一种高密度发酵制备司美鲁肽前体的方法与流程

1.本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一种表达司美鲁肽前体的重组工程菌的高密度发酵方法。


背景技术：

2.随着社会经济的发展，人民生活水平逐步提高，人们的饮食结构发生了巨大变化，也导致肥胖发生率增加，并进一步导致糖尿病患者人数的急剧增加。据统计数据显示，我国糖尿病患者人数超过1亿，同时还有超过1.5亿的隐形糖尿病前期患者。糖尿病已经成为第三大慢性疾病。
3.糖尿病是由遗传和环境因素长期相互作用导致的复杂的慢性代谢性疾病，是由于胰岛素分泌缺乏导致，以高血糖为特征的疾病，分为i型糖尿病和ii型糖尿病。其中，ii型糖尿病（t2dm）在我国糖尿病患者中占到了95%以上的比例。
4.近年来，胰高血糖素样肽
‑
1(glucagon
‑
likepeptide
‑
1，glp
‑
1)受体激动剂(glp
‑
1ras)逐渐成为治疗t2dm的研究热点。glp
‑
1通过葡萄糖依赖的方式促进胰岛素的合成和分泌，发挥降糖作用。其不仅具有优异的降糖效果，还有控制体重、调节血脂、改善胰岛β细胞功能等特点，其低血糖等的不良反应率也明显小于其他治疗糖尿病的药物。目前，市场上用于治疗糖尿病的glp
‑
1药物主要有艾塞那肽、阿必鲁肽、度拉糖肽、利拉鲁肽和司美鲁肽（又名索玛鲁肽，semaglutide）。
5.司美鲁肽(semaglutide)是由丹麦诺和诺德公司研制的一种新一代glp
‑
1类似物，是一种长效glp
‑
1制剂（周制剂）。司美鲁肽与人glp
‑
1同源性较高，其以天然人glp
‑
1（7
‑
37）分子为基础，通过替换第8位氨基酸（丙氨酸替换为α
‑
氨基丁酸）和第34位氨基酸（赖氨酸替换为精氨酸），同时在第26位赖氨酸通过间隔基连接c18脂肪二酸侧链得到。司美鲁肽通过上述结构调整，实现了可抵抗二肽基肽酶4降解，并与白蛋白结合而延长体内半衰期，实现一周给药一次的长效效果。目前，诺和诺德也已经推出了司美鲁肽的口服制剂，并且，除了治疗糖尿病外，fda已批准司美鲁肽用于减肥适应症。
6.目前，对于司美鲁肽的研究主要集中在其重组工程菌构建、蛋白纯化及制剂方面，对于如何提高司美鲁肽重组工程菌发酵密度、显著提高其表达量的研究鲜有涉及。
7.高密度发酵是指微生物在液体培养基中密度超过常规10倍以上进行生长发酵的技术，现代高密度发酵主要是在基因工程菌（主要是大肠杆菌）生产多肽类药物的实践中逐步发展起来的。提高菌体发酵培养密度，不仅可以减少培养容器体系、培养基的消耗和下游工艺（如分离、纯化等）的效率，还可以缩短生产周期、减少设备投入和增大产能、降低成本，具有重要的工业应用价值。
8.专利cn111763704a提供了一种提高司美鲁肽及其前体生产菌株发酵密度以提高产量的方法，该专利通过设计新的基础培养基和补料培养基，并通过在发酵过程中添加特定全氟化碳乳液实现高密度发酵方法，并最终将产量提高到12.5μg/ml。但该方法需要用到多种特定成分，且发酵表达量仍有待提高。
9.为此，本发明针前期构建的表达司美鲁肽前体的重组大肠杆菌工程菌，提供一种高密度发酵方法，极大的提高了菌体发酵密度，提高了目的蛋白表达量，具有良好的产业应用前景。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于提供一种新的稳定高表达司美鲁肽前体的重组工程菌及其高密度发酵方法，本发明的构建方法能够显著提高重组工程菌的发酵密度和目的蛋白包涵体及目的蛋白的表达量。
11.司美鲁肽结构如下所示：由于上述司美鲁肽结构中，其末端序列的二肽为his
‑
aib（aib为非天然氨基酸），其无法通过直接发酵表达得到，因此，通常采用构建表达司美鲁肽的除上述二肽外的多肽片段（司美鲁肽前体）的重组工程菌，在通过发酵获得所述司美鲁肽前体后与上述二肽合成得到完整司美鲁肽的肽序列，并通过在上述肽序列的第26位赖氨酸通过间隔基连接c18脂肪二酸侧链得到司美鲁肽原料。
