限制性实例。
183.fc区
184.在一些情况下，嵌合分子包括抗体fc区。如本文所用，术语“fc区”被定义为免疫球蛋白的由其两条重链的各自fc结构域(或fc部分)的二聚体缔合而形成的部分。天然fc区是同源二聚体，并包含两条多肽链。本公开的fc区可以是同二聚体(相同的fc结构域)或异二聚体(不相同的fc结构域)。如本文所用，术语“fc结构域”或“fc部分”是指包含ch2结构域和ch3结构域的免疫球蛋白的单条多肽链或其变体。在一些实施方案中，fc区来自人igg1、人igg2、人igg3或人igg4。在某些实施方案中，fc区是无糖基化的(例如n297q或t299a)。在某些实施方案中，fc区是人igg1 agly fc区。在某些实施方案中，fc区含有人igg4p agly ch2结构域和人igg1 ch3结构域。在某些情况下，相对于野生型对应物，fc区或fc结构域具有降低的效应功能。igg抗体以各种同种异型和同族同种异型(isoallotype)存在，并且本公开内容涵盖这些中的每一种。在某些实施方案中，本公开的fc区包括具有g1m1、ng1m2、g1m3、g1m17,1、g1m17,1,2、g1m3,1或g1m17同种型的igg1重链fc。这些同种异型或同族同种异型的特征在于在igg1重链恒定区(fc)(eu编号)中所示位置的以下氨基酸残基：g1m1：d356、l358；ng1m1：e356、m358；g1m3：r214、e356、m358、a431；g1m17,1：k214、d356、l358、a431；g1m17,1,2：k214、d356、l358、g431；g1m3,1：r214、d356、l358、a431；以及g1m17：k214、e356、m358、a431。示例性fc结构域序列提供于下文中。
185.igg1的fc(igg1m3)：
186.apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:61)
187.igg1 agly抗体的fc(应该理解，可以使用其它抗体型式，例如t299a)：
188.apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyqstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:62)
189.igg2的fc：
190.appvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfyps
diavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:63)
191.igg2 saa的fc：
192.appaaapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:64)
193.注意，“saa”型式还包括铰链中的c222s突变：erkscvecppcp(seq id no:95)
194.igg3的fc：
195.apellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfkwyvdgvevhnaktkpreeqynstfrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewessgqpennynttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnifscsvmhealhnrftqkslslspg(seq id no:65)
196.igg4的fc：
197.apeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslg(seq id no:66)
198.igg4 agly/g1的fc：
199.apeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfqstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:67)
200.在某些情况下，fc结构域可包括一个或多个相对于野生型fc结构域的突变。例如，可以进行一个或多个突变以：降低效应功能、提高稳定性、改善药代动力学和/或增加半衰期。在某些状况下，每个igg1 fc结构域的c端残基都被删除(即最终的赖氨酸被去除)，因为可以在此c端赖氨酸上进行剪接和/或进行酶切，产生产物异质性。在某些情况下，igg1 fc结构域的c端残基是赖氨酸残基。在某些情况下，igg1 fc结构域的c端残基从赖氨酸变成半胱氨酸。这允许c端位点缀合。在一些情况下，fc结构域包含s442c突变(根据eu索引编号)。在一些状况下，可以引入突变以促进异二聚化(例如包含杵臼突变(knob
‑
into
‑
hole mutation)、电转向突变、duobody突变等)。这样的突变是本领域众所周知的。参见例如ridgway等人,protein engineering 9(7):617
‑
21(1996)；us 5,807,706；us 9,862,778；wo2017/106462；labrijn等人,pnas,110(13):5145
‑
5150(2013)；gramer等人mabs,5(6):962
‑
973(2013)；labrijn等人nature protocols,9(10):2450
‑
63(2014)。
201.包含杵臼突变的fc结构域：
[0202][0203]
包含电转向突变的fc结构域：
[0204][0205]
包含duobody突变的fc结构域：
[0206]
第1对：
[0207]
kuhlman demarest 20.8.34：“a”侧
[0208][0209]
kuhlman demarest 20.8.34：“b”侧
[0210]
第2对：
[0211]
kuhlman demarest 7.8.60：“a”侧
[0212]
kuhlman demarest 7.8.60：“b”侧
[0213]
第3对：
[0214]
mp43a：s364k/k409l
[0215][0216]
mp43b：k370s/f405k
[0217][0218]
第4对：
[0219]
zw1a：t350v/l351y/f405a/y407v
[0220][0221]
zw1b：t350v/t366l/k392l/t394w
[0222][0223]
在某些情况下，fc区具有与seq id no.:61
‑
101中的任一个至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同一的fc结构域。在某些实施方案中，fc区具有比对应的野生型fc区更低的效应功能。
[0224]
铰链区
[0225]
在某些情况下，嵌合分子可包括抗体铰链区。在一些情况下，嵌合分子包括抗体铰链区和抗体fc区。铰链区可以直接或经由接头与fc部分融合。举例来说，铰链连接上述抗体可变结构域的c端和fc结构域的ch2结构域的n端。铰链区可以是任何具有一个至30个(即1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个)氨基酸的柔性肽序列。在一些情况下，铰链区的长度为一个至20个氨基酸。在其它情况下，铰链区的长度为一个至18个氨基酸。在一些状况下，铰链区是来自人igg1、人igg2、人igg3或人igg4的铰链。在某些状况下，这些铰链区可以被工程化成包括一个或多个氨基酸取代(例如igg4中的s228p)。在某些情况下，铰链区包含氨基酸序列aepkscd(seq id no:56)。在其它情况下，铰链区包含氨基酸序列aepkssd(seq id no:59)。在其它情况下，铰链区包含氨基酸序列kthtcppcp(seq id no:19)。在某些情况下，铰链区包含氨基酸序列aepkscdkthtcppcp(seq id no:74)。在其它情况下，铰链区包含氨基酸序列aepkssdkthtcppcp(seq id no:75)。在其它情况下，铰链区包含氨基酸序列ggggsdkthtcppcp(seq id no:76)。在一些情况下，铰链区包含氨基酸序列verkccvecppcp(seq id no:102)。在其它情况下，铰链区包含氨基酸序列veskygppcpscp(seq id no:103)。在其它情况下，铰链区包含氨基酸序列
elktplgdtthtcprcp(seq id no:104)。在其它情况下，铰链区包含氨基酸序列epkscdtpppcprcp(seq id no:105)。
[0226]
在某些实施方案中，嵌合分子与另一种嵌合分子同源二聚或异源二聚。例如，如果嵌合分子的fc结构域相同，则它们同源二聚化而形成同源二聚fc区。但是，如果嵌合分子的fc结构域不同(例如，它们含有杵臼、电转向或duobody突变)，则它们会异源二聚化而形成异源二聚fc区。本公开的抗体可变结构域的c端可以直接连接或通过间插氨基酸序列连接至铰链区的n端，而铰链区的n端又经由其c端连接至fc结构域的ch2结构域的n端。
[0227]
接头
[0228]
在一些情况下，嵌合分子包括一个或多个接头。对接头没有具体的限制，其连接嵌合分子的不同区域(例如连接所述抗体可变结构域至治疗性抗体的vh或vl结构域的n端；连接所述抗体可变结构域至治疗性部分；连接fc区的fc结构域的c端至治疗性抗体或其片段的n端；连接fc区的fc结构域的c端至治疗性部分；连接所述抗体可变结构域至铰链区)。在一些实施方案中，接头是肽接头。任何任意单链肽包含约一个至30个氨基酸残基(例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30氨基酸残基)可以用作接头。这类肽接头的实例包括：gly；ser；gly ser；gly gly ser；ser gly gly；gly gly gly ser(seq id no:77)；ser gly gly gly(seq id no:78)；gly gly gly gly ser(seq id no:5)；ser gly gly gly gly(seq id no:79)；gly gly gly gly gly ser(seq id no:80)；ser gly gly gly gly gly(seq id no:81)；gly gly gly gly gly gly ser(seq id no:82)；ser gly gly gly gly gly gly(seq id no:83)；(gly gly gly gly ser)
n
(seq id no:5)
n
，其中n是一或更大的整数；以及(ser gly gly gly gly)
n
(seq id no:79)
n
，其中n是一或更大的整数。
[0229]
在其它实施方案中，接头肽被修饰成使得所述氨基酸序列gsg(出现在传统的gly/ser接头肽重复序列的连接处)不存在。举例来说，肽接头包含选自由以下组成的组的氨基酸序列：(gggxx)
n
ggggs(seq id no:84)和ggggs(xgggs)
n
(seq id no:85)，其中x是可以插入序列中并且不产生多肽的任何氨基酸，所述多肽包含：序列gsg，并且n是0至4。在一个实施方案中，接头肽的序列是(gggx1x2)
n
ggggs并且x1是p并且x2是s并且n是0至4(seq id no:86)。在另一实施方案中，接头肽的序列是(gggx1x2)
n
ggggs和x1是g和x2是q并且n是0至4(seq id no:87)。在另一实施方案中，接头肽的序列是(gggx1x2)
n
ggggs并且x1是g并且x2是a并且n是0至4(seq id no:88)。在又一实施方案中，接头肽的序列是ggggs(xgggs)
n
，并且x是p并且n是0至4(seq id no:89)。在一个实施方案中，本发明的接头肽包含氨基酸序列(gggga)2ggggs(seq id no:90)或由所述氨基酸序列组成。在另一实施方案中，接头肽包含氨基酸序列(ggggq)2ggggs(seq id no:91)或由所述氨基酸序列组成。在又一实施方案中，接头肽包含氨基酸序列(gggps)2ggggs(seq id no:92)或由所述氨基酸序列组成。在另一实施方案中，接头肽包含氨基酸序列ggggs(pgggs)2(seq id no:93)或由所述氨基酸序列组成。
[0230]
在某些实施方案中、接头是合成化合物接头(化学交联剂)。交联剂的实例包括n
‑
羟基琥珀酰亚胺(nhs)、双琥珀酰亚胺基辛二酸酯(dss)、双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯(bs3)、二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)(dsp)、二硫代双(磺基琥珀酰亚胺基丙酸酯)(dtssp)、乙二醇双(琥珀酰亚胺基琥珀酸酯)(egs)、乙二醇双(磺基琥珀酰亚胺基琥珀酸
酯)(磺基
‑
egs)、双琥珀酰亚胺基酒石酸酯(dst)、二磺基琥珀酰亚胺基酒石酸酯(磺基
‑
dst)、双[2
‑
(琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(bsocoes)、[2
‑
(磺基琥珀酰亚胺基氧基羰基氧基)乙基]砜(磺基
‑
bsocoes)、磺基
‑
smcc系列和双马来酰亚胺己烷(bmh)系列交联剂。
[0231]
xten
[0232]
在一些情况下，嵌合分子包括xten序列。“xten序列”是指具有非天然存在的主要由小的亲水性氨基酸组成的基本上非重复序列的延伸长度的多肽，该序列在生理条件下具有低程度的或不具有二级或三级结构。作为嵌合分子伴侣，xten可以用作运载体，当与凝血因子、凝血因子的重链、轻链或凝血因子、靶向部分或嵌合分子上的任何其它序列或分子时，赋予某些理想的药代动力学、物理化学和药物特性。这些理想的特性包括但不限于增强的药代动力学参数和溶解特性。
[0233]
在一些实施方案中，本发明的xten序列是具有超过约20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、450个、500个、550个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个、950个、1000个、1200个、1400个、1600个、1800个或2000个氨基酸残基的肽或多肽。在某些实施方案中，xten是具有超过约20个至约3000个氨基酸残基、超过30个至约2500个残基、超过40个至约2000个残基、超过50个至约1500个残基、超过60个至约1000个残基、超过70个至约900个残基、超过80个至约800个残基、超过90个至约700个残基、超过100个至约600个残基、超过110个至约500个残基或超过120个至约400个残基的肽或多肽。
[0234]
下表提供了非限制性xten的氨基酸序列。
[0235]
示例性xten序列
[0236]
[0237]
[0238][0239]
