一株泛菌及菌锰混合物及在降解孔雀石绿中的应用的制作方法

eucrina ss01及其锰氧化产物混合而成；
10.具体地，所述菌锰混合物通过以下方法制备：将泛菌pantoea eucrina ss01及其培养液与氯化锰溶液混合培养，将培养得到的产物烘干即得到菌锰混合物。
11.在本发明的第三方面，提供一种第二方面所述菌锰混合物在降解孔雀石绿中的应用。
12.本发明的具体实施方式具有以下有益效果：
13.本发明实施方式中的菌锰混合物能够快速降解高浓度孔雀石绿，能够将1000mg/l的孔雀石绿在24h内降解至38.10mg/l，降解率为96.19％；
14.本发明实施方式中的菌锰混合物能够持续性降解高浓度孔雀石绿，在持续补料降解中，每隔24h添加600mg/l孔雀石绿，累计添加五次，最终剩余孔雀石绿浓度为89.54mg/l，累计降解率为97.02％；
15.本发明通过对大豆及蓝藻的毒性试验证明菌锰混合物对孔雀石绿的降解产物对生物生长发育无影响，证明其降解产物无毒无害；
16.本发明与传统昂贵的理化方法相比具有使用成本低，生态恢复好等优点，应用前景极为广阔，能够解决目前三苯甲烷类染料污染水体难以治理的实践难题。
附图说明
17.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
18.图1为菌锰混合物降解产物hplc
‑
ms分析结果图；其中图1a为菌锰混合物降解产物hplc图，图1b为菌锰混合物降解产物hplc局部放大图，图1c为4
‑
乙烯基
‑
n，n
‑
二甲基苯胺的质谱图(2.550分钟，m/z＝147)，图1d为(4
‑
二甲基氨基
‑
苯基)
‑
苯基
‑
甲酮的质谱图(2.649分钟，m/z＝226)，图1e为二甲基
‑
(4
‑
氧代
‑
环己
‑
2,5二烯叉)铵的质谱图(3.567分钟，m/z＝136)，图1f为4
‑
二甲基氨基苯甲醛的质谱图(4.209分钟，m/z＝150)，图1g为4
‑
甲基氨基苯甲酸的质谱图(6.476分钟，m/z 152)，图1h为去甲基孔雀石绿的质谱图(17.791分钟，m/z315)；
19.图2为本发明实施例3菌锰混合物降解不同浓度孔雀石绿效果图；
20.图3为本发明实施例4菌锰混合物持续降解孔雀石绿效果图；
21.图4为本发明实施例5孔雀石绿及其降解产物对大豆生长的影响；其中，mg为孔雀石绿，s为经菌处理后的孔雀石绿脱色液，sm为经菌锰混合物处理后的孔雀石绿降解产物，water为对照组。
22.图5为本发明实施例1泛菌pantoea eucrina ss01 nj进化树。
具体实施方式
23.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本技术使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
24.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式
也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
25.本发明的一种实施方式中，提供了一株泛菌pantoea eucrina ss01，该菌株已于2021年3月24日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称cctcc，地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山)，保藏编号为cctcc m 2021491。
26.所述泛菌pantoea eucrina ss01分离自盐地碱蓬叶片，菌落粘稠呈黄色，有臭味，表面平滑，最适生长温度为30℃，ph＝7。
27.本发明还保护活性成分为所述泛菌pantoea eucrina ss01的菌剂。
28.本发明的一种实施方式中，提供一种菌锰混合物，所述菌锰混合物由泛菌pantoea eucrina ss01及其锰氧化产物混合而成；
29.具体地，所述菌锰混合物通过以下方法制备：将泛菌pantoea eucrina ss01及其培养液与二价锰化合物溶液混合培养，将培养得到的产物烘干即得到菌锰混合物。
30.优选的，所述二价锰化合物选自氯化锰或硫酸锰；
31.在一种或多种实施方式中，所述泛菌pantoea eucrina ss01通过接种于lb液体培养基中培养以获得大量菌体作为种子液；
32.进一步的，泛菌在lb液体培养基中的培养条件为在25～35℃，转速为150～200rpm的摇床中过夜培养；