12.为实现本发明的目的，本发明首先提供一种能够用于高密度发酵的表达司美鲁肽前体的重组工程菌，所述工程菌按照如下方法构建：（1）合成如seq id no.1或seq id no.2所示的融合多肽编码基因；（2）将上述编码基因连接至表达载体中，构建得到含编码基因的重组表达载体；（3）将构建的重组表达载体转化至大肠杆菌中，得到所述重组工程菌。
13.优选地，步骤（2）具体方法为：将上述编码基因序列的5’端添加ndei酶切位点，3’端添加终止密码子以及xhoi酶切位点，然后通过酶切克隆到表达载体pet
‑
30a( )的ndei和xhoi酶切位点之间，从而构建得到重组表达载体pet
‑
30a( )
‑
a1
‑ꢀ
glp
‑
1或pet
‑
30a( )
‑
a2
‑ꢀ
glp
‑
1。
14.进一步优选地，步骤（3）的具体方法为：将重组表达载体pet
‑
30a( )
‑
a1
‑ꢀ
glp
‑
1或pet
‑
30a( )
‑
a2
‑ꢀ
glp
‑
1通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主bl21(de3)中，筛选得到所述重组工程菌。
15.针对上述方法构建的重组工程菌，本发明进一步提供一种所述重组工程菌的高密度发酵方法。本发明的方法通过在发酵培养基中提高mg
2
量，显著提高重组工程菌诱导od
600
值，并通过诱导后的低温发酵表达，从而实现整个发酵菌体密度和产量的显著提升。
16.因此，本发明提供的高密度发酵方法具体包括如下步骤：
（1）溶液配制a．氨水配制纯化水中经灭菌后，无菌条件下加入等体积氨水混匀待用；所述灭菌优选过滤灭菌、高温灭菌，更优选121 ℃灭菌30 min处理。
17.b．活化培养基活化培养基组成为胰蛋白胨18
‑
23g/l，酵母浸粉8
‑
12 g/l，氯化钠8
‑
12 g/l，灭菌处理。
18.优选地，所述活化培养基组成为胰蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l，氯化钠10g/l优选121 ℃灭菌30 min处理。
19.c．溶液d配制溶液d组成为七水合硫酸亚铁1
‑
5 g/l，七水合硫酸锌0.2
‑
2 g/l，一水合硫酸锰0.1
‑
1 g/l，四水合钼酸铵0.01
‑
0.6 g/l，五水合硫酸铜(ii) 0.02
‑
0.5g/l，磷酸45
‑
50ml/l，灭菌处理。
20.优选地，所述溶液d组成为七水合硫酸亚铁2
‑
4 g/l，七水合硫酸锌0.5
‑
1g/l，一水合硫酸锰0.3
‑
0.6g/l，四水合钼酸铵0.1
‑
0.2g/l，五水合硫酸铜(ii) 0.05
‑
0.15g/l，磷酸45
‑
50ml/l；更优选地，所述溶液d组成为七水合硫酸亚铁3.36g/l，七水合硫酸锌0.84g/l，一水合硫酸锰0.51g/l，四水合钼酸铵0. 18g/l，五水合硫酸铜(ii) 0.12g/l，磷酸48ml/l。所述灭菌可以为过滤除菌等灭菌方式，优选0.22μm滤器过滤除菌。
21.d．补料培养基30
‑
50%的葡萄糖和5
‑
25%的酵母浸粉，所述葡萄糖和酵母浸粉具体的浓度、补加速度和补加量根据菌株生长情况确定。
22.e．发酵培养基发酵培养基组成为酵母浸粉3
‑
18g/l，一水合柠檬酸0.5
‑
3g/l，硫酸铵3
‑
15g/l，磷酸二氢钾5
‑
12 g/l，无水氯化钙0.001
‑
0.01 g/l，七水合硫酸亚铁0.02
‑
0.1g/l，葡萄糖8
‑
12 g/l，硫酸镁5
‑
15g/l，溶液d 800
‑
1200μl/l，灭菌处理。