在一些情况下，xten选自由以下组成的组：ae42、ag42、ae42_2、ae42_3、ae48、am48、ae72、ae72_2、ae72_3、ag72、ae108、ag108、ae144、af144、ae144_2、ae144_3、ag144、ae180、ag180、ae216、ag216、ae252、ag252、ae288、ag288、ae295、ae324、ag324、ae360、ag360、ae396、ag396、ae432、ag432、ae468、ag468、ae504、ag504、af504、ae540、ag540、af540、ad576、ae576、af576、ag576、ae612、ag612、ae624、ae648、ag648、ag684、ae720、ag720、ae756、ag756、ae792、ag792、ae828、ag828、ad836、ae864、af864、ag864、ae872、ae884、am875、ae912、am923、am1318、bc864、bd864、ae948、ae1044、ae1140、ae1236、ae1332、ae1428、ae1524、ae1620、ae1716、ae1812、ae1908、ae2004a、ag948、ag1044、ag1140、ag1236、ag1332、ag1428、ag1524、ag1620、ag1716、ag1812、ag1908和ag2004。在一些情况下，xten选自由以下组成的组：ae42、ae864、ae576、ae288、ae144、ae288、ag864、ag576、ag288和ag144。在一些情况下，xten被选择为ae144。在一些情况下，xten是ae288。
[0240]
可以根据本公开使用的xten多肽的其它实例公开于美国专利号7,855,279和7,846,445；美国专利公布号2009/0092582、2010/0239554、2010/0323956、2011/0046060、2011/0046061、2011/0077199a1、2011/0172146、2012/0178691、2012/0263701或2013/0017997；国际专利公布号wo 2010091122、wo 2010144502、wo 2010144508、wo 2011028228、wo 2011028229、wo 2011028344和wo2013130683。
[0241]
血清白蛋白
[0242]
在一些情况下，嵌合分子包括人血清白蛋白(hsa)作为融合部分而不是fc区。请注
意，虽然hsa不是二聚部分，但是n端和/或c端融合是可能的。在一些实施方案中，本公开的抗体可变结构域的c端直接或间接(例如经由接头或治疗剂(例如抗体、抗体片段、肽、酶、反义寡核苷酸))连接至hsa多肽的n端。
[0243]
hsa具有许多理想的药物特性。这些包括：血清半衰期为19
‑
20天；溶解度约300mg/ml；稳定性好；表达容易；没有效应功能；免疫原性低；以及循环血清水平约为45mg/ml。不具有和具有配体(包括生物学上重要的分子，例如脂肪酸和药物)或与其它蛋白质复合的hsa的晶体结构是本领域众所周知的。参见例如universal protein resource knowledgebase p02768；he等人,nature,358:209
‑
215(1992)；sugio等人,protein eng.,12:439
‑
446(1999)。根据hsa的x射线晶体学研究，该多肽形成一个心形蛋白，尺寸约为厚度为它具有约67％的α
‑
螺旋，但没有β
‑
折叠，可分为三个同源结构域(i
‑
iii)。这三个结构域中的每一个都包含两个子结构域(a和b)。a和b子结构域分别具有六个和四个通过柔性环连接的α螺旋。人血清白蛋白结合配体的主要区域位于子结构域iia和iiia的空腔中，这些空腔主要由疏水性和带正电荷的残基形成，并显示出了相似的化学性质。该分子中的35个半胱氨酸残基中，除一个残基外，所有残基都参与了17个稳定二硫键的形成。牛、马、兔、马科动物和野兔白蛋白的氨基酸序列以及结构是已知的。参见例如majorek等人,mol.immunol.,52:174
‑
182(2012)；bujacz,acta crystallogr.d biol.crystallogr.,68:1278
‑
1289(2012)。人血清白蛋白的许多遗传变体是本领域众所周知的。参见例如由丹麦奥尔胡斯大学(the university of aarhus,denmark)和意大利帕维亚大学维护(the university of pavia,italy)的白蛋白网站，网址为：albumin.org/genetic
‑
variants
‑
of
‑
human
‑
serum
‑
albumin和albumin.org/genetic
‑
variants
‑
of
‑
human
‑
serum
‑
albumin
‑
reference
‑
list。
[0244]
在一个实施方案中，嵌合分子中使用的人血清白蛋白包含以下氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成：
[0245]
dahksevahrfkdlgeenfkalvliafaqylqqcpfedhvklvnevtefaktcvadesaencdkslhtlfgdklctvatlretygemadccakqepernecflqhkddnpnlprlvrpevdvmctafhdneetflkkylyeiarrhpyfyapellffakrykaafteccqaadkaacllpkldelrdegkassakqrlkcaslqkfgerafkawavarlsqrfpkaefaevsklvtdltkvhtecchgdllecaddradlakyicenqdsissklkeccekpllekshciaevendempadlpslaadfveskdvcknyaeakdvflgmflyeyarrhpdysvvlllrlaktyettlekccaaadphecyakvfdefkplveepqnlikqncelfeqlgeykfqnallvrytkkvpqvstptlvevsrnlgkvgskcckhpeakrmpcaedylsvvlnqlcvlhektpvsdrvtkccteslvnrrpcfsalevdetyvpkefnaetftfhadictlsekerqikkqtalvelvkhkpkatkeqlkavmddfaafvekcckaddketcfaeegkklvaasqaalgl(seq id no:94)
[0246]
在另一实施方案中，嵌合分子中使用的人血清白蛋白是具有与seq id no:94中所示的氨基酸序列至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一的氨基酸序列的hsa变体。可以使用blast 2.0程序确定氨基酸序列之间的同一性百分比。可以使用无缺口比对和默认参数(blossom 62矩阵，缺口存在成本为11，每个残基缺口成本为1，λ比为0.85)进行序列比较。blast程序中使用的数学算法在altschul等人,1997,nucleic acids research 25:3389
‑
3402中描述。
[0247]
在某些实施方案中，嵌合分子中使用的人血清白蛋白是可以具有在seq id no:94的序列中具有n端和/或c端缺失(例如n端和/或c端的1
‑
10个、1
‑
9个、1
‑
8个、1
‑
7个、1
‑
6个、1
‑
5个、1
‑
4个、1
‑
3个、1
‑
2个、1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸可能被删除)的hsa变体。在一些情况下，hsa变体具有与具有seq id no:94的氨基酸序列的hsa相同或基本相同的理想药物特性(例如血清半衰期为19
‑
20天；溶解度约为300mg/ml；稳定性好；表达容易；没有效应功能；免疫原性低；和/或循环血清水平约为45mg/ml)。在一些情况下，嵌合分子中使用的hsa是hsa的遗传变体。在一些情况下，hsa变体是在otagiri等人,2009,biol.pharm.bull.32(4),527
‑
534(2009)中公开的77个变体中的任一种。在某些实施方案中，嵌合分子中使用的hsa是相对于seq id no:94的has具有提高的对新生儿fc受体(fcrn)的亲和力的hsa的突变形式。(参见例如us 9,120,875；us 9,045,564；us 8,822,417；us 8,748,380；sand等人,front.immunol.,5:682(2014)；andersen等人,j.biol.chem.,289(19):13492
‑
502(2014)；oganesyan等人,j.biol.chem.,289(11):7812
‑
24(2014)；schmidt等人,structure,21(11):1966
‑
78(2013)；wo 2014/125082a1；wo 2011/051489、wo2011/124718、wo 2012/059486、wo 2012/150319；wo 2011/103076；以及wo 2012/112188，所有这些都通过引用并入本文中)。在某些情况下，hsa突变体是e505g/v547a突变体。在某些情况下，hsa突变体是k573p突变体。具有提高的对fcrn的亲和力的hsa的这类hsa突变体可以用于增加嵌合分子的半衰期。
[0248]
治疗剂
[0249]
嵌合分子可包括治疗剂。治疗剂的实例包括抗体、抗体的抗原结合片段、单链抗体(例如scfv、sc(fv)2)、双功能抗体、纳米抗体、抗体片段、核酸(例如反义寡核苷酸)、肽或酶，可以单独使用，也可以与标准护理治疗结合使用。本公开的嵌合分子可以将治疗剂跨过bbb转运至cns。因此，嵌合分子可用于治疗和/或预防神经系统疾病。示例性神经系统疾病包括阿尔茨海默病、帕金森病、额颞叶痴呆、als、亨廷顿氏病(huntington’s disease)、多发性硬化、脊髓性肌萎缩、肌肉营养不良、脊髓损伤、中风、眼科疾病、急性或慢性视神经炎、精神病、拉塔病(tourette’s disease)脑损伤、脑瘤和癫痫病。
[0250]
用于治疗阿尔茨海默病的示例性治疗剂包括辛酸甘油三酯、抗τ抗体、抗β淀粉样蛋白抗体、抗dkk1抗体、apoe拮抗剂抗体、多奈哌齐(donepezil)、奎尼丁(quinidine)、血清素6受体拮抗剂、β
‑
分泌酶抑制剂、rage拮抗剂、bace抑制剂、淀粉样β蛋白抑制剂、磷酸二酯酶9a抑制剂、双降冰片碱(bisnorcymserine)、苔藓虫素
‑
1(bryostatin
‑
1)、α
‑
7增效剂、嘌呤受体p2y6激动剂、τ蛋白聚集/tdp
‑
43聚集抑制剂、n3pg
‑
aβmab、mglu2激动剂、喹唑啉酮、线粒体蛋白刺激剂、淀粉样蛋白前体蛋白分泌酶抑制剂、5ht6拮抗剂、r
‑
吩色氨酸(r
‑
phenserine)、淀粉样蛋白β/τ蛋白抑制剂、mao
‑
b抑制剂、lp
‑
pla2抑制剂、5
‑
ht6受体拮抗剂、bet蛋白抑制剂、抗原纤维ab mab、诺美唑(nomethiazole)、组胺h3受体拮抗剂、ppar
‑
δ/γ激动剂、阿波紫杉烷(abeotaxane)和p38丝裂原活化蛋白激酶抑制剂。
[0251]
用于治疗als的示例性治疗剂包括抗sod1抗体、抗dr6抗体、抗dpr抗体、右旋普拉克索(dexpramipexole)、阿米康(arimoclomal)、gm6、异丁司特(ibudilast)、巨噬细胞调节剂、nogo
‑
a抑制剂和肌钙蛋白复合物刺激剂。
[0252]
用于治疗脑损伤的示例性治疗剂包括阿朴吗啡(apomorphine)、细胞因子抑制剂/神经肽受体调节剂和黄体酮受体激动剂。
[0253]
用于治疗脑肿瘤的示例性治疗剂包括idh1抑制剂、阿霉素(doxorubicin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、抗egfrviii抗体
‑
药物缀合物、贝伐单抗(bevacizumab)、fgf
‑
r激酶抑制剂、pi3k抑制剂、卡波替尼(cabozantinib)、碘i 131德洛单抗(derlotuximab)生物素、pdgfr抑制剂、羧酰胺基三唑乳清酸酯、喷克力定(penclomidine)的非神经毒性衍生物、戈伐替尼(golvatinib)、地塞那醇(dexanabinol)、tgf
‑
β1激酶抑制剂、阿法替尼(afatinib)、ido抑制剂、卡巴他赛(cabazitaxel)、src激酶/前微管蛋白抑制剂、smo蛋白抑制剂、内皮素a/b受体拮抗剂、蛋白酶体抑制剂、t型钙通道拮抗剂、毒胡萝卜素类似物、伊立替康、尼古鲁单抗、csf
‑
1r抑制剂、培拉瑞普(pelareorep)、egfr拮抗剂、输出蛋白
‑
1蛋白抑制剂/核蛋白抑制剂、birc5蛋白抑制剂、艾伏磷酰胺(evofosfamide)、阿波紫杉烷、eng蛋白抑制剂、反式藏红花酸钠、n7烷基化剂、靶向性抗血管生成剂和维利帕尼(veliparib)。
[0254]
用于治疗癫痫病的示例性治疗剂包括依维莫司(everolimus)、乙酸艾司利卡西平(eslicarbazepine acetate)、阿普唑仑(alprazolam)、布立西坦(brivaracetam)、卡马西平(carbamazepine)、大麻二酚(cannabidiol)、4
‑
氨基丁酸转氨酶抑制剂、吡仑帕奈(perampanel)、gaba
‑
a受体激动剂、合成石杉碱甲、普加巴林(pregabalin)、氯巴占(clobazam)、地西泮(diazepam)、gaba
a
突触和突触外受体调节剂、iv托吡酯(topiramate iv)、拉考酰胺(lacosamide)和血清素受体激动剂。
[0255]
用于治疗遗传性疾病(例如弗里德里希共济失调(friedrich's ataxia)、晚期婴儿神经元蜡样瘤、脊髓和延髓肌萎缩、共济失调性毛细血管扩张症、与泛酸激酶相关的神经变性、脊髓性肌萎缩、家族性淀粉样多神经病、瑞特综合征(rett syndrome)、利氏综合征(leigh syndrome)、威尔森病(wilson’s disease))的示例性治疗剂包括nf/e2相关因子2刺激剂、干扰素γ
‑
1b、rhtpp1酶替代疗法、伐替苯醌(vatiquinone)、去铁酮(deferiprone)、isis
‑
ttrrx、血清素1a受体激动剂、细胞因子抑制剂/神经肽受体调节剂、靶向ttr的sirna抑制剂、磷酸泛酸替代品、dcps抑制剂、酒石酸半胱胺、吲哚丙酸、运甲状腺素蛋白解离抑制剂和双胆碱四硫代钼酸盐。
[0256]
用于治疗头痛的示例性治疗剂包括抗cgrp mab、cgrp受体拮抗剂mab、舒马曲坦(sumatriptan)、右美沙芬(dextromethorphan)/奎尼丁、肉毒杆菌毒素a、血清素1f受体激动剂、nnos抑制剂/5ht、二氢麦角胺(dihydroergotamine)、环苯扎林(cyclobenzaprine)和阿司匹林(aspirin)/舒马曲坦组合。
[0257]
用于治疗亨廷顿氏病的示例性治疗剂包括拉喹莫德(laquinimod)、pde10抑制剂、普利多匹定(pridopidine)、酒石酸半胱胺和vmat2抑制剂。
[0258]
用于治疗多发性硬化的示例性治疗剂包括那他珠单抗(natalizumab)、富马酸单甲酯前药、抗lingo
‑
1抗体、nck蛋白调节剂、s1pr
‑
1/5受体激动剂、芬戈莫德(fingolimod)、抗cd52 mab、艾地苯醌(idebenone)、ppar
‑
γ激动剂/调节剂、拉喹莫德、酪氨酸激酶抑制剂、抗cd19 mab、依布地司特(ibudilast)、瓜纳本斯(guanabenz)、抗cd20 mab、干扰素β
‑
1b、il
‑
