一种具有抗菌活性的肽KC-19的制作方法

一种具有抗菌活性的肽kc
‑
19
技术领域
1.本发明涉及一种具有抗菌活性的肽kc
‑
19。


背景技术：

2.真菌性植物病原体是一类重要的微生物，给世界各地农业生产造成重大的经济损失。几十年来，通常使用化学农药来控制真菌病原体的生长和传播。然而，农药的使用既污染环境又危害人类身体健康，而且农药作用范围有限。因此，迫切需要寻找一种绿色、环保、安全的新型杀菌剂来代替目前正在使用的化学农药。
3.抗菌肽是一类广泛存在于整个生物界的多肽。抗菌肽可作为植物、昆虫或哺乳动物免疫系统的一部分，抵抗病原微生物的入侵。抗菌肽具有抗菌谱广、分子量小、热稳定性和水溶性好、不易产生耐药性等特点。在许多致病菌对现有的抗生素产生明显耐药性的情况下，抗菌肽的发现和研究为开发新的抗菌药物提供了可能。
4.过去几十年的研究主要集中在来源于传统orfs的传统肽。近年来，一类从先前未被注释的非编码区中得到的新型多肽——非传统肽，作为植物中重要的功能性内源肽受到了广泛关注。研究表明，非传统肽在各种生物过程中发挥着重要作用，如翻译调控、植物发育及应激反应。


技术实现要素：

5.本发明要解决的技术问题是提供一种具有抗菌活性的肽。
6.本发明的技术方案是：一种具有抗菌活性的肽kc
‑
19的氨基酸序列为kchlhplckgealelfsvg。
7.肽kc
‑
19来源于基因间区，分子量为2194.11da，等电点为6.9。
8.所述的肽kc
‑
19在抑制植物病原真菌活性中应用。
9.所述植物病原真菌为玉米生平脐蠕孢菌、新月弯孢菌或禾谷镰刀菌。
10.本发明的有益效果是：肽kc
‑
19的广谱抗真菌活性实验表明，肽kc
‑
19主要是通过菌丝聚集从而达到对真菌的抑制作用。kc
‑
19对玉米生平脐蠕孢菌、新月弯孢菌和禾谷镰刀菌的最高抑制率分别47.0％、47.8％和25.1％。
附图说明
11.图1为菌丝生长速率法的方法示意图；
12.图2为合成的肽kc
‑
19的质谱图；
13.图3为合成的肽kc
‑
19的高效液相色谱图；
14.图4为肽kc
‑
19对玉米生平脐蠕孢菌的表型鉴定，每处理三个重复，选取其中一个作为代表，标尺为1cm；
15.图5为肽kc
‑
19对玉米生平脐蠕孢菌的生长抑制率。生长抑制率计算公式：i％＝[(c
‑
d)
‑
(t
‑
d)]/(c
‑
d)
×
100％；
[0016]
图6为肽kc
‑
19在36hpi对玉米生平脐蠕孢菌菌丝形态的影响，标尺为20μm；
[0017]
图7为肽kc
‑
19对新月弯孢菌的表型鉴定，每处理三个重复，选取其中一个作为代表，标尺为1cm；
[0018]
图8为肽kc
‑
19对新月弯孢菌的生长抑制率。生长抑制率计算公式：i％＝[(c
‑
d)
‑
(t
‑
d)]/(c
‑
d)
×
100％；
[0019]
图9为肽kc
‑
19在36hpi对新月弯孢菌菌丝形态的影响，标尺为20μm；
[0020]
图10肽kc
‑
19对禾谷镰刀菌的表型鉴定，每处理三个重复，选取其中一个作为代表，标尺为1cm；
[0021]
图11为肽kc
‑
19对禾谷镰刀菌的生长抑制率。生长抑制率计算公式：i％＝[(c
‑
d)
‑
(t
‑
d)]/(c
‑
d)
×
100％；
[0022]
图12为肽kc
‑
19在36hpi对禾谷镰刀菌菌丝形态的影响，标尺为20μm。
具体实施方式
[0023]
1材料与方法
[0024]
1.1实验材料
[0025]
1.1.1病原菌
[0026]