23.优选地，所述培养基组成为酵母浸粉10g/l，一水合柠檬酸1g/l，硫酸铵5g/l，磷酸二氢钾6g/l，无水氯化钙0.002g/l，七水合硫酸亚铁0.05g/l，葡萄糖10.67g/l，硫酸镁12g/l，溶液d 1000μl/l；所述灭菌优选高温灭菌，更优选为121 ℃灭菌30 min。
24.（2）菌种活化一级菌种活化：取冻存重组工程菌，以1:800
‑
1200的比例接种至活化培养基，恒温振荡培养，培养温度37.0
±
1.0℃，转速为180
‑
240rpm，培养时间12 ~ 16 h，得到一级活化种子培养液；二级菌种活化：将培养好的一级活化种子培养液以1:3
‑
6的比例接种至活化培养基中，恒温振荡培养，培养温度37.0
±
1.0℃，转速为180
‑
240rpm，培养时间2
‑
4h；得到二级活化种子培养液；（3）发酵培养活化菌种接种：将发酵培养基用氨水调节ph至6.7
‑
7.0后，将二级活化种子培养液以1:8
‑
12的比例加入到发酵培养基中，开始发酵；
至a1
‑
glp
‑1‑
8和a2
‑
glp
‑1‑
1至a2
‑
glp
‑1‑
8，置于甘油中保存。
30.经测序，本实施例中得到的基因工程菌中的序列与所设计的序列一致。
31.实施例2：重组大肠杆菌工程菌的高密度发酵（低mg
2
浓度和低od
600
诱导值）（1）溶液配制a．氨水配制取300 ml纯化水于补料瓶中，经121 ℃灭菌30 min后，无菌条件下将等体积氨水加入该补料瓶中混匀待用。
32.b．活化培养基活化培养基组成为胰蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l，氯化钠10g/l；121 ℃灭菌30 min。
33.c．溶液d配制溶液d组成为七水合硫酸亚铁3.36g/l，七水合硫酸锌0.84g/l，一水合硫酸锰0.51g/l，四水合钼酸铵0. 18g/l，五水合硫酸铜(ii) 0.12g/l，磷酸48ml/l；0.22μm滤器过滤除菌。
34.d．补料培养基30
‑
50%的葡萄糖和5
‑
25%的酵母浸粉，所述葡萄糖和酵母浸粉具体的浓度、补加速度和补加量根据菌株生长情况确定。
35.e．发酵培养基发酵培养基组成为酵母浸粉10g/l，一水合柠檬酸1g/l，硫酸铵5g/l，磷酸二氢钾6g/l，无水氯化钙0.002g/l，七水合硫酸铁0.05/l，葡萄糖10.67g/l，硫酸镁0.24g/l，溶液d 1000μl/l； 121 ℃灭菌30 min。
36.（2）菌种活化一级菌种活化：取实施例1中构建保存的相应重组工程菌50 μl接入到装有50 ml活化培养基的250ml三角瓶中，于恒温振荡器中培养，培养温度37.0
±
1.0℃，转速为220
±
10rpm，培养时间12 ~ 16 h，至od
600
值至4.0
‑
8.0，得一级活化种子培养液；二级菌种活化：将培养好的一级活化种子培养液40 ml接入到装有200 ml活化培养基的1000 ml三角瓶中，于恒温振荡器中培养，培养温度37.0
±
1.0℃，转速为220
±
10rpm，培养时间2
‑
5h，至od
600
值至3.0
ꢀ‑ꢀ
4.0；得二级活化种子培养液；（3）发酵培养活化菌种接种：将0.8l发酵培养基加入2l发酵罐中，用氨水调节ph至6.8后，将二级活化种子培养液80ml加入到发酵培养基中，开始发酵；发酵条件初始设定：温度37.0
±
1.0℃，空气流量500ml/min，氧气设置0ml/min，转速设置400rpm；发酵过程控制：发酵过程中通过控制转速和通入纯氧速度控制溶氧范围在15% ~ 30%，当od
600
值升至90时，加入1.0mm的iptg诱导，诱导后20min左右温度降至30
±
1.0℃，诱导培养至稳定期；发酵过程中，当底糖耗尽时开始流加补料培养基。
37.（4）发酵过程中样品检测吸光度检测：补料开始后每2 h取样使用紫外分光光度计检测发酵液od
600
值并记录，在添加诱导剂之前取样作为蛋白检测空白对照，并绘制生长曲线。