7受体抑制剂、s1p1受体激动剂、髓磷脂蛋白刺激剂、雌三醇琥珀酸酯、伊米特尔
‑
t(imilecleucel
‑
t,)、抗vla 2mab、baff
‑
r调节剂、cd100抗原抑制剂、抗dr6抗体和nf
‑
κb抑制剂。
[0259]
用于治疗肌肉营养不良的示例性治疗剂包括肌生长抑制素抑制剂、地拉哌森(drisapersen)、依替普林(eteplirsen)、氟丁酮(halofuginone)、艾地苯醌(idebenone)、
isis
‑
dmpkr
x
、类固醇受体激动剂、gapdh抑制剂、基因转录抑制剂、他达拉非(tadalafil)、阿他洛林(ataluren)和糖皮质激素受体激动剂。
[0260]
用于治疗疼痛的示例性治疗剂包括神经母蛋白、p2x3嘌呤受体拮抗剂、snare蛋白拮抗剂、羟考酮
‑
纳曲酮核(oxycodone
‑
naltrexone core)(耐滥用)、阿米替林(amitriptyline)/氯胺酮(ketamine)、伦他莫德(rintatolimod)、大麻素受体cb2激动剂、非促红细胞生成肽、ppar
‑
γ激动剂、糖原磷酸化酶抑制剂、nmda受体拮抗剂、唑来膦酸(zoledronic acid)、早期生长反应蛋白1抑制剂、组胺3受体拮抗剂、丁丙诺啡(buprenorphine)、细胞因子抑制剂、西布罗泊多(cebranopadol)、塞来昔布(celecoxib)、花生四烯酸类似物、合成辣椒素、nav1.7钠通道抑制剂、阿片类κ受体激动剂、度洛西汀(duloxetine)、神经生长因子刺激剂、右美托咪定(dexmedetomidine)、电压门控钠通道抑制剂、布比卡因(bupivacaine)、2型血管紧张素受体拮抗剂、神经生长因子抑制剂、p38抑制剂、雷帕替尼(rapastinel)、左啡诺(levorphanol)、cgrp mab、普瑞巴林(pregabalin)、mglu2/3受体激动剂、cacna2d1蛋白调节剂、骨吸收因子抑制剂、神经母蛋白、μ阿片类镇痛药、nnos抑制剂、o
‑
去甲基曲马多、棕榈酰乙醇酰胺、gabaa激动剂、trpv
‑
1受体激动剂、萘比莫斯(nabiximols)、环加氧酶2抑制剂、神经生长因子调节剂、环苯扎林(cyclobenzaprine)、氟比洛芬(flurbiprofen)、脂肪酸酰胺水解酶抑制剂和布洛芬(ibuprofen)/磷脂酰胆碱。
[0261]
用于治疗帕金森病的示例性治疗剂包括金刚烷胺(amantadine)、阿扑吗啡(apomorphine)、α7烟碱乙酰胆碱受体局部激动剂、抗α
‑
突触核蛋白抗体、α
‑
突触核蛋白抑制剂、左旋多巴(levodopa)、d1增效剂、双吡咯酮(dipraglurant)、血清素1a/1b部分激动剂、非帕美唑(fipamezole)、gm6、类维生素ax受体激动剂、异麦草碱、罗替戈汀(rotigotine)、普拉克索/雷沙吉兰(rasagiline)、r
‑
吩色氨酸、血清素2a/6受体拮抗剂、腺苷a2a受体拮抗剂、沙芬酰胺(safinamide)和多巴胺受体激动剂。
[0262]
用于治疗痉挛的示例性治疗剂包括巴氯芬(baclofen)、阿诺布林毒素a(onabotulinumtoxina)、阿博布林毒素a(abobotulinumtoxina)、阿巴洛芬(arbaclofen)、萘比莫斯和英库布毒素a(incobotulinumtoxina)。
[0263]
用于治疗脊髓损伤的示例性治疗剂包括抗lingo
‑
1抗体、抗ngr1抗体、神经母蛋白、神经系统调节剂、ρgtp结合蛋白抑制剂和成纤维细胞生长因子受体。
[0264]
用于治疗中风的示例性治疗剂包括那他珠单抗、人野生型活化蛋白c的重组突变体形式、替卡格雷(ticagrelor)、达氟哌啶(dalfampridine)、阿司匹林、尼莫地平(nimodipine)微粒、gm6、parp抑制剂、pdz结构域抑制剂、β淀粉样蛋白抑制剂、达比加群(dabigatran)和亚硝酸钠。
[0265]
用于治疗拉塔综合征的示例性治疗剂包括组胺3受体拮抗剂、4
‑
氨基丁酸酯转氨酶抑制剂、肉毒杆菌毒素a、ecopipam(依考匹泮)、vmat2抑制剂、阿坎酸(acamprosate)和氨已烯酸(vigabatrin)。
[0266]
用于治疗其它神经系统疾病的其它示例性治疗剂包括肌肉生长抑制素抑制剂、nf/e2相关因子2刺激剂、抗τ抗体、髓过氧化物酶抑制剂、线粒体通透性转运孔抑制剂、贝利木单抗(belimumab)、ii
‑
b型激活素受体调节剂mab、c1酯酶抑制剂、羧化麦芽糖铁、阿米吡啶(amifampridine)、芬戈莫德、单胺氧化酶b抑制剂、神经递质调节剂、多巴胺受体激动剂、
抗cd19 mab、vmat2抑制剂、cd20 mab、胸腺素β
‑
4、抗il
‑
6受体mab、依库丽单抗(eculizumab)、ampa受体调节剂、类固醇羟化酶抑制剂、吡哆醛磷酸盐、阿比特胺(abeotaxane)、醋纽拉酸(aceneuramic acid)和羟丁酸钠。
[0267]
在一种情况下，治疗剂是抗体。以下提供了示例性治疗性抗体的cdr的非限制性实例。
[0268]
[0269][0270][0271]
以下提供了示例性治疗性抗体的vh和vl的非限制性实例。
[0272]
抗lingo
‑
1：
[0273]
vh：
[0274]
evqllesggg lvqpggslrl scaasgftfs ayemkwvrqa pgkglewvsv
[0275]
igpsggftfy adsvkgrfti srdnskntly lqmnslraed tavyycateg
[0276]
dndafdiwgq gttvtvss(seq id no:183)
[0277]
vl：
[0278]
diqmtqspat lslspgerat lscrasqsvs sylawyqqkp gqaprlliyd
[0279]
asnratgipa rfsgsgsgtd ftltisslep edfavyycqq rsnwpmytfg
[0280]
qgtkleik(seq id no:184)
[0281]
抗tweak：
[0282]
vh：
[0283]
evqlvesggg lvqpggslrl scaasgftfs ryamswvrqa pgkglewvae
[0284]
issggsypyy pdtvtgrfti srdnaknsly lqmnslraed tavyycarvl
[0285]
yydydgdrie vmdywgqgtl vtvss(seq id no:185)
[0286]
vl：
[0287]
dvvmtqspls lpvtpgepas iscrssqslv sskgntylhw ylqkpgqspq
[0288]
lliykvsnrf sgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedvgv yycsqsthfp
[0289]
rtfgggtkve ik(seq id no:186)
[0290]
抗β
‑
淀粉样蛋白：
[0291]
vh：
[0292]
qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgfafssygmhwvrqapgkglewvaviwfdgtkkyytdsvkgrftisrdnskntlylqmntlraedtavyycardrgigarrgpyymdvwgkgttvtvss(seq id no:187)
[0293]
vl：
[0294]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqsissylnwyqqkpgkapklliyaasslqsgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqsystpltfgggtkveikr(seq id no:188)
[0295]
抗τ：
[0296]
vh：
[0297]
qvqlvesgggvvqpgrslrvscaasgftfssydmhwvrqapgkglewvaviwfdgsnefyadsvkgrftisrdnskntlflqmnslraedtavyycardlgasvttsnaenfhhwgqgtlvtvss(seq id no:189)
[0298]
vl：
[0299]
syeltqppsvsvspgqtaritcsgdalpkryvywyqqksgqapvlviyedskrpsgipetfsgsssgtmatltisgaqvedeadyycystdsnghhwvfgggtkltvl(seq id no:190)
[0300]
抗τ：
[0301]
vh：
[0302]
evqlvesggglvqpggslrlscaasgftfpnyvmtwvrqapgkglewvsgisgsggstdyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslrvedtalyycakgsggirgqgtmvtvss(seq id no:191)
[0303]
vl：
[0304]
qsaltqprsvsgspgqsvtisctgtssdvggynyvswhqqhpgkapklliydvtkrpsgvpdrfsgsksgntaaltisglqaedeadyychsyvgsytlvfgggtkltvl(seq id no:192)
[0305]
抗τ：
[0306]
vh：
[0307]
evhlvesggalvkpggslrl scaasgfsfs kygmswvrqa pgkglewvat isssgsrtyy pdsvkgrfti srdnakntly lqmnslraed tamyycsisw dgamdywgqg ttvtvss(seq id no:193)
[0308]
vl：
[0309]
dvvmtqspls lpvtlgqpas isckssqsiv hsngntylew ylqkpgqspq llvykvsnrfsgvpdrfsgs gsgtdftlki srveaedvgt yycfqgslvp wafgggtkve ik(seq id no:194)
[0310]
抗α
‑
突触核蛋白：
[0311]
vh：
[0312]
evqlvesggg lvepggslrl scavsgfdfe kawmswvrqapgqglqwvar
[0313]
ikstadggtt syaapvegrf iisrddsrnm lylqmnslktedtavyycts
[0314]
ahwgqgtlvt vss(seq id no:195)
[0315]
vl：
[0316]
syeltqppsv svspgqtari tcsgealpmq fahwyqqrpg kapvivvykd
[0317]
serpsgvper fsgsssgtta tltitgvqae deadyycqsp dstntyevfg
[0318]
ggtkltvl(seq id no:196)
[0319]
抗c9orf72 dpr：
[0320]
vh1：
[0321]
qvqlvesgggvvqpgrslrlscaasgftfsnhamhwvrqapgkglewvavisydgentyyadsiegrftisrdnfkntlflqmysltaddtamyfcarggrrghftsyyldywgqgtlvtvss(seq id no:197)
[0322]
vl1：
[0323]
diqmtqspsslsasvgdrvtitcrasqnidkylnwyqqipgkapklliyaasslhsgvpsrfsgsgsgtdfsltisslqpedfaiyycqqsyssfrtfgqgtkleik(seq id no:198)
[0324]
vh2：
[0325]
qvqlqesgpglvkpsetlsltytvlggsvsdyywscirqpagkglewigrtytngkttytynpslesrlslsidtsmnqfslkltsvtaadtavyycarwgavtgdyyygmdvwgpgtlvtvss(seq id no:199)
[0326]
vl2：
[0327]
eivltqsplslsvtpgepasiscrsprsllhtngytyldwylqrpgqspqlliflasnrasgvpdrfsgsgsgtnftlrisgveaddvgvyycmqglqpswtfgqgtkveik(seq id no:200)
[0328]
在一些实施方案中，嵌合分子是融合多肽，所述融合多肽包含上述抗体可变结构域和全抗体(治疗剂)(参见图48)。本文所述的抗体可变结构域的c端直接或经由接头(例如g、gg、g4s(seq id no:5)、3x g4s(seq id no:60)连接至抗体的两个vh或两个vl结构域的n端。在某些实施方案中，全抗体是抗β淀粉样蛋白抗体、抗τ抗体、抗α突触核蛋白抗体、抗tdp
‑
43抗体、抗lingo
‑
1抗体、抗lingo
‑
2抗体、抗lingo
‑
3抗体、抗lingo
‑
4抗体、抗trem2抗体、抗c9orf72二肽重复聚
‑
ga抗体(即能够结合如从染色体9开放阅读框72(c9orf72)基因翻译的具有至少6个重复(ga)6的聚甘氨酸
‑
丙氨酸(ga)的二肽重复序列(dpr)的抗体)、抗tweak抗体或抗tweak
‑
r抗体。
[0329]
在一些实施方案中，嵌合分子包含上述抗体可变结构域、铰链区、fc区和fab(治疗剂)(参见图48)。抗体可变结构域的c端直接或间接连接至每个铰链区的n端，每个铰链区又直接或间接连接至fc区。fc区的每个fc结构域的c端经由接头(例如g、gg、g4s(seq id no:5)、3x g4s(seq id no:60)连接至fab(治疗剂)的vh或vl结构域的n端。在某些实施方案中，fab是抗β淀粉样蛋白fab、抗τfab、抗α突触核蛋白fab、抗tdp
‑
43fab、抗lingo
‑
1fab、抗lingo
‑
2fab、抗lingo
‑
3fab、抗lingo
‑
4fab、抗trem2 fab、抗c9orf72二肽重复聚
‑
ga fab、抗tweak fab或抗tweak
‑
r fab。
[0330]
在某些实施方案中，嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域、治疗剂、铰链区和fc区。抗体可变结构域的c端直接或经由接头(例如g、gg、g4s(seq id no:5)、3x g4s(seq id no:60)连接至治疗剂(例如抗体片段(例如fab))、酶、肽)的n端。治疗剂的c端直接或经由接头连接至铰链区的n端。铰链区的c端连接至fc区的每个fc结构域的n端。在一些状况下，
[0331]
在一些实施方案中，嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域、治疗剂、铰链区和fc区。抗体可变结构域的c端直接或经由接头连接至铰链区的n端。铰链区的c端连接至fc区
的每个fc结构域的n端。治疗剂(例如抗体片段(例如fab))、酶、肽)的n端直接或经由接头(例如g、gg、g4s(seq id no:5)、3x g4s(seq id no:60)连接至fc区的一个或两个fc结构域的c端。
[0332]
在某些实施方案中，嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域、aso(治疗剂)、铰链区和fc区。抗体可变结构域的c端直接或经由接头连接至铰链区的n端。铰链区的c端连接至fc区的每个fc结构域的n端。aso连接至铰链区。在某些状况下，aso是剪接转换寡核苷酸。在其它情况下，aso是缺口聚物。