玉米生平脐蠕孢菌、新月弯孢菌和禾谷镰刀菌均由本实验室保存。
[0027]
1.1.2培养基
[0028]
本研究所用到的培养基均为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)，配置如下：
[0029]
(1)新鲜马铃薯200g，去皮后切块放入1000ml蒸馏水中。
[0030]
(2)沸水煮20min后，用纱布过滤。
[0031]
(3)在滤液中加入20g蔗糖，20g琼脂粉，加入蒸馏水定容至1000ml。
[0032]
(4)121℃高压灭菌21min后，倒平板备用。
[0033]
1.2实验方法
[0034]
1.2.1肽的合成
[0035]
通过fmoc(9
‑
芴基甲氧基羰基)多肽固相合成的方法进行合成，顺序为从c端(羧基端)向n端(氨基端)合成。首先，将有fmoc保护的氨基酸连接在树脂上，用20％哌啶/dmf溶液将树脂中的fmoc保护基脱去，使其露出活泼的nh2基，第二个fmoc保护的氨基酸通过hbtu法被连接上，直到整条肽链连接完毕。用dmf溶剂将肽链从树脂上洗脱下来得到粗品。具体实验方法如下：
[0036]
(1)树脂合成
[0037]
a.fmoc
‑
aa
‑
王树脂
[0038]
通过fmoc
‑
aa
‑
oh上的羧基与王树脂上的
‑
oh脱去1分子h2o反应得到。反应如下：
[0039][0040]
具体合成步骤如下：
[0041]
在圆底烧瓶中加入称好的王树脂，加入适量干燥dmf溶胀，用磁子搅拌，加入1.5eq的fmoc
‑
aa
‑
oh，再加6eq的吡啶，直到fmoc
‑
aa
‑
oh溶解后用滴管缓慢的滴加3eq的2,6
‑
二氯苯甲酰氯，加完后用橡皮塞盖紧，震荡反应3h以上。用砂芯漏斗抽滤除去溶液后，用dmf(3
次)、meoh(1次)、dcm(3次)和meoh(2次)洗涤树脂。再转入收集管中，在真空干燥器中过夜抽干。
[0042]
b.fmoc
‑
aa
‑2‑
cl trt树脂的合成
[0043]
通过fmoc
‑
aa
‑
oh上的羧基与2
‑
cl trt树脂上的
‑
cl脱去1分子hcl反应得到fmoc
‑
aa
‑2‑
cl trt resin，主要用于c端是pro，cys，his这三种氨基酸的合成。反应如下：
[0044][0045]
具体合成步骤如下：
[0046]
在圆底烧瓶中加入称量好的2
‑
cl trt树脂和2eq的fmoc
‑
aa
‑
oh，加入适量干燥的dcm溶胀树脂和溶解氨基酸，再加入6eq的dipea。用塞子盖紧，在室温下搅拌反应2
‑
3h。再加入hplc级meoh(1g树脂加10ml)搅拌30min。用砂芯漏斗抽滤除去溶液后，用dmf(3次)、meoh(1次)、dcm(3次)和meoh(2次)洗涤树脂。再转入收集管中，在真空干燥器中过夜抽干。
[0047]
c.rink amide mbha树脂合成
[0048]
通过linker amide基团与mbha树脂连接反应得到。具体步骤如下：
[0049]
将mbha树脂加入反应器中，加入2eq hb活化rink amide，加入6倍量nmm。反应3
‑
4h。封端，将树脂移入砂芯漏斗分别用dmf洗涤3次、meoh洗涤1次、dcm洗涤3次、meoh洗涤3次。树脂移入真空抽干。
[0050]
(2)树脂用量的称量及溶胀
[0051]
根据要合成肽的摩尔数及树脂的取代度(树脂量＝要合成肽的摩尔数/树脂的取代度)，计算出所需的树脂量，然后称出树脂，放入贴有相应编号的反应器中。将上述加有树脂的反应器在架子上放置好，加入3