33.在一种或多种实施方式中，所述氯化锰溶液的浓度为1～3m，优选为2m。
34.进一步的，所述氯化锰溶液使用前进行过滤并除菌；
35.在一种或多种实施方式中，所述培养基为k氏培养基，培养条件为：在28～32℃恒温震荡培养；
36.在一种或多种实施方式中，所述氯化锰溶液的加入时机为：测量泛菌pantoea eucrina ss01及其培养液的od
600
值，待od
600
值为0.7～0.9时，加入氯化锰溶液，使氯化锰溶液终浓度为15～25mm，优选为20mm，获得菌锰混合物。
37.在一种或多种实施方式中，混合培养的时间为2
‑
4天，优选为3天；
38.在一种或多种实施方式中，所述烘干的条件为50～60℃，时间10～12h。
39.具有锰氧化活性的细菌被称为锰氧化细菌，锰氧化细菌种属多样性，分布广泛。现有技术中已分离到的锰氧化细菌主要集中在厚壁菌门(firmicutes)、放线菌门(actinobacteria)和α、β和γ变形菌纲(proteobacteria)。锰氧化细菌氧化生成的锰氧化物被称为细菌锰氧化物。生物氧化锰包含了mn(iii/iv)氧化物、mn(ii)碳酸盐的形式，它们发生在细菌的细胞外或者内生孢子的表面。
40.本发明中的菌锰混合物是由锰氧化细菌泛菌pantoea eucrina ss01及其锰氧化产物混合而成的，相比较于锰氧化细菌或者锰氧化产物，菌锰混合物在降解有机污染物时效率会明显提升，降解有机物生成的mn(ii)可以被锰氧化细菌泛菌pantoea eucrina ss01再次氧化成mn(iii/iv)，生成的mn(iii/iv)氧化物又可以继续氧化降解有机污染物，即泛菌pantoea eucrina ss01及其锰氧化产物存在协同作用。
41.本发明的一种实施方式中，提供一种上述菌锰混合物在降解孔雀石绿中的应用；
42.在一种或多种实施方式中，所述应用的方法为：向孔雀石绿溶液中加入菌锰混合物，调节ph为4.0～7.0，温度为25～35℃，反应12～24h，使孔雀石绿降解；
43.优选的，菌锰混合物与孔雀石绿的质量比为1～1.5：1。
44.优选的，所述孔雀石绿溶液中孔雀石绿的浓度为1000mg/l及以下；
45.优选的，向孔雀石绿溶液和菌锰混合物的反应溶液中重复添加浓度600mg/l及以下的孔雀石绿，重复添加的次数在5次及以下。
46.下面结合具体的实施例对本发明作进一步的解释和说明。
47.实施例1
48.泛菌pantoea eucrina ss01的分离和鉴定
49.1、泛菌菌株pantoea eucrina ss01的筛选
50.本发明的泛菌pantoea eucrina ss01分离自盐地碱蓬叶片，分离方法为：
51.1)采集来的盐地碱蓬植物样品地上部分选取大约5g完整的叶片，先用清水洗净，擦干并称量记录。
52.2)在无菌操作台中置于吐温80中浸泡5分钟，用无菌水冲洗3遍，再用吐温80浸泡3分钟，用无菌水冲洗3遍，以上步骤重复3～5遍。然后于0.1％的hgcl2溶液中浸泡1分钟，75％乙醇中浸泡3分钟，最后用无菌水冲洗干净。最后一遍水涂布平板，检测消毒是否彻底。
53.3)用无菌镊子将消过毒的实验样品转移到灭过菌的研钵中，将其研磨。
54.4)将匀浆液分别加入含有浓度为5mmol/l的重金属mncl2的lb液体培养基中，于摇床150rpm中培养48h。
55.5)将lb液体培养基中长出的菌体用划线分离法分离培养。
56.6)选取不同形态的菌落编号，挑取单菌落进一步于lb液体培养基中30℃，150rpm条件下培养48h。
57.2、菌株鉴定
58.微生物学特性鉴定：
59.所述泛菌pantoea eucrina ss01菌落粘稠呈黄色，有臭味，表面平滑，最适生长温度为30℃，ph＝7。
60.分子生物学特性：
61.经菌株16s rdna基因序列比对分析，菌株为pantoea eucrina ss01，基于本实验分离出来的锰氧化细菌和其他已报道的锰氧化细菌的16s rdna基因序列制作nj进化树(图5)，用sulfolobus acidocaldarius strain atcc 33909作为外类群，bootstrap值为1000，仅显示高于50％的自展值。bar,0.05。
62.实施例2
63.制备菌锰混合物：
64.(1)将菌株ss01划线培养，挑取单菌落接种于lb液体培养基中，在25～35℃条件下，转速为150～200rpm的摇床中过夜培养，以获得大量菌体，作为种子液；(2)称取mncl2共125.84g溶于500ml去离子水中，常温下搅拌溶解，获得终浓度为2m的mncl2，并过滤除菌；(3)在k培养基中接种1％的步骤(1)中的ss01菌液，放在30℃，120rpm恒温摇床中震荡培养，每小时测一次od