[0333]
在一些状况下，嵌合分子包含本文所述的抗体可变结构域、铰链区、fc区和包封治疗剂(例如aso(例如剪接转换寡核苷酸或缺口聚物)、小分子药物、核酸、肽)的脂质纳米粒子、脂质体或聚合物纳米运载体。抗体可变结构域的c端直接或经由接头连接至铰链区的n端。铰链区的c端连接至fc区的每个fc结构域的n端。脂质体可以连接至fc区的一个或两个fc结构域的c端。本领域中已知纳米规模递送的方法。参见例如juliano等人,nucl.acids res.,44(14)(2016)和其中引用的参考文献，其通过引用整体并入本文中。
[0334]
应当理解，上述嵌合分子可包括hsa部分而不是fc区。
[0335]
另外，本公开涵盖如图49所示的单价、双特异性和四价设计。
[0336]
核酸、载体、宿主细胞以及多肽的制备方法
[0337]
本公开还涵盖编码以上公开的抗体可变结构域的核酸。另外，涵盖编码本文描述的融合多肽的一种或多种核酸。可以将一种或多种核酸插入一个或多个载体(例如表达载体)中。
[0338]
编码如上所述的抗体可变结构域和包含抗体可变结构域的融合多肽的核酸可以在任何所需的宿主细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞)中表达。在某些实施方案中，多肽是从宿主细胞分泌的。在一个实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一个具体的实施方案中，宿主细胞是cho细胞或细胞系。在一些情况下，抗体可变结构域多肽编码序列(例如人源化的fc5或二硫化物稳定化且人源化的fc5)通过间插氨基酸序列与fc(例如igg1、igg1、igg2、igg3、igg4)编码序列融合。在一些情况下，间插氨基酸序列包含铰链序列(例如来自igg1、igg4等的铰链)。在一些情况下，间插氨基酸序列包含fab和铰链序列。
[0339]
如果多肽要在细菌细胞(例如大肠杆菌)中表达，则表达载体应具有允许载体在细菌细胞中扩增的特征。另外，当使用大肠杆菌(例如jm109、dh5α、hb101或xl1
‑
blue)作为宿主时，载体必须具有启动子，例如lacz启动子(ward等人,nature,341:544
‑
546(1989)、arab启动子(better等人,science,240:1041
‑
1043(1988))，或可以允许在大肠杆菌中有效表达的t7启动子。这类载体的实例包括例如m13系列载体、puc系列载体、pbr322、pbluescript、pcr
‑
script、pgex
‑
5x
‑
1(pharmacia)、“qiaexpress系统”(qiagen)、pegfp和pet(当使用这种表达载体时，宿主优选是表达t7 rna聚合酶的bl21。表达载体可以含有用于分泌的信号序列。为了在大肠杆菌的周质中产生，pelb信号序列(lei等人,j.bacteriol.,169:4379(1987))可以用作用于分泌的信号序列。对于细菌表达，可以使用氯化钙方法或电穿孔方法将表达载体引入细菌细胞中。
[0340]
如果多肽要在酵母细胞(例如酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、意大利酿酒酵母(saccharomyces italicus)、鲁氏酵母(saccharomyces rouxii)、毕赤酵母(pichia pastoris)、安格斯毕赤酵母(pichia anomala)、荚膜毕赤酵母(pichia capsulate)、乳酸
克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)或的酵母曲霉属(aspergillus)、念珠菌属(candida)、球拟酵母属(torulopsis)、孢圆酵母属(torulaspora)、裂殖酵母(schizosaccharomyces)、固囊酵母属(citeromyces)、管囊酵母属(pachysolen)、接合酵母属(zygosaccharomyces)、德巴利酵母属(debaromyces)、木霉属(trichoderma)、头孢霉属(cephalosporium)、腐质霉菌(humicola)、毛霉菌属(mucor)、脉孢菌属(neurospora)、耶氏酵母属(yarrowia)、梅奇酵母属(metschunikowia)、红冬孢酵母属(rhodosporidium)、白冬孢酵母属(leucosporidium)、伯瑞酵母属(borryoascus)、锁掷酵母属(sporidiobolus)或拟内孢霉属(endomycopsis))中表达，则表达载体包括驱动多肽在酵母细胞中表达的启动子和/或对指导酵母分泌有效的信号序列。适用于酿酒酵母的启动子包括与pgk1基因、gal1或gal10基因、cyc1、phos、trp1、adh1、adh2、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、三糖磷酸异构酶、磷酸葡萄糖异构酶、葡萄糖激酶、α
‑
交配因子信息素[a交配因子信息素]的基因相关的启动子、prb1启动子、gut2启动子、gpd1启动子，以及涉及5'调控区部分与其它启动子的5'调控区部分或上游激活位点的杂混物的杂混启动子(例如ep
‑
a
‑
258 067中所述的启动子)。适用于毕赤酵母的启动子包括aox1、aox2、mox1和fmd1。在一些情况下，信号序列是酵母来源的信号序列(例如与酵母宿主同源的序列)。
[0341]
如果多肽要在如cho、cos和nih3t3细胞等细胞中表达，则表达载体应包括在这些细胞中表达所必需的启动子，例如sv40启动子(mulligan等人,nature,277:108(1979))、mmlv
‑
ltr启动子、ef1α启动子(mizushima等人,nucleic acids res.,18:5322(1990))或cmv启动子。除编码多肽的核酸序列外，重组表达载体还可携带其它序列，例如调节载体在宿主细胞中复制的序列(例如复制起点)和选择标记基因。选择标记基因有助于选择已引入了载体的宿主细胞(参见例如美国专利号4,399,216、4,634,665和5,179,017)。例如，通常，选择标记基因在已引入了载体的宿主细胞上赋予对如g418、潮霉素(hygromycin)或甲氨蝶呤(methotrexate)的药物的抗性。具有选择标记的载体的实例包括pmam、pdr2、pbk
‑
rsv、pbk
‑
cmv、poprsv和pop13。
[0342]
多肽还可以在人细胞如hek
‑
293细胞中表达。
[0343]
可以使用本领域已知的几种方法中的任一种来构建变异fc5多肽(以及其融合物)。一种这样的方法是定点诱变，其中在编码的变异fc5多肽中改变一个特定的核苷酸(或者，如果需要的话，少量的特定核苷酸)，以便改变单个氨基酸(或者，如果需要的话，少量预定的氨基酸残基)。许多定点诱变试剂盒是可商购的。一种这样的试剂盒是clontech laboratories(palo alto,ca)出售的“变压器定向诱变试剂盒”。
[0344]
可以使用本领域众所周知的方法来产生和分离fc5多肽以及其融合物。在一些实施方案中，这类多肽通过重组dna技术产生。例如，可以将编码fc5多肽或其融合物的核酸分子插入载体，例如表达载体中，并且可以将核酸引入细胞中。合适的细胞包括例如哺乳动物细胞(例如人细胞或cho细胞)、真菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和细菌细胞。当在重组细胞中表达时，优选在允许多肽表达的条件下培养细胞。如果需要，可以从细胞悬浮液中回收多肽。如本文所用，“回收”是指将突变的多肽从回收过程之前存在其的细胞或培养基的那些组分中除去。回收过程可包括一个或多个重折叠或纯化步骤。通常用于蛋白质纯化的分离和纯化的方法可以用于本文所述的多肽的分离和纯化，并且不限于任何特定方法。可以通过适当地选择和组合例如柱色谱法、过滤、超滤、盐析、溶剂沉淀、溶剂萃取、蒸馏、免疫沉
淀、sds
‑
聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦、渗析和重结晶来分离和纯化多肽。色谱法包括例如亲和色谱法、离子交换色谱法、疏水色谱法、凝胶过滤、金属螯合色谱法、反相色谱法和吸附色谱法(strategies for protein purification and characterization:a laboratory course manual.编辑daniel r.marshak等人,cold spring harbor laboratory press,1996)。可以使用液相色谱法如hplc和fplc进行色谱法。用于亲和色谱法的柱包括蛋白a柱和蛋白g柱、capture select hsa和肝素琼脂糖凝胶。使用蛋白a色谱柱的色谱柱的实例包括hyper d、poros和sepharose ff(ge healthcare biosciences)。本公开还包括使用这些纯化方法高度纯化的多肽。
[0345]
治疗方法
[0346]
本文所述的抗体可变结构域可用于转运可用于治疗和/或预防疾病或病症的货物(例如治疗剂)。治疗剂可以是例如抗体、抗体片段(例如fab)、纳米抗体、双功能抗体、单链抗体、小分子药物、肽、酶或核酸(例如aso)。在某些情况下，治疗剂直接或间接连接至抗体可变结构域。在其它情况下，将治疗剂包封在脂质体、脂质纳米颗粒或聚合物纳米运载体中，然后将其直接或间接连接至抗体可变结构域。通过将靶向中枢神经系统的治疗剂与本文所述的抗体可变结构域连接，这种融合可以将治疗剂转运跨过bbb。
[0347]
在某些实施方案中，疾病或病症是神经系统病症。在一些情况下，疾病或病症是τ蛋白病。在一些情况下，疾病或病症是共核蛋白病。
[0348]
在一些情况下，疾病或病症选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、帕金森病、多发性硬化、额颞叶痴呆(ftd)、肌萎缩侧索硬化(als)、进行性核上麻痹(psp)、脊髓损伤(sci)、脊髓性肌萎缩(sma)、神经系统癌症、急性或慢性视神经炎、肌萎缩侧索硬化/帕金森痴呆复合病、嗜银粒性痴呆、英式淀粉样血管病、脑淀粉样血管病、皮质基底节变性、克
‑
雅二氏病(creutzfeldt
‑
jakob disease)、拳击员痴呆、弥漫性神经原纤维缠结伴钙化症、唐氏综合征(down’s syndrome)、与17号染色体相关的额颞叶痴呆伴帕金森病、额颞叶变性、格斯特曼
‑
斯特劳斯勒
‑
舍因克病(gerstmann
‑
straussler
‑
scheinker disease)、哈勒沃登
‑
施帕茨病(hallervorden
‑
spatz disease)、包涵体肌炎、多系统萎缩、强直性肌营养不良、c型尼曼
‑
匹克病(niemann
‑
pick disease type c)、非瓜马尼亚运动神经元病伴神经原纤维缠结(non
‑
guamanian motor neuron disease with neurofibrillary tangles)、匹克病(pick’s disease)、脑后帕金森病、朊蛋白脑淀粉样血管病、进行性皮质下神经胶质增生、亚急性硬化性全脑炎、缠结性痴呆或多发性梗塞性痴呆。
[0349]
在其它情况下，疾病或病症选自由以下组成的组：中风、慢性外伤性脑病、外伤性脑损伤(tbi)、脑震荡、癫痫发作、癫痫病或急性铅脑病。
[0350]
可以采用的示例性治疗性抗体公开于美国专利号8,906,367、9,605,059、9,598,484、9,587,014、9,777,058、9,567,395、8,128,926、8,058,406、8,048,422以及美国申请号2017/0247471
‑
a1中，所有这些通过引用整体并入本文中。
[0351]
可以采用的示例性治疗性aso公开于美国专利号8,361,977和8,980,853中，都通过引用整体并入本文中。
[0352]
可以以本领域技术人员可确定的剂量方案将治疗有效量的组合物施用于需要其的人类受试者。组合物的给药频率在医师的技能和临床判断之内。通常，通过可以建立最佳给药参数的临床试验建立给药方案。但是，从业者可以根据受试者的年龄、健康状况、体重、
性别和医疗状况来改变这种给药方案。在疾病或病症的急性和长期治疗之间，给药频率也会变化。另外，给药的频率可以根据治疗是预防性还是治疗性而变化。
[0353]
测定法
[0354]
本公开的特征还在于用于评估抗体可变结构域的不稳定性的测定法。在某些情况下，抗体可变结构域是单结构域抗体。在一种情况下，单结构域抗体是fc5或其变体(例如人源化的、二硫化物稳定化的或人源化与二硫化物稳定化的)。
[0355]
所述方法包括向血清样品中添加抗体可变结构域以产生混合物；孵育混合物；纯化抗体可变结构域；并进行肽图谱分析。在一些情况下，血清样品是大鼠血清。在其它情况下，血清样品是人血清。
[0356]
在某些实施方案中，所述抗体可变结构域在血清中浓度为0.01至0.5mg/ml。在一些实施方案中，所述抗体可变结构域在血清中浓度为约0.1mg/ml。在一些实施方案中，所述抗体可变结构域在血清中浓度为0.05mg/ml。在一些实施方案中，所述抗体可变结构域在血清中浓度为0.1mg/ml。在一些实施方案中，所述抗体可变结构域在血清中浓度为0.2mg/ml。在一些实施方案中，所述抗体可变结构域在血清中浓度为0.3mg/ml。在一些实施方案中，所述抗体可变结构域在血清中浓度为0.4mg/ml。在一些实施方案中，所述抗体可变结构域在血清中浓度为0.5mg/ml。
[0357]
在某些状况下，将混合物在25至50℃下孵育10至100小时。在某些状况下，将混合物在约37℃下孵育约70小时。在一个实施方案中，将混合物在37℃下孵育70小时。
[0358]
本公开的实施例3提供了进行该测定的非限制性方式。
[0359]
提供了以下实施例以更好地说明要求保护的本发明且不应解释为限制本发明的范围。就提及特定材料的程度而言，其仅出于说明的目的并且不旨在限制本发明。本领域的技术人员可在不行使本发明的能力且不脱离本发明范围的情况下开发等效的手段或反应物。
[0360]
实施例
[0361]
实施例1：fc5
‑
抗lingo
‑
1抗体(li81)融合蛋白的产生
[0362]
为了评估是否可以产生含有fc5转运活性和li81功能的fc5li81双特异性抗体，设计、表达、纯化和表征表1中列出的9个不同型式。设计示意图显示在标记为结构的列中，每种构建体中fc5 vhh和li81的比率在标记为fc5:li81的列中列出。构建体含有1个、2或4个fc5 vhh部分，以及1个或2个li81 fab。在列出的前4种构建体中，使用1个或3个g4s(seq id no:5)接头将fc5连接至li81重链、轻链或两者的n端，以连接所标注的结构域。在第5种和第6种构建体中，fc5直接连接至li81 mab的铰链
‑
fc，并且li81 fab通过其重链与fc的c端融合。铰链的两个不同型式用于连接fc5vhh和标注为长和短的fc结构域。如所标注，其它四个型式是异源二聚体，其中每个臂具有不同的功能。
[0363]
表1.构建体列表
[0364][0365]
fc5 li81构建体在cho细胞中表达。为了制备条件培养基，将转染的cho细胞在无血清培养基中扩增，生长至高密度，馈入补充剂，并转移至降低的温度。将培养物在降低的温度下保持11
‑