‑
5倍树脂床层体积的dmf，浸胀30min。
[0052]
(3)脱保护及其洗涤
[0053]
加入约3倍树脂床层体积的20％哌啶/dmf溶液，通氮气反应5min后，将其抽去，再加入约3倍树脂床层体积的20％哌啶/dmf溶液，通氮气反应15min。
[0054]
(4)脱保护后茚三酮检测
[0055]
取少量的树脂于检测小试管中，加入茚三酮，110
‑
120℃温度下反应3min，然后观察其显色。不同的氨基酸会显出不同的颜色，大多数的氨基酸树脂会呈现深蓝色或蓝色，而pro、asn、asp、gln、glu、his和cys多数显红色或红褐色。但是由于合成时肽的序列不同，所以氨基酸显示出的颜色也不是完全符合上述说的情形，有时会受到前面氨基酸的影响而显示其他颜色。但是，只要脱保护后进行的茚三酮检测反应，树脂显示出的颜色和连接时有明显区别，则说明脱保护反应进行完全。
[0056]
(5)连接反应
[0057]
溶剂：
[0058]
dmf(n，n
‑
二甲基甲酰氨)，dcm(二氯甲烷)
[0059]
原料配比：
[0060]
aa：hbtu：nmm＝3：2.85：6(摩尔比)
[0061]
将氨基酸加入反应器中，加入能使氨基酸溶解的最少量的dmf，再加入hbtu，再加
入nmm，反应60min。
[0062]
注：
①
加dmf溶解前要先开氮气，防止氨基酸漏掉。
[0063]
②
一定要等氨基酸完全溶解后再加入hbtu。
[0064]
③
反应时dmf溶剂的加入量以全部浸没树脂为准。
[0065]
④
氮气搅拌的气流要适当。
[0066]
(6)连接后nt检测
[0067]
用滴管取少量树脂于检测试管中，先用dmf和meoh各清洗树脂一遍，后面步骤同脱保护检测。连接完全后树脂一般是无色透明，少数情况下会显淡黄色。跟前面脱保护所显颜色比较区别很明显，则表示连接完全。
[0068]
(7)封端
[0069]
配比：5％
‑
10％乙酸酐/dmf nmm(乙酸酐：nmm＝1：1)
[0070]
加入树脂层3倍体积的封端溶液，通氮气搅拌30min，然后抽掉溶液，先用dcm冲洗反应器口，再用dmf洗涤5遍，将封端液洗净。
[0071]
(8)连接后的洗涤
[0072]
连接后的洗涤与脱保护后的洗涤方法相同，只是连接后洗涤三次即可。
[0073]
重复前面的步骤，直到一条肽链完成
[0074]
(9)树脂转移
[0075]
用dmf溶剂将脱保护洗涤后的树脂转移到砂芯漏斗中，用甲醇洗一次，dcm溶剂洗三次，再用甲醇洗两次。最后一次洗涤用甲醇尽量使树脂聚集在砂芯漏斗的中心，抽干，转移至小收集管中，贴好标签，置于真空干燥器内抽干，以备切割。
[0076]
(10)切割
[0077]
a.切割液的配制
[0078]
a液：tfa：茴香硫醚：苯酚：edt：水＝87.5：5：2.5：2.5：2.5
[0079]
b液：tfa：tis：水＝95：3：2
[0080]
b.切割液的选择和用量
[0081]
一般含有cys，met和侧链未保护的trp的肽链选用a液，其它肽都用b液。1g树脂一般加10
‑
15ml切割液。
[0082]
c.切割时间
[0083]
指向树脂中加入切割液开始，到用乙醚沉淀滤液为止这段时间。对于短肽(如五、六肽)切2h，10个以上的切2.5h，对于30个以上的肽来说，适当延长时间。
[0084]
加入适量的切割液，放入摇床上反应，减压抽滤，收集滤液，将滤液用乙醚冲洗在离心管中。在离心机中离心沉淀(转速在4000rad/min左右)，倒掉上清液，用玻璃棒将沉淀捣碎，用乙醚冲洗，再离心沉淀。按以上方法重复清洗三遍。