600
值，待od
600
值为0.8时，往摇瓶中加入步骤(2)中的2m的mncl2，使终浓度为20mm，继续培养3天，获得菌锰混合物；(4)将步骤(3)中获得的菌锰混合物在4000rpm下离心15min，弃上清，用无菌去离子水洗涤两次，再次离心，将菌锰混合物沉淀放在60℃的烘箱中，连续烘烤12h。
65.实施例3
66.将实施例1烘干得到的菌锰混合物干粉用天平称量，每份10mg，分别用200mg/l，300mg/l，500mg/l，1000mg/l的孔雀石绿溶液重悬，放在30℃，120rpm的摇床中震荡，24h后测量孔雀石绿剩余含量，每个实验设置三个平行实验，每次测量三次，取平均值使用。整个过程保持无菌操作。将降解样品于12000rpm条件下离心5min，取上清，利用紫外可见光分光光度计在620nm处测定吸光值，计算降解率。
67.降解率的计算方式：利用紫外可见光分光光度计在620nm处测定溶液吸光值，计算降解率：
68.降解率(％)＝(a
‑
b)/a
×
100；公式中a为降解前的od值，b为降解后的od值。
69.菌锰混合物对200mg/l，300mg/l，500mg/l，1000mg/l的降解率分别为84.99％，89.40％，92.38％，96.19％，如图2所示。
70.菌锰混合物将接孔雀石绿的降解产物，经过hplc
‑
ms分析，如图1所示，得到典型的孔雀石绿降解产物，如4
‑
乙烯基
‑
n，n
‑
二甲基苯胺(2.550分钟，m/z＝147，图1c)，(4
‑
二甲基氨基
‑
苯基)
‑
苯基
‑
甲酮(2.649分钟，m/z＝226，图1d)，二甲基
‑
(4
‑
氧代
‑
环己
‑
2,5二烯叉)铵(3.567分钟，m/z＝136，图1e)，4
‑
二甲基氨基苯甲醛(4.209分钟，m/z＝150，图1f)，4
‑
甲基氨基苯甲酸(6.476分钟，m/z 152，图1g)，去甲基孔雀石绿(17.791分钟，m/z＝315，图1h)。
71.实施例4
72.将实施例1制备得到的菌锰混合物干粉用天平称量，每份10mg，将干粉用600mg/l的孔雀石绿重悬，放在30℃，120rpm的摇床中震荡脱色，每隔24h测量一次孔雀石绿剩余含量，并补充600mg/l的孔雀石绿，整个过程重复五次，每个实验设置三个平行实验，每次测量三次，取平均值使用。整个过程保持无菌操作。将降解样品于12000rpm条件下离心5min，取上清，利用紫外可见光分光光度计在620nm处测定吸光值，计算降解率。
73.菌锰混合物表现出持续的降解能力，最终累计降解率为97.02％，累计降解孔雀石绿的浓度是2920mg/l，如图3所示。
74.实施例5
75.使用孔雀石绿mg，经菌处理后的孔雀石绿脱色液s，经菌锰混合物处理后的孔雀石绿降解产物sm，对照组water分别进行大豆生长影响实验：
76.大豆：将烘干得到的菌粉及菌锰混合物干粉用天平称量，每份10mg，用无菌的去离子水配置1000mg/l的mg并重悬干粉，放在30℃，120rpm的摇床中震荡脱色，24h后在12000rpm离心10min，弃沉淀，将上清液过滤除菌，作为大豆萌发的水备用。
77.将90粒大豆种子用3
‑
5％h2o2溶液消毒5min，用无菌水洗涤3
‑
5次，置于灭过菌的垫有双层滤纸的大平皿中，向大平皿中加入20ml孔雀石绿代谢产物(1000mg/l孔雀石绿)或1000mg/l孔雀石绿溶液，设置无菌水组(无菌水代替孔雀石绿)为对照组，放在30℃恒温培养箱中避光培养，第二天测量大豆发芽数，并测量根茎长。
78.实验结果如图4所示，从图4中可以看出：
79.大豆发芽率没有受到孔雀石绿影响(图4)，孔雀石绿组发芽情况与对照组相近，均为93％左右；孔雀石绿对大豆根尖发育有较大的影响，在第二天，对照组大豆根茎长在18mm左右，而孔雀石绿处理组仅为7mm左右(图4)，差异明显。根据图4可以看出降解产物对大豆
发芽情况没有明显影响，均为93％上下，而经过菌株ss01脱色后的上清液依然对大豆后续生长有影响，情况与孔雀石绿组相近，均是影响了大豆根茎的正常生长(图4s)，而经过菌锰化合物降解后的降解产物对大豆影响明显减小，情况与对照组接近(图4sm)，而第二天根茎长虽然平均数上比对照组小3mm，但是经过t检验p值大于0.05没有显著性差异，说明经过菌锰化合物降解后的产物已经完全脱毒，降解产物中也没有出现毒性更强的物质。
80.以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。