14天，然后通过离心收获并通过0.45微米过滤使其澄清。
[0366]
为了纯化，将澄清和过滤的培养基加载到蛋白a柱上，用20mm nah2po
4 ph 7.4、100mm nacl和然后用25mm nah2po
4 ph 5.5、100mm nacl洗涤。用25mm nah2po
4 ph 2.8、100mm nacl ph 2.8从柱洗脱fc5
‑
li81，并用从0.5m储备液稀释的25mm na2hpo
4 ph 8.6中和。洗脱样品的蛋白质含量是根据280nm的吸光度使用1.4的消光系数针对1mg/ml溶液估算的。图3示出了前3种构建体的sds
‑
page分析，其中用3xg4s(seq id no:6)接头连接fc5至hc(id#3014)、lc(id#3015)或两者(id#3016)的n端，将fc5与li81mab的n端融合。这个分析证实了在非还原条件下hc和lc的表达以及组装成特征性的hc2lc2四聚体复合物。泳道3中蛋白质的稍大尺寸与相对于其它样品中的2个拷贝存在4个拷贝的fc5一致。图2示出了在三种构建体中使用的重链和轻链的氨基酸序列。还原重链3014(预测质量62784.5da，观测质量62783da)、还原轻链3014(预测质量23628.4da，观测质量23628da)、还原重链3015(预测质量48608.9da，观测质量48608da)、还原轻链3015(预测质量37804.0da，观测质量37804da)、还原重链3016(预测质量62784.5da，观测质量62782da)和还原轻链3016(预测质量37804.0da，观测质量37804da)的完整质量分析表明所有样品中的主要成分是预测的轻链和重链。相应的去卷积谱显示在图4、5和6中。没有观测到主要成分的意外变化。
[0367]
图7(左图)示出了在非还原条件下对表1中所述的6个其它产物的sds
‑
page分析。型式3438、3440、3441含有抗体的特征性hc2lc2二聚体结构特征，并且在蛋白a纯化后纯度>95％。相反，蛋白a纯化后的型式3442、3443和3444非常不纯。它们含有人们可能对异聚体设计所期望的组分的预期混合物，反映了产生任一臂的所需异聚体和同聚体的3种不同可能性。使用尺寸排阻色谱法(sec)从混合物中富集异聚体。对于sec分级分离，将蛋白a洗脱液浓缩，然后在24ml superdex 200色谱柱上在20mm na2hpo
4 ph 7.4、150mm nacl中以0.5ml/min的流速进行sec。收集柱级分，通过sds
‑
page进行分析，并且将那些含有异聚体的级分汇集，过滤，等分并储存在
‑
70℃下。图7(右图)示出了样本3443的sec分级分离。汇集泳道7和8
中显示的级分(用箭头表示)，以生成左图中所示的泳道7的样品。
[0368]
图8示出了各种fc5
‑
(g4s)1
‑
li81构建体的重链和轻链的氨基酸序列。还原重链3438(预测质量62,153.9da，观测质量62155da)、还原重链3440(预测质量62,897.8da，观测质量62899da)、还原重链3441(预测质量62,167.0da，观测质量62168da)、还原重链3442(预测质量62,897.8da，观测质量62899da)、还原重链3443(预测质量62,167.0da，观测质量62169da)、还原重链3444(预测质量62,167.0da，观测质量62169da)的完整质量分析。所有构建体均含有li81轻链(还原轻链预测质量23,628.4，观测质量为23629da)。这些分析表明，所有样品中的主要成分均含有预测轻链和重链。相应的重链去卷积谱显示在图9中。没有观测到主要成分的意外变化。
[0369]
为了测试fc5融合物是否影响li81功能，以elisa格式分析了样品与lingo
‑
1的结合，其中96孔板用lingo
‑
1包被，然后用fc5
‑
li81双特异性抗体的连续稀释液处理。图10示出了6种fc5
‑
(g4s)1
‑
li81构建体的elisa数据。在不连接fc5下，3种二价构建体(3438、3440、3441)具有等效的li81，这表明了添加fc5的添加不会影响构建体与lingo
‑
1的结合。相比之下，含有单拷贝的li81fab的3种异聚体型式(3442、3443和3444)显示出降低的信号，这与相对于二价构建体中存在的两个结合位点存在一个结合位点相一致。还在elisa中测试了三种fc5
‑
(g4s)3
‑
li81构建体，并与不连接fc5的li81等效。在少突胶质细胞分化测定中还测试了这9个样品的功能，并且所有这些样品都是有活性的。在效能测定中，用于促进分化的ec50均比不连接fc5的li81低约3倍。使用先前描述的li81抗体表征方法，通过elisa和分化测定法对样品进行活性表征(pepinsky等人,journal of pharmacology and experimental therapeutics,339:519
‑
529(2011))。
[0370]
在体外bbb transwell细胞培养测定中在猿病毒40永生化成年大鼠脑内皮细胞(sv
‑
arbec)上评估fc5
‑
li81样品的fc5部分的生物活性。将这些分子以成对的组合(对照和测试分子)共同施加于体外bbb模型的上腔室，并通过底部腔室中的质谱定量(mrm)进行定量；在90分钟内计算出每个的p
app
值。fc5
‑
li81的(顶部腔室)输入浓度介于1.5和3μm(线性期)之间，其中各种共同施用的对照抗体等摩尔输入。该分析的结果在图11中示出。相对于对照，所有样品均显示出fc5介导的转运增加，其中p
app
值提高了2
‑
15倍。3种二价fc5
‑
(g4s)3
‑
li81构建体(3014、3015、3016)均等效，这表明无论fc5添加在hc、lc或两者上，均不影响构建体的活性。所有这些表明，p
app
值提高了约3倍。最显著的倍数提高是在fc5
‑
(g4s)1
‑
li81(3438)下看到的，因为这种型式显示其p
app
值增加了约15倍，比相应的fc5
‑
(g4s)3
‑
li81(3015)多约5倍。fc5
‑
(g4s)3
‑
li81(3015)与fc5
‑
(g4s)1
‑
li81(3438)构建体的区别仅在于将fc5与li81连接在一起的g4s序列的长度(seq id no:5)，因为两者都含有与li81 hc融合的fc5。通过(g4s)1接头fc5与fc融合并且li81 fab与fc的c端连接的fc5
‑
(g4s)1
‑
li81(3440)构建体也显示出了其p
app
值提高约12倍。相比之下，当测试具有较短但更灵活的铰链的相同构建体设计(3441)时，其p
app
值仅提高了约6倍。因此，类似于在连接构建体3015和3438的接头长度下看到的，构建体3440和3441中铰链的设计影响构建体的体外转运活性。3种异聚体型式(3442、3443和3444)显示相对于对照2
‑
5倍的提高。尽管转运的增加是显著的，但是未在体内研究中测试这些构建体。
[0371]
体外transwell测定如下进行。将sv
‑
arbec于1ml不含酚红的sv
‑
arbec进料培养基中以80,000个细胞/膜接种在鼠尾胶原蛋白包被的0.83cm
2 falcon细胞插入物上，孔径为1
μm。12孔组织培养板的孔(即用于转运的底部腔室)中含有2ml的不含酚红的sv
‑
arbec培养基与大鼠星形胶质细胞条件培养基的50:50(v/v)混合物。在garberg等人,toxicol in vitro,19(3):299
‑
334(2005)中详细描述了模型的特征。当pe[蔗糖]介于0.4
‑
0.6[
×
10
‑3]cm/min之间时，使用该模型。如haqqani等人,mol.pharm.,10:1542
‑
1556(2012)中所述，通过将等摩尔浓度的测试样品和对照的混合物添加到顶部腔室，并在15、30、60和90分钟时从底部腔室中收集100μl等分试样(随后替换为100μl转运缓冲液)以使用多路srm
‑
ilis方法同时定量所有抗体，进行转运实验。如先前所述(haqqani等人,2012(同上))计算表观渗透系数papp。
[0372]
为了测试fc5
‑
li81构建体在体内是否显示bbb转运活性，在炎性痛觉过敏的哈格里夫斯模型中测试了构建体3015、3438和3440。在该模型中，将构建体化学缀合至达拉根，通过静脉内(iv)注射施用，并随时间测量疼痛反应。运行模型的方法如先前所述(farrington等人,anovel platform for engineering blood
‑
brain barrier
‑
crossing bispecific biologics,faseb j.,28(11):4764
‑
78(2014))。阿片肽达拉根在全身给药后不会跨过bbb，也不具有镇痛作用。如图12所示，fc5
‑
li81达拉根缀合物的全身给药引起明显的镇痛反应。数据显示，与fc5
‑
li81化学缀合的达拉根在全身施用后可与中枢阿片受体结合。三种处理的auc值相似，范围为最大可能效应(mpe)的25％至35％。图13a示出了模型中三种构建体和li81如对照物中的反应的剂量依赖性。图13b是构建体3438和li81的图。作为在比单独li81低10倍的剂量下出现的曲线下面积(auc)的％，fc5
‑
li81的处理会导致20％的mpe，因此表明了添加fc5至li81可以提高其跨越血脑屏障并与阿片受体结合的能力。
[0373]
使用如mattson等人,mol.biol.rep.,17:167
‑
183(1993)描述的一般方法，将fc5
‑
li81融合物和单独的li81与达拉根类似物tyr
‑
dala
‑
gly
‑
phe
‑
leu
‑
arg
‑
半胱酰胺(dal
‑
cys)缀合。简单地说，将n,n
‑
二甲基甲酰胺中10mg/ml的磺基
‑
琥珀酰亚胺基
‑4‑
[n
‑
马来酰亚胺基甲基]环己烷
‑1‑
羧酸酯(smcc；pierce rockland,il,usa)以相对于pbs中1
‑
2mg/ml的测试抗体7.5倍摩尔过量添加。将反应在室温下孵育2.5小时，并且以相对于smcc 4倍摩尔过量添加50mm mes(ph 6.0)中的dal
‑
cys。将dal标记的蛋白质在离心装置中浓缩，并脱盐以除去未缀合的dal
‑
cys和smcc。达拉根/分子的化学计量由标记蛋白质的完整质谱分析确定。图11示出了3015和3016的达拉根缀合物的转运活性。在这些条件下，相对于未添加达拉根的相应蛋白质，结合导致p
app
值降低20
‑
40％。
[0374]
虽然对li81和fc5
‑
li81构建物的达拉金缀合物的评估提供了清晰的体内证据，证明抗体fc5融合物可以改善其向中枢神经系统(cns)的递送，但阿片样物质的读取持续时间仅为4小时。为了获得更定量的转运蛋白读数并探讨作用的持续时间，在静脉内施用后24、48和72小时通过质谱法评估血清和cns水平来进行药代动力学分析。图14示出了以20、65和200nmol/kg剂量分析li81和三种fc5
‑
li81构建体(3015、3438和3441)的结果。相对于在li81 mab下观测到的水平，所有浓度的所有fc5融合物均导致24小时csf水平升高，并且csf水平明显取决于施用剂量。相比之下，在72小时的时间点，与对照的差异减小。与此一致的是，fc5融合物的csf/血清比率随时间降低，而li81 csf/血清比率在所有时间点和所有剂量下均相对恒定。这些数据验证了fc5可以改善li81向cns的递送，但随着时间的流逝其效果会降低。
[0375]
实施例2：fc5
‑
(g4s)1
‑
li81的产生
[0376]
fc5
‑
(g4s)1
‑
li81
[0377]
轻链gc058
[0378]
mdmrvpaqll gllllwlrga rcdiqmtqsp atlslspger atlscrasqs vssylawyqq kpgqaprlli ydasnratgi parfsgsgsg tdftltissl epedfavyyc qqrsnwpmyt fgqgtkleik rtvaapsvfi fppsdeqlks gtasvvclln nfypreakvq wkvdnalqsg nsqesvteqd skdstyslss tltlskadye khkvyacevt hqglsspvtk sfnrgec(seq id no:2)
[0379]
重链pyl945
[0380]
mgwslillfl vavatrvlsd vqlqasgggl vqaggslrls caasgfkith ytmgwfrqap gkerefvsri twggdntfys nsvkgrftis rdnakntvyl qmnslkpedt adyycaagst statplrvdy wgkgtqvtvs sggggsevql lesggglvqp ggslrlscaa sgftfsayem kwvrqapgkg lewvsvigps ggftfyadsv kgrftisrdn skntlylqmn slraedtavy ycategdnda fdiwgqgttv tvssastkgp svfplapssk stsggtaalg clvkdyfpep vtvswnsgal tsgvhtfpav lqssglysls svvtvpsssl gtqtyicnvn hkpsntkvdk kvepkscdkt htcppcpape llggpsvflf ppkpkdtlmi srtpevtcvv vdvshedpev kfnwyvdgve vhnaktkpre eqynsayrvv svltvlhqdw lngkeykckv snkalpapie ktiskakgqp repqvytlpp srdeltknqv sltclvkgfy psdiavewes ngqpennykt tppvldsdgs fflyskltvd ksrwqqgnvf scsvmhealh nhytqkslsl spg(seq id no:7)
[0381]
fc5
‑
(g4s)1
‑
li81在cho细胞中表达。为了制备条件培养基，将来自未分类池的转染的cho细胞在无血清培养基中扩增，生长至高密度，馈入补充剂，并转移至降低的温度。将培养物在降低的温度下保持14天，然后通过离心收获并通过0.45微米过滤使其澄清。将1.8l澄清和过滤的培养基(fc5
‑
li81的估计滴度为150mg/l)加载到20ml蛋白a柱上。将柱用10mm na2hpo
4 ph 7.0、150mm nacl洗涤，并用25mm na2hpo
4 ph 2.8、100mm nacl ph 2.8从柱洗脱fc5
‑
(g4s)1
‑
li81，并且用从0.5m储备液稀释的25mm nah2po
4 ph 8.6中和。洗脱样品的蛋白质含量是根据280nm的吸光度使用1.4的消光系数针对1mg/ml溶液估算的。回收290mg纯化的fc5
‑
(g4s)1
‑
li81。将制剂过滤，等分并存储在
‑
70℃下。
[0382]
实施例3：评估大鼠血清中fc5(g4s)1
‑
li81的稳定性
[0383]
在以30mg/kg静脉内给药后，进行大鼠中fc5
‑
(g4s)1
‑
li81的药代动力学分析，并在24、48和72小时时测量血清和csf水平，发现fc5的转运活性随时间下降，其中24小时测试的最早时间点的csf最高，csf/血清比率为0.45％，48小时时减少到0.28％的csf/血清比率，并且在72小时后进一步降低到0.13％的csf/血清比率。该分析的结果在图15中示出。72小时时间点的血清fc5
‑
(g4s)1
‑