[0085]
将粗品放入真空干燥器内抽干，然后利用hplc进行纯化，得到纯度>90％的纯品，并进行质谱鉴定。
[0086]
1.2.2肽溶液的配置
[0087]
将合成好的肽溶解于无菌水中，然后用无菌水配置成肽浓度为1mm的母液，将配置好的肽溶液分装至2ml ep管中，
‑
20℃保存。后期使用时用pda培养基将母液稀释至100μμ。
[0088]
1.2.3实验菌株的制备
[0089]
(1)4℃保存的菌株用打孔器在培养基上打菌饼。
[0090]
(2)将菌饼接种在新的pda培养基上。
[0091]
(3)28℃、黑暗条件下培养4天用于活化。
[0092]
(4)活化好的菌株用打孔器在培养基上打菌饼。
[0093]
(5)将打好的菌饼接种在另一个新的pda培养基上。
[0094]
(6)28℃、黑暗条件下培养4天，用于后续实验。
[0095]
1.2.4生长抑制试验
[0096]
(1)pda培养基121℃，高压灭菌21min后，冷却至60℃。
[0097]
(2)然后与肽溶液混合配置成肽终浓度为100μμ的混合液，用无菌水代替肽溶液作为对照。
[0098]
(3)充分混匀后倒入直径为30mm的无菌培养皿中。
[0099]
(4)待培养基凝固后，从培养四天的真菌菌落外缘取一个5mm的菌饼，菌丝面朝下，接种在培养基的中央。
[0100]
(5)培养基在黑暗，28℃条件下培养。
[0101]
(6)每隔3h或6h拍照记录并测量菌落直径(图1)。
[0102]
1.2.5生长抑制率的计算
[0103]
(1)pda培养基121℃，高压灭菌21min后，冷却至60℃。
[0104]
(2)然后与肽溶液混合配置成肽终浓度为100μμ的混合液，用无菌水代替肽溶液作为对照。
[0105]
(3)充分混匀后倒入30mm的无菌培养皿中。
[0106]
(4)待培养基凝固后，从培养四天的真菌菌落外缘取一个5mm的菌饼，菌丝面朝下，接种在培养基的中央。
[0107]
(5)培养基在黑暗，28℃条件下培养。
[0108]
(6)每隔3h或6h拍照记录并测量菌落直径。
[0109]
(7)根据直径的测量结果计算生长抑制率。生长抑制率计算公式如下：i％＝[(c
‑
d)
‑
(t
‑
d)]/(c
‑
d)
×
100％，其中，c为对照菌落的直径。d为菌饼直径(5mm)，t为非传统肽处理的菌落直径。
[0110]
1.2.6菌丝形态的研究
[0111]
(1)pda培养基121℃，高压灭菌21min后，冷却至60℃。
[0112]
(2)然后与肽溶液混合配置成肽终浓度为100μμ的混合液，用无菌水代替肽溶液作为对照。
[0113]
(3)充分混匀后倒入30mm的无菌培养皿中。
[0114]
(4)待培养基凝固后，从培养四天的真菌菌落外缘取一个5mm的菌饼，菌丝面朝下，接种在培养基的中央。
[0115]
(5)培养基在黑暗，28℃条件下培养。
[0116]
(6)接种后36h用普通光学显微镜观察菌丝形态。
[0117]
2 结果分析
[0118]
2.1 肽的合成与质谱鉴定
[0119]
肽kc
‑
19，通过质谱分析发现肽的结构和分子量都与预期一致(图2)，进一步利用
高效液相色谱对合成的肽进行纯度分析发现，合成的肽的纯度>90％(图3)，满足要求，可以用于后续实验。
[0120]
2.2肽kc
‑
19的广谱抗真菌活性
[0121]
肽kc
‑
19对玉米生平脐蠕孢菌、新月弯孢菌和禾谷镰刀菌均具有抗菌活性。
[0122]
2.2.1肽kc
‑