li81水平为约150μg/ml，因此没有考虑csf中检测到的蛋白质减少。
[0384]
为了确定转运活性的丧失是否是由fc5
‑
(g4s)1
‑
li81的生化或功能特性的变化引起的，对三只大鼠静脉内给药30mg/kg fc5
‑
(g4s)1
‑
li81并且在72小时后从血清中纯化蛋白质，并进行如下表征。72小时后，将给药的动物放血并制备血清。通过0.45μ注射器驱动的过滤器单元过滤血清。将来自3只大鼠的12ml汇集血清分批加载到350μl ig
‑
select(ge healthcare)上，历时1.5小时。将树脂收集在柱中，用12柱体积的20mm na2hpo
4 ph 7.0、150mm nacl(pbs)、12柱体积的25mm nah2po
4 ph 5.5、100mm nacl洗涤，然后用25mm nah2po
4 ph 2.8、100mm nacl ph 2.8洗脱。收集了200μl级分。洗脱样品的蛋白质含量是根
据280nm的吸光度使用1.4的消光系数针对1mg/ml溶液估算的(将级分4
‑
7汇集并用从0.5m储备液稀释的25mm nah2po
4 ph 8.6中和)。800μl洗脱池的浓度为1.9mg/ml。基于通过mrm测定的血清中fc5
‑
(g4s)1
‑
li81的测量浓度，回收率分别>90％。将样品等分，在干冰上快速冷冻，并存储在
‑
70℃下。作为样品处理的对照，将1.2mg fc5
‑
(g4s)1
‑
li81外加至10ml wistar大鼠血清(innovative research公司)中，并进行样品纯化过程，作为从体内研究回收的样品。图16示出了在还原和非还原条件下通过sds
‑
page对纯化的样品的分析。在还原条件下观测到fc5
‑
li81重链(hc)60kda和轻链(lc)25kda亮带，并且在非还原条件下观测到特征性175kda四聚体2fc5li81hc
‑
2lc复合物。li81样品显示预期的尺寸排阻色谱(sec)洗脱曲线(图17)，洗脱为单个突出峰，分子量为165kda。
[0385]
在体外bbb transwell细胞培养测定中在sv
‑
arbec细胞上评估fc5
‑
(g4s)1
‑
li81样品的生物活性。将这些分子以多种成对的组合(对照和测试分子)共同施加于体外bbb模型的上腔室，并通过底部腔室中的mrm进行定量；在90分钟内计算出每个的papp值。fc5
‑
li81的(顶部腔室)输入浓度介于1.5和3μm(线性期)之间，其中各种共同施用的对照抗体等摩尔输入。该分析的结果在图18中示出。大鼠中72小时后fc5
‑
(g4s)1
‑
li81的转运活性没有明显改变。
[0386]
通过质谱法对fc5
‑
(g4s)1
‑
li81样品进行了广泛的表征。首先，在还原和非还原条件下的完整质量分析表明，所有样品中的主要成分均为预测的蛋白质，fc5
‑
(g4s)1
‑
li81(预测非还原质量171,528.3da；观测给药溶液质量171530da，外加样品171530da，72小时血清样品171534da：预测还原质量fc5li81 hc 62，153.9da；观测给药溶液质量62155da，外加样品62154da，72小时血清样品62154da：预测还原质量lc 23，628.4da；观测给药溶液质量23629da，外加样品23629da，72小时血清样品23629da)。这些分析的结果显示在图19、20和21中。没有观测到主要成分的意外变化。为了进行这些分析，在xevo g2质谱仪上使用massprep micro desalting 20μm柱(2.1id
×
5mm phenyl，waters)在非还原和还原(4m尿素中的40mm dtt和10mm edta，在37℃下1小时)条件下进行分离来分析约20pmol的每个样品。通过使用maxent 1程序(waters公司)进行去卷积来生成分子质量。其次，通过肽图谱分析与lc/ms检测确定所有半胱氨酸的二硫化物结构。图22示出了3个测试样品的还原肽图谱和非还原肽图谱。对含二硫化物的肽的分析表明，每个样品的主要二硫键均符合预期(表2)。
[0387]
表2.fc5(g4s)1li81中主要的二硫键连接的肽的列表
[0388][0389]
*从eic计算的量
[0390]
值得注意的是，重链c1
‑
c2二硫化物的存在表明fc5结构域已在融合蛋白中正确折叠。分析表明，基于提取离子色谱图(eic)的峰面积，三硫化物含量为重链(cys348)和轻链(cys215)之间的键的约4.5％，并且在对照样品和外加样品中在重链的铰链中为约1％。在72小时的样品中未观测到三硫化物，这与先前公布的li81的三硫化物数据(mab1
‑
b，gu等人2010.anal biochem.400(1)：89
‑
98)一致。fc5
‑
(g4s)1
‑
li81样品的二硫化物肽图谱分析方法如下。将约1.4μl的8m盐酸胍中1:10稀释的4
‑
乙烯基吡啶加入到含有约24μg(240pmol，非还原)蛋白质的溶液中，然后立即加入60μl 8m盐酸胍(最终体积为约70μl)。将溶液在黑暗中于室温下保持45分钟。通过用40体积的冷却乙醇沉淀来回收每个小瓶中的蛋白质。将混合物在
‑
20℃下存储1小时，然后在4℃下以14000g离心12分钟。弃去上清液，并将沉淀用冷却的乙醇洗涤一次。蛋白质小球再溶于100μl的含0.1％三氟乙酸的50％乙腈中，并在speed
‑
vac中干燥1.5小时。使用两种不同的肽图谱分析方法分析样品；一种利用内蛋白酶lys
‑
c和胰蛋白酶，另一种利用内蛋白酶aspn。对于lysc/胰蛋白酶图谱，将每个样品中约8μg的经4
‑
乙烯基吡啶处理的蛋白质用2m尿素、0.15m tris
‑
hcl ph 6.7、2mm cacl2、5mm甲胺中5％(w/w)内蛋白酶lys
‑
c(wako)在室温下消化5小时，然后添加5％(w/w)胰蛋白酶(promega)。消化物在室温下再保持4小时，然后添加5％(w/w)胰蛋白酶，然后将消化物在室温下保持过夜。总体积为50μl。对于用aspn消化，将约4μg经4
‑
乙烯基吡啶处理的蛋白质用2m尿素、0.15m tris
‑
hcl ph 6.7、5mm mgcl2、5mm甲胺中的5％(w/w)asp
‑
n(roche)在室温下消化8小时，然后添加5％(w/w)asp
‑
n，并将消化物保持过夜。总体积为50μl。在通过lc
‑
ms分析消化物之前，通过添加1μl 25％三氟乙酸和4m尿素淬灭每个消化物。在室温下在1mm edta中用100mm tcep还原一半的lys
‑
c/胰蛋白酶消化物和所有asp
‑
n消化物1小时。在由uplc
‑
xevo g2
‑
s系统构成的lc
‑
ms系统上分析非还原和还原的lys
‑
c/胰蛋白酶消化物和还原的asp
‑
n消化物的等分试样(约4μg)。色谱柱和分离梯度与肽图谱分析部分中描述的相同。使用biopharmalynx 1.3.3处理二硫化物图谱分析数据。
[0391]
检查了经4
‑
乙烯基吡啶处理的非还原样品的还原的lys
‑
c/胰蛋白酶和asp
‑
n图谱，以评估游离硫醇水平，并评估对照、外加和72小时样品中游离硫醇水平是否存在显著差异。游离硫醇的量由提取离子色谱图(eic)估算。分析显示所有样品中都有少量的游离硫醇，但在fc5区中没有。72小时样品中的游离硫醇水平比对照样品和外加样品中的游离硫醇水平高2
‑
3倍。
[0392]
对72小时和外加样品的肽图谱中的肽回收率与未暴露于大鼠血清的对照样品的图谱中的肽回收率进行系统比较，表明在血清中发生fc5
‑
li81重链的n端剪裁，因为从hc可变区的末端(肽hc 215
‑
249)到n端(肽hc 1
‑
19)，肽的回收率逐渐降低(图22)。n端肽(hc残基1
‑
19)的回收率为60％，表明40％的蛋白质缺少该肽。下一个肽(hc29
‑
38)的回收率为70％，而肽51
‑
65的回收率为80％。相比之下，li81 hc内肽的回收率是约100％，这表明剪裁主要限于融合蛋白的fc5部分。在血清外加样品中检测到n端剪裁；但是，在72小时样品中，剪裁程度要比外加样品大得多(图23)。相比之下，对于所有样品，整个序列中轻链肽的回收率接近100％(图24)。这些发现表明融合蛋白的fc5部分在血清中不稳定，并且fc5结构域内多个位点的蛋白水解导致n端肽的回收较差。
[0393]
实施例4：fc5的人源化
[0394]
为了降低人中fc5免疫原性的风险，同时保持溶解性和稳定性，设计了一系列与人
v
h
3共有框架具有不同程度同源性的fc5序列变体。对于所有变体，包括以下九种人源化突变：q5v、a6e、a14p、a75s、k87r、p88a、d93v、k114q和q117l。表3列出了区分不同人源化设计的其余六个框架位置的突变。这些包括相应的人igg vh/vl界面处的突变(氨基酸位置37、44、45和47)以及氨基酸位置1和79。在突变体h31和h32中探查了相应界面位置的部分人源化。最后，基于fc5的计算模型(参见下文)，骆驼科fc5野生型和人v
h
3共有框架都在cdr
‑
h1(m34)中含有甲硫氨酸，该甲硫氨酸可能部分暴露于溶剂。暴露的甲硫氨酸因为可能会被氧化修饰而可能倾向于显影。因此，如表3所示，产生了具有和不具有m34t取代的每种人源化设计。在奇数编号的构建体中，保留了位置34处的甲硫氨酸，而在偶数编号的构建体中，将甲硫氨酸替换为苏氨酸。
[0395]
表3：区分fc5人源化设计的氨基酸取代的列表
[0396][0397]
表4提供了来自表3中列出的八种人源化fc5变体设计的完整v
h
h序列(残基取代呈黑体)，以及用于短和长铰链higg1
‑
fc agly设计的序列。
[0398]
表4：人源化的fc5变体
[0399]
8.6中和。通过变性微流体毛细管电泳(labchip gxii蛋白质表达测定；perkin elmer)分析纯化的蛋白质的大小和同质性。所有分子在非还原条件下显示出vhh
‑
hfc二聚体的预期大小，在还原条件下显示出相应的单体的大小(图26)，没有明显的聚集体或蛋白水解产物。还原样品的完整质谱分析确认了所有fc5
‑
hfc人源化变体的预测质量与测量质量之间的对应关系(5da内；图27)。
[0403]
在biosep s3000 7.8
×
300mm二氧化硅柱(phenomenex)上在100mm na2hpo4、200mm nacl ph 6.8中以0.6ml/min对所有fc5
‑
hfc变体进行尺寸排阻色谱分析。所有人源化变体均洗脱为单个峰(图28)，但h11、h12、h31、h32和h72的洗脱时间明显延迟，表明与二氧化硅树脂的相互作用。值得注意的是，h31和h32表现出广泛的峰加宽，并具有浅的上升和下降的肩峰。
[0404]
在fc5
‑
hfc人源化变体上进行分子稳定性的另外测试。通过差示扫描量热法(vp
‑
dsc，microcal)生成的所有变体的热稳定性曲线都相似，其中v
h
h和ch2结构域的解链温度在55℃
‑
62℃的范围内，并且ch3结构域的解链温度>90℃(表5)。通过dsc在温度tm1(表征hfc ch2结构域和fc5 vhh的解折叠)和tm2(表征hfc ch3结构域的解折叠)处观测到两个主要的解链转变。
[0405]
表5：fc5
‑
hfc人源化变体的热稳定性
[0406][0407]
在4℃下存储四个月后，在h11、h12和h32变体的样品中可见少量的细小沉淀。
[0408]
如实施例2中所述，在体外bbb transwell细胞培养测定中使用sv
‑
arbec细胞评估fc5
‑
hfc人源化变体的生物活性。将这些分子以成对的组合(a20.1对照抗体和测试分子)以1.25μm共同施加于体外bbb模型的上腔室，并通过底部隔室中的mrm进行定量。在60分钟内计算出每个样品的表观渗透(p
app
)值。在一式三份的transwell培养物中测试每种测试分子。fc5
‑
hfc和人源化变体的分析结果在图29中示出。除h72变体外，所有测试样品均显示fc5介导的转运，平均p
app
值为130
‑
220
×
10
‑6cm/min，并且大多数都落在野生型fc5
‑
hfc的历史范围(145
‑
190
×
10
‑6cm/min)。h72的转运活性明显低于其它人源化变体。
[0409]
为了测试fc5
‑
hfc人源化变体是否显示体内bbb转运活性，在炎性痛觉过敏的哈格里夫斯模型中测试野生型fc5
‑
hfc以及h32和h62变体。在该模型中，将构建体化学缀合至达拉根
‑
半胱氨酸，通过静脉内注射施用，并随时间测量疼痛反应(如实施例1中所述)。如图30所示，fc5
‑
hfc达拉根缀合物的全身给药引起明显的镇痛反应，这在野生型和h32或h62人源化变体之间没有显著差异。这三种分子的综合镇痛反应(auc值)相似，范围为最大可能效应
的20％
‑
30％。
[0410]
实施例5：在fc5中工程化第二个二硫化物以防止在大鼠血清中降解
[0411]
设计了一系列九种构建体(表6)，以通过在以下位点插入第二个二硫化物来稳定fc5而避免降解：fc5人源化设计h62中s49c
‑
i70c、t34c
‑
v79c和t33c与s102c、t103c、a104c或t105c配对，以及fc5人源化设计h32中s49c
‑
i70c、t34c
‑
v79c和t33c
‑
t103c。fc5 v
h
h内的工程化二硫化物的分子模型显示在图31中。在模型中，工程化的半胱氨酸定位在允许二硫化物形成的位置。t34c
‑
v79c创建一个连接框架区2(在cdr1与cdr2之间)至框架区3(cdr2与cdr3之间)的二硫化物，s49c
‑
i70c创建一个连接框架区2和3的不同的二硫化物，s33c系列创建一个连接cdr 1和3的二硫键。
[0412]
表6.示例性的二硫化物稳定的fc5序列
[0413]
[0414][0415]
构建体在cho细胞中表达并通过蛋白a琼脂糖凝胶色谱法纯化。表7示出了这9种构建体以及从250ml条件培养基的纯化产率的列表。
[0416]
表7.构建体的列表
[0417][0418]
通过octet，构建体的表达水平估计为7
‑
20mg/l。为了纯化，将澄清和过滤的培养基加载到0.5
‑
0.8ml蛋白a柱上，用5柱体积的20mm na2hpo
4 ph 7.4、100mm nacl洗涤，然后用25mm nah2po
4 ph 5.5、100mm nacl洗涤。用25mm nah2po
4 ph 2.8、100mm nacl ph 2.8从柱洗脱fc5
‑
li81，并且用从0.5m储备液稀释的25mm nah2po
4 ph 8.6中和。洗脱样品的蛋白质含量是根据280nm的吸光度使用1.4的消光系数针对1mg/ml溶液估算的。图32中所示的sds
‑
page分析证实了在非还原条件下hc和lc的表达以及组装成特征性的hc2lc2四聚体复
合物。样品4669显示在非还原条件下二硫化物的一些加扰(以箭头表示)，这反映在亮带的异质性上。fc5
‑
li81样品显示预期的尺寸排阻色谱曲线，每个洗脱为单个突出峰，分子量为约165kda。
[0419]
如实施例2中所述，在体外bbb transwell细胞培养测定中在sv
‑
arbec细胞上评估二硫化物稳定化的fc5
‑
(g4s)1
‑
li81样品的生物活性。将这些分子以成对的组合(抗hel对照抗体和测试分子)共同施加于体外bbb模型的上腔室，并通过底部隔室中的mrm进行定量；在90分钟内计算出每个样品的p
app
值。(顶部腔室)输入浓度介于1.5和3μm(线性期)之间，其中共同施用的对照抗体等摩尔输入。7种二硫化物稳定化的构建体的分析结果在图33中示出。所有测试样品均显示fc5介导的转运，平均p
app
值为100
‑
130
×
10
‑6cm/min。插入第二个二硫化物未明显改变fc5
‑
(g4s)1
‑
li81的转运活性。
[0420]
为评估插入的半胱氨酸/二硫化物是否使构建体稳定从而抵抗蛋白水解，将样品与胃蛋白酶以1:30(胃蛋白酶:样品)比率在37℃下孵育2.5小时，并通过sds
‑
page分析。图34和35示出了此分析的结果。li81的胃蛋白酶消化(图34泳道6)导致形成特征性fab'2片段(100kda)和低分子量fc片段，这在用胃蛋白酶处理抗体时通常会见到，尤其是针对li81 mab所描述(pepinsky等人,j pharmacol exp ther.,339:519
‑
529(2011))。胃蛋白酶对fc5
‑
h32
‑
g4s
‑
li81的消化(图34泳道8)产生一系列稍大的片段，与fc5 v
h
h的存在和fc5结构域内的片段化一致。如在li81 mab下所见，胃蛋白酶对该构建体的处理也引起fc裂解为低分子量片段。相比之下，fc5
‑
h32(t34c/v79c)
‑
g4s
‑
li81和fc5
‑
h32(t33c/t103c)
‑
g4s
‑
li81显示fc5结构域所特有的较少裂解的亮带，这表明fc5稳定。胃蛋白酶对fc5
‑
h62
‑
g4s
‑
li81构建体的消化(图35)还引起相似分子量的亮带的片段化模式发生变化。值得注意的是，fc5
‑
h62(s49c/i70c)
‑
g4s
‑
li81、fc5
‑
h62(t34c/v79c)
‑
g4s
‑
li81、fc5
‑
h62(t33c/t103c)
‑
g4s
‑
li81和fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
g4s
‑
li81比fc5
‑
h62(t33c/s102c)
‑
g4s
‑
li81和fc5
‑
h62(t33c/t105c)
‑
g4s
‑
li81更稳定。这些发现表明，添加第二个二硫化物可以保护fc5 v
h
h不被胃蛋白酶处理，并且添加的二硫化物的位置可以影响fc5稳定的程度。作为稳定化的独立措施，还通过差示扫描量热法分析样品的热稳定性变化。所有二硫化物工程化的构建体均显示出转变tm升高12
‑
13℃，对应于的未稳定化的fc5的转变tm为60℃，而所有具有工程化的二硫化物的构建体的转变tm为72.7℃
‑
73.2℃。
[0421]
通过质谱法对样品4662、4665、4667和4668进行广泛表征，并在大鼠血清中进行稳定性评估。首先，对还原的重链4662(预测质量62,172.0da，观测质量62172da)、4665(预测质量62,172.0da，观测质量62175da)、4667(预测质量62,170.0da，观测质量62173da)和4668(预测质量62,200.0da，观测质量62202da)样品和轻链(预测质量23,628.4da，观测质量23630da)的完整质量分析表明，所有样品中的主要成分均为预测轻链和重链。相应的去卷积谱显示在图36和37中。没有观测到主要成分的意外变化。
[0422]
血清稳定性评估是通过将4662、4665、4667和4668样品在大鼠血清中于37℃孵育70小时，然后在ig select上纯化并将它们在还原和非还原条件下进行肽图谱分析来进行的，如实施例3所述。将样品以100μg/ml外加至wistar大鼠血清中并在ig
‑
select上以50μl树脂/ml血清纯化。将每个样品与其未进行血清处理的对照物进行比较。对fc5
‑
h62
‑
g4s
‑
li81 4662、4665、4667和4668构建体的对照样品和70小时样品的二硫化物肽图谱进行的分析显示，每个构建体的主要二硫键均符合预期(表8至11)。
[0423]
表8.fc5
‑
h62(s49c/i70c)
‑
g4s
‑
li81(4662)中主要二硫键连接肽的列表
[0424][0425]
*强度相对于对照样品中的2个重链fc区和2个轻链肽归一化。
[0426]
表9.fc5
‑
h62(t34c/v79c)
‑
g4s
‑
li81(4665)中主要二硫键连接肽的列表
[0427][0428]
*强度相对于对照样品中的2个重链fc区和2个轻链肽归一化。
[0429]
表10.fc5
‑
h62(t33c/t103c)
‑
g4s
‑
li81(4667)中主要二硫键连接肽的列表
[0430][0431]
*强度相对于对照样品中的2个重链fc区和2个轻链肽归一化。
[0432]
表11.fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
g4s
‑
li81(4668)中主要二硫键连接肽的列表
[0433][0434]
*强度相对于对照样品中的2个重链fc区和2个轻链肽归一化。
[0435]
另外，未检测到重链fc5区和可变区的cys残基的错连。分析表明，构建体4667和4668在fc5区含有三硫键，即在含有c1、c2、c3和c4的二硫化物连接的肽簇中的三硫键[hc 20
‑
28(c1)、hc 88
‑
108(c3、c4)、hc 29
‑
38(c2)]。4667构建体中三硫化物的水平为约11％，4668构建体中为约6％。4807和4809构建体中重链(cys348)与轻链(cys215)之间的三硫键最高(13
‑
16％)(4807＝fc5
‑
h32(e1q)
‑
g4s
‑
li81；4809＝fc5
‑
h62(d1q)
‑
g4s
‑
li81)，但在其余的构建体4662、4665、4667和4668中低(1％
‑
4％)。与对照物中的水平相比，在wistar大鼠血清中孵育的70小时样品中仅观测到三硫化物水平的小幅下降。对于任何样品，均未观测到明显水平的其它cys修饰。还检查了经4
‑
乙烯基吡啶处理的非还原对照物和70小时六对构建体的还原的lys
‑
c/胰蛋白酶图谱以评估天然样品中游离硫醇的水平是否存在任何显著差异。分析显示所有样品中都有少量的游离硫醇，而对照样品和70小时样品之间没有显著差异。样品中三硫化物的水平因培养条件的不同而有所不同，因此报告的水平并未反映出产物特有的属性。
[0436]
对70小时样品的还原肽图谱中的肽回收率与相应对照样品的图谱中的肽回收率进行系统比较，表明通过在重链的fc5区添加二硫桥键，先前观测到的重链n端剪裁(参见实施例3)显著减少/消除。这些分析的结果显示在图38和39中。在c1(第一个cys)与c3(第三个cys)之间以及在c2(第二个cys)与c4(第四个cys)之间具有二硫键的fc5
‑
h62突变体构建体4667(t33c＝t103c)和4668(t33c＝a104c)的70小时样品的肽回收率与对照样品相似，而在c1与c4之间以及在c2与c3之间具有二硫键的fc5
‑
h62突变体构建体4662(s49c＝i70c)和4665(t34c＝v79c)的70小时样品的肽回收率分别为对照样品的约85％和70％。这些发现表明，在fc5中添加第二个二硫化物可保护融合蛋白的fc5部分免于在血清中发生蛋白水解降解，如图23中野生型fc5蛋白下所见。
[0437]
h62 fc5中的第一个氨基酸是天冬氨酸残基。因为抗体通常以焦谷氨酸为起始，并且这种修饰可以提供对氨基肽酶活性的预防，所以设计了一个含有野生型h62 fc5序列但以谷氨酰胺(d1q)为起始的构建体(4809)，这将引起n端焦谷氨酸的形成。有趣的是，当测试该样品的血清稳定性时(图38)，它大大失去稳定性，显示出与对照样品相比仅回收了30％的n端肽。70小时样品的轻链肽回收率与相应的对照样品非常相似。轻链肽的回收率的图显
示在图39中。
[0438]
基于从图38中看到的h62
‑
t33c/a104c(4d#4668)的血清稳定性的提高，在10mg/kg(约65nmol/kg)静脉内施用后在大鼠中进行pk分析，测量血清和csf水平。该分析的结果显示在图40中。二硫化物稳定化的产物的血清和csf水平在所有时间点均高于非稳定化型式。图40的底图中显示的csf/血清表明，二硫化物工程化防止转运活性随着时间推移损失，这在野生型构建体下观测到的。还通过mrm测量24小时时的脑水平，其中fc5、li81和hfc的值反映了来自各个结构域的标志肽的浓度(表12)。
[0439]
表12. 24小时时fc5
‑
li81样品的脑水平分析
[0440][0441]
二硫化物稳定化引起脑水平增加了约30％。为了测试其它二硫化稳定化的变体在全身施用后是否改善cns暴露，在并排分析中测试h62
‑
s49c/i70c(4d#4662)、h62
‑
t34c/v79c(4d#4665)、h62
‑
t33c/a104c(4d#4668)。此分析的结果显示在图41(血清分析)和42(csf和脑组织分析)中。所有三种形式均显示出高于li81的血清水平，并引起cns水平升高。这些改善转化为更高的csf和脑水平。
[0442]
在实施例1的不同框架设计的分析中，观测到构建体3438(其中fc5连接到li81的n端)和构建体3440(其中fc5通过长铰链连接到fc并且li81 fab连接在fc的c端)(表1，图11)都显示出良好的转运活性。作为这项发现的结果，除了上述3438构建体的稳定化版本(图40)以外，还设计了含有fc5 h62 t33c/a104c的3440构建体的二硫化物稳定化的型式。图43中显示的两种样品在大鼠中的pk分析显示，两种样品均引起csf水平提高，其中fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
fc
‑
g4s
‑
li81(vh、ch1)(格式3440)在静脉内施用后开始72小时内水平较高，并且fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
g4s
‑
li81 huigg1(格式3438)在静脉内施用后168小时内显示出更适度但更持续的csf水平。图左侧的示意图示出了两种工程化设计。
[0443]
fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
g4s
‑
li81(呈构建体3438的形式)在食蟹猕猴中的进一步研究显示，相对于单特异性li81，该双特异性抗体的csf暴露提高转化至非人灵长类动物。猴子植入腰椎鞘导管以重复收集csf，并施用65nmol/kg通过单次静脉内推注注射的抗体测试物品，每组12只未处理动物。热变性和胰蛋白酶消化后，相对于匹配基质中的蛋白质标准品，通过nanolc
‑
mrm定量检测血清和csf样品中的抗体水平，监测li81的两种肽和fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
g4s
‑
li81的三种肽。静脉内施用后三周时间内血清和csf抗体水平的结果显
astkgpsvfp lapsskstsg gtaalgclvk dyfpepvtvs wnsgaltsgv htfpavlqss glyslssvvt vpssslgtqt yicnvnhkps ntkvdkrvep kscdkthtcp pcpapellgg psvflfppkp kdtlmisrtp evtcvvvdvs hedpevkfnw yvdgvevhna ktkpreeqyn styrvvsvlt vlhqdwlngk eykckvsnka lpapiektis kakgqprepq vytlppsree mtknqvsltc lvkgfypsdi avewesngqp ennykttppv ldsdgsffly skltvdksrw qqgnvfscsv mhealhnhyt qkslslspg(seq id no:34)
[0452]
轻链pjd010
[0453]
mdmrvpaqll glllwfpgsr cdiqmtqsps slsasvgdrv titcrasqsi ssylnwyqqk pgkapklliy aasslqsgvp srfsgsgsgt dftltisslq pedfatyycq qsystpltfg ggtkveikrt vaapsvfifp psdeqlksgt asvvcllnnf ypreakvqwk vdnalqsgns qesvteqdsk dstyslsstl tlskadyekh kvyacevthq glsspvtksf nrgec(seq id no:35)
[0454]
这种融合在elisa结合测定中显示出与淀粉样蛋白β的结合与12f6a抗体非常相似(图45a)。12f6a fab与higg1 fc的c端融合的构建体显示出与淀粉样蛋白β的结合明显降低，因此fc5
‑
h62(t33c/a104c)融合物不是以这种格式进行的。fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
12f6a也在在svarbec transwell测定显示出跨越大鼠脑内皮细胞的渗透增加(图45b)，其中p
app
值比对照抗体(抗hel鼠igg1；goldbaum等人,j immunol.,162:6040
‑
6045(1999)；genbank af110316vh和ay277254.1vl)高4
‑
8倍。但是，单独12f6a也显示p
app
比对照物高约2倍，因此fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
12f6a的p
app
比单独12f6a高约3倍。在人多能干细胞(hu
‑
ipsc)衍生的transwell bbb模型中也证明了在人脑内皮细胞上的胞吞转移(ribecco
‑
lutkiewicz等人sci rep.,8(1):1873(2018)；图45c)，其中观测到fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
12f6a的p
app
值显著更大(比对照抗体大10倍；比单独12f6a高约5倍)。
[0455]
对于抗体12f4，使用单个g4s接头(seq id no:5)将fc5
‑
h62(t33c/a104c)与轻链的n端融合，创建fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
12f4(lc)，因为先前已确定重链n端的修饰略微降低与α
‑
突触核蛋白的结合。
[0456]
轻链pyl1593
[0457]
mgwslillfl vavatrvlsd vqlvesgggl vqpggslrls caasgfkith yctgwfrqap gkerefvsri twggdntfys nsvkgrftis rdnskntvyl qmnslraedt avyycaagst stctplrvdy wgqgtlvtvs sggggssyel tqppsvsvsp gqtaritcsg ealpmqfahw yqqrpgkapv ivvykdserp sgvperfsgs ssgttatlti tgvqaedead yycqspdstn tyevfgggtk ltvlsqpkaa psvtlfppss eelqankatl vclisdfypg avtvawkads spvkagvett tpskqsnnky aassylsltp eqwkshrsys cqvthegstv ektvaptecs(seq id no:36)
[0458]
为了研究基于fc5的胞吞转移作用是否受可调节与fc受体的结合的fc区差异的影响，将fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