19对玉米生平脐蠕孢菌的抗性
[0123]
玉米生平脐蠕孢菌分别在含肽kc
‑
19的培养基上和对照培养基(不含肽)上生长，在0hpi，6hpi，9hpi，12hpi，15hpi，18hpi，21hpi，24hpi，27hpi，30hpi，33hpi，36hpi对菌落进行观察，发现随着时间的推移，虽然菌落都在扩展生长，但是在肽kc
‑
19培养基上的生长速度明显小于对照(图4)。
[0124]
进一步观察生长抑制率发现，其抑制率在6.9％～47.0％之间，在33hpi达到最高抑制率(图5)。这些结果表明，肽kc
‑
19对玉米生平脐蠕孢菌具有抗菌活性。
[0125]
最后，为了研究肽kc
‑
19的抗菌活性作用方式，在肽kc
‑
19处理36h后，用普通光学显微镜观察玉米生平脐蠕孢菌菌丝，发现对照菌丝稀疏，肽kc
‑
19处理后可引起玉米生平脐蠕孢菌菌丝聚集，表明肽kc
‑
19通过引起菌丝聚集抑制菌丝生长和向外扩展(图6)。
[0126]
2.2.2肽kc
‑
19对新月弯孢菌的抗性
[0127]
新月弯孢菌分别在含肽kc
‑
19的培养基上和对照培养基(不含肽)上生长，在0hpi，9hpi，12hpi，15hpi，18hpi，21hpi，24hpi，27hpi，30hpi，33hpi，36hpi对菌落进行观察，发现随着时间的推移，虽然菌落都在扩展生长，但是在肽kc
‑
19培养基上的生长速度明显小于对照(图7)。
[0128]
进一步观察生长抑制率发现，其抑制率在23.8％～47.8％之间，在9hpi达到最高抑制率(图8)。这些结果表明，肽kc
‑
19对玉米生平脐蠕孢菌具有抗菌活性。
[0129]
最后，为了研究肽kc
‑
19的抗菌活性作用方式，在肽kc
‑
19处理36h后，用普通光学显微镜观察新月弯孢菌菌丝，发现对照菌丝稀疏，肽kc
‑
19处理后可引起新月弯孢菌菌丝聚集，表明肽kc
‑
19通过引起菌丝聚集抑制菌丝生长和向外扩展(图9)。
[0130]
2.2.3肽kc
‑
19对禾谷镰刀菌的抗性
[0131]
禾谷镰刀菌分别在含肽kc
‑
19的培养基上和对照培养基(不含肽)上生长，在0hpi，6hpi，12hpi，18hpi，24hpi，30hpi，36hpi，42hpi，48hpi，54hpi，60hpi对菌落进行观察，发现随着时间的推移，虽然菌落都在扩展生长，但是在肽kc
‑
19培养基上的生长速度明显小于对照(图10)。
[0132]
进一步观察生长抑制率发现，其抑制率在8.8％～25.1％之间，在24hpi达到最高抑制率(图11)。这些结果表明，肽kc
‑
19对禾谷镰刀菌具有抗菌活性。
[0133]
最后，为了研究肽kc
‑
19的抗菌活性作用方式，在肽kc
‑
19处理36h后，用普通光学显微镜观察禾谷镰刀菌菌丝，发现对照菌丝稀疏，肽kc
‑
19处理后可引起禾谷镰刀菌菌丝聚集，表明肽kc
‑
19通过引起菌丝聚集抑制菌丝生长和向外扩展(图12)。
[0134]
上述肽kc
‑
19的广谱抗真菌活性实验表明，肽kc
‑
19主要是通过菌丝聚集从而达到对真菌的抑制作用。
[0135]
按照kc
‑
19体外抗菌实验的浓度，取kc
‑
19溶解到水中，配置成摩尔浓度为100μm的肽溶液。利用pda培养基培养新月弯孢菌，用水冲洗孢子配置成浓度为1
×
106的孢子悬浮液，对玉米叶片进行喷涂，24小时后在叶片喷洒肽溶液，同时以等量的无菌水为对照组，进
行同样的喷涂。每天观察玉米叶片的发病情况，发现肽处理后玉米叶片的病斑面积显著小于对照叶片的病斑面积。