12f4(lc)与野生型higg1亚类的12f4重链以及效应功能降低的三个支架共表达：higg1agly(n297q)、higg2 saa(参见vafa等人methods.65(1):114
‑
26(2014)和higg4p/g1 agly(参见us 2012/0100140 a1)。
[0459]
12f4 higg1(hc)
[0460]
evqlvesggglvepggslrlscavsgfdfekawmswvrqapgqglqwvarikstadggttsyaapvegrfiisrddsrnmlylqmnslktedtavyyctsahwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynsty
rvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:29)
[0461]
12f4 higg1 agly
[0462]
evqlvesggglvepggslrlscavsgfdfekawmswvrqapgqglqwvarikstadggttsyaapvegrfiisrddsrnmlylqmnslktedtavyyctsahwgqgtlvtvssastkgpsvfplapsskstsggtaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtqtyicnvnhkpsntkvdkrvepkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqyqstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:30)
[0463]
12f4 higg2 saa
[0464]
evqlvesggglvepggslrlscavsgfdfekawmswvrqapgqglqwvarikstadggttsyaapvegrfiisrddsrnmlylqmnslktedtavyyctsahwgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssnfgtqtytcnvdhkpsntkvdktverkscvecppcpappaaapsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstfrvvsvltvvhqdwlngkeykckvsnkglpapiektisktkgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppmldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:31)
[0465]
12f4 higg4p/g1
[0466]
evqlvesggglvepggslrlscavsgfdfekawmswvrqapgqglqwvarikstadggttsyaapvegrfiisrddsrnmlylqmnslktedtavyyctsahwgqgtlvtvssastkgpsvfplapcsrstsestaalgclvkdyfpepvtvswnsgaltsgvhtfpavlqssglyslssvvtvpssslgtktytcnvdhkpsntkvdkrveskygppcppcpapeflggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfqstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspg(seq id no:32)
[0467]
另外，通过g4s从fc的c端连接至12f4轻链，使fc5
‑
h62(t33c/a104c)与长链higg1 fc和12f4 fab融合来生成构建体(fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
fc
‑
12f4 fab(lc)。
[0468]
fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
fc
‑
12f4 fab(lc)，pyl1607
[0469]
mgwslillfl vavatrvlsd vqlvesgggl vqpggslrls caasgfkith yctgwfrqap gkerefvsri twggdntfys nsvkgrftis rdnskntvyl qmnslraedt avyycaagst stctplrvdy wgqgtlvtvs saepkscdkt htcppcpape llggpsvflf ppkpkdtlmi srtpevtcvv vdvshedpev kfnwyvdgve vhnaktkpre eqynstyrvv svltvlhqdw lngkeykckv snkalpapie ktiskakgqp repqvytlpp sreemtknqv sltclvkgfy psdiavewes ngqpennykt tppvldsdgs fflyskltvd ksrwqqgnvf scsvmhealh nhytqkslsl spgggggssy eltqppsvsv spgqtaritc sgealpmqfa hwyqqrpgka pvivvykdse rpsgvperfs gsssgttatl titgvqaede adyycqspds tntyevfggg tkltvlsqpk aapsvtlfpp sseelqanka tlvclisdfy pgavtvawka dsspvkagve tttpskqsnn kyaassylsl tpeqwkshrs yscqvthegs tvektvapte cs(seq id no:37)
cqvthegstv ektvaptecs(seq id no:41)
[0483]
重链，peag2974
[0484]
mdmrvpaqll gllllwfpgs rcqvqlvesg ggvvqpgrsl rvscaasgft fssydmhwvr qapgkglewv aviwfdgsne fyadsvkgrf tisrdnsknt lflqmnslra edtavyycar dlgasvttsn aenfhhwgqg tlvtvssast kgpsvfplap sskstsggta algclvkdyf pepvtvswns galtsgvhtf pavlqssgly slssvvtvps sslgtqtyic nvnhkpsntk vdkrvepksc dkthtcppcp apellggpsv flfppkpkdt lmisrtpevt cvvvdvshed pevkfnwyvd gvevhnaktk preeqynsty rvvsvltvlh qdwlngkeyk ckvsnkalpa piektiskak gqprepqvyt lppsreemtk nqvsltclvk gfypsdiave wesngqpenn ykttppvlds dgsfflyskl tvdksrwqqg nvfscsvmhe alhnhytqks lslspg(seq id no:42)
[0485]
另外，备用格式fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
fc
‑
6c5 fab作为重链和轻链融合分子生成。
[0486]
fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
fc
‑
6c5 fab(hc)
[0487]
重链，pyl1612
[0488]
mgwslillfl vavatrvlsd vqlvesgggl vqpggslrls caasgfkith yctgwfrqap gkerefvsri twggdntfys nsvkgrftis rdnskntvyl qmnslraedt avyycaagst stctplrvdy wgqgtlvtvs saepkscdkt htcppcpape llggpsvflf ppkpkdtlmi srtpevtcvv vdvshedpev kfnwyvdgve vhnaktkpre eqynstyrvv svltvlhqdw lngkeykckv snkalpapie ktiskakgqp repqvytlpp sreemtknqv sltclvkgfy psdiavewes ngqpennykt tppvldsdgs fflyskltvd ksrwqqgnvf scsvmhealh nhytqkslsl spgggggsqv qlvesgggvv qpgrslrvsc aasgftfssy dmhwvrqapg kglewvaviw fdgsnefyad svkgrftisr dnskntlflq mnslraedta vyycardlga svttsnaenf hhwgqgtlvt vssastkgps vfplapssks tsggtaalgc lvkdyfpepv tvswnsgalt sgvhtfpavl qssglyslss vvtvpssslg tqtyicnvnh kpsntkvdkrvepksc(seq id no:43)
[0489]
轻链，peag2942
[0490]
mdmrvpaqll gllllwfpgs rcsyeltqpp svsvspgqta ritcsgdalp kryvywyqqk sgqapvlviy edskrpsgip etfsgsssgt matltisgaq vedeadyycy stdsnghhwv fgggtkltvl gqpkaapsvt lfppsseelq ankatlvcli sdfypgavtv awkadsspvk agvetttpsk qsnnkyaass ylsltpeqwk shrsyscqvt hegstvektv aptecs(seq id no:44)
[0491]
fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
fc
‑
6c5 fab(lc)
[0492]
pyl1614
[0493]
mgwslillfl vavatrvlsd vqlvesgggl vqpggslrls caasgfkith yctgwfrqap gkerefvsri twggdntfys nsvkgrftis rdnskntvyl qmnslraedt avyycaagst stctplrvdy wgqgtlvtvs saepkscdkt htcppcpape llggpsvflf ppkpkdtlmi srtpevtcvv vdvshedpev kfnwyvdgve vhnaktkpre eqynstyrvv svltvlhqdw lngkeykckv snkalpapie ktiskakgqp repqvytlpp sreemtknqv sltclvkgfy psdiavewes ngqpennykt tppvldsdgs fflyskltvd ksrwqqgnvf scsvmhealh nhytqkslsl spgggggssy eltqppsvsv spgqtaritc sgdalpkryv ywyqqksgqa pvlviyedsk rpsgipetfs gsssgtmatl tisgaqvede adyycystds nghhwvfggg tkltvlgqpk aapsvtlfpp sseelqanka tlvclisdfy pgavtvawka dsspvkagve tttpskqsnn kyaassylsl tpeqwkshrs yscqvthegs tvektvapte cs
[0494]
(seq id no:45)
[0495]
pyl1596
[0496]
mdmrvpaqll gllllwfpgs rcqvqlvesg ggvvqpgrsl rvscaasgft fssydmhwvr qapgkglewv aviwfdgsne fyadsvkgrf tisrdnsknt lflqmnslra edtavyycar dlgasvttsn aenfhhwgqg tlvtvssast kgpsvfplap sskstsggta algclvkdyf pepvtvswns galtsgvhtf pavlqssgly slssvvtvps sslgtqtyic nvnhkpsntk vdkrvepksc
[0497]
(seq id no:46)
[0498]
fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
6c5 higg1与τ蛋白的结合与6c5 higg1相似(图47a)，而fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
fc
‑
6c5 fab分子显示出τ蛋白结合大大降低。在svarbec transwell测定中进一步测试fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
6c5(hc)higg1和fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
6c5(l c)higg1分子的胞吞转移作用(图47b)，并显示p
app
比对照抗体高4至8倍。6c5 higg1显示出比对照物略高的p
app
(是抗hel migg1的1.7倍)。
[0499]
为验证与12f4和12f6a抗体融合的二硫化物工程化的fc5与未进行二硫化物工程化的变体相比具有提高的分子稳定性，如二硫化物工程化的fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
li81所示(图35)，进行胃蛋白酶消化。fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
li81 higg1 agly用作具有抵抗胃蛋白酶消化的良好稳定性的分子的实例，fc5
‑
h32
‑
li81 higg1 agly用作稳定性较差的分子的实例，并将这些的胃蛋白酶消化物与二硫化物工程化的fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
12f4(在野生型和无糖基化的higg1支架上)、fc5
‑
h62(t33c/a104c)
‑
12f6a higg1和未稳定化的fc5
‑
h32
‑
12f6a higg1的消化物进行比较(图48)。所有蛋白质消化均在20mm乙酸钠ph 3.6中在1mg/ml和0.033mg/ml胃蛋白酶下进行，在37℃下孵育1小时或2.5小时。通过消化后的sds
‑
page分析，与未进行二硫化物工程化的分子(fc5
‑
h32融合物)相比，所有带有附加二硫化物的分子(fc5
‑
h62(t33c/a104c)融合物)显示出更高分子量的亮带的强度更高。对于fc5
‑
h32融合物，观测到较低分子量亮带的减少，在图48中用箭头突出显示，是没有二硫化物稳定化下的蛋白酶敏感性的阳性对照。
[0500]
其它实施方案
[0501]
虽然已结合详细说明描述了本发明，但是前述描述意图阐释而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围来界定。其它方面、优点和修改在以下权利要求书的范围内。
再多了解一些
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