38.实施例3：重组大肠杆菌工程菌的高密度发酵（1）溶液配制a．氨水配制取300 ml纯化水于补料瓶中，经121 ℃灭菌30 min后，无菌条件下将等体积氨水加入该补料瓶中混匀待用。
39.b．活化培养基培养基组成为胰蛋白胨20g/l，酵母浸粉10g/l，氯化钠10g/l；121 ℃灭菌30 min。
40.c．溶液d配制溶液d组成为七水合硫酸亚铁3.36g/l，七水合硫酸锌0.84g/l，一水合硫酸锰0.51g/l，四水合钼酸铵0. 18g/l，五水合硫酸铜(ii) 0.12g/l，磷酸48ml/l；0.22μm滤器过滤除菌。
41.d．补料培养基30
‑
50%的葡萄糖和5
‑
25%的酵母浸膏，所述葡萄糖和酵母浸膏具体的浓度、补加速度和补加量根据菌株生长情况确定。
42.e．发酵培养基发酵培养基组成为酵母浸粉10g/l，一水合柠檬酸1g/l，硫酸铵5g/l，磷酸二氢钾6g/l，无水氯化钙0.002g/l，七水合硫酸铁0.05/l，葡萄糖10.67g/l，硫酸镁12g/l，溶液d 1000μl/l；121 ℃灭菌30 min。
43.（2）菌种活化一级菌种活化：取实施例1中构建保存的相应重组工程菌50 μl接入到装有50 ml活化培养基的250ml三角瓶中，于恒温振荡器中培养，培养温度37.0
±
1.0℃，转速为220
±
10rpm，培养时间12 ~ 16 h，至od
600
值至4.0
‑
8.0，得一级活化种子培养液；二级菌种活化：将培养好的一级活化种子培养液40 ml接入到装有200 ml活化培养基的1000 ml三角瓶中，于恒温振荡器中培养，培养温度37.0
±
1.0℃，转速为220
±
10rpm，培养时间2
‑
5h，至od
600
值至3.0
ꢀ‑ꢀ
4.0；得二级活化种子培养液；（3）发酵培养活化菌种接种：将0.8l发酵培养基加入2l发酵罐中，用氨水调节ph至6.8后，将二级活化种子培养液80ml加入到发酵培养基中，开始发酵；发酵条件初始设定：温度37.0
±
1.0℃，空气流量500ml/min，氧气设置0ml/min，转速设置400rpm；发酵过程控制：发酵过程中通过控制转速和通入纯氧速度等控制溶氧范围在15% ~ 30%，当od
600
值升至160时，加入1.0mm的iptg诱导，诱导后20min左右温度降至30
±
1.0℃，诱导培养至稳定期；发酵过程中，当底糖耗尽时开始流加补料培养基。
44.（4）发酵过程中样品检测吸光度检测：补料开始后每2 h取样使用紫外分光光度计检测发酵液od
600
值并记录，在添加诱导剂之前取样作为蛋白检测空白对照，并绘制生长曲线。
45.实施例2与实施例3发酵方法结果比对分析为方便对比说明，以实施例中构建的重组工程菌a2
‑
glp
‑1‑
5的数据作为依据，进行比对分析，具体发酵结果如下下表1所示：
表1：重组工程菌a2
‑
glp
‑1‑
5发酵结果对比表本技术发明人意外发现，对于本发明构建的重组工程菌，在发明人制备的发酵培养基基础上，通过极大增加培养基中mg
2
浓度，可以显著提高重组工程菌进入对数生长期时的od
600
值，参见图1和图2。根据菌株生长曲线图可知，本发明方法可以将此进入对数生长期的od
600
值显著提高，因此，使得对菌株的诱导可以由90提升至160（实验结果证实，实施例1中构建筛选的16株重组工程菌，均可将其诱导od
600
值提升至150以上）。
46.进而，通过改变发酵培养基中mg
2
浓度和iptg诱导od
600
值，本发明的各株重组工程菌的最终发酵od
600
值达到了320以上，发酵菌体生物量提高至340g/l以上，尤其是蛋白表达量更是达到惊人的16g/l以上。对于实施例1中构建的重组工程菌，其使用实施例3中所述方法的目的蛋白表达量相对与实施例2，普遍提高了1倍左右。而以上述a2
‑
glp
‑1‑
5菌株结果为例，使用实施例3中的方法，其下罐od
600
提高46.3%，目的表达量更是提高了2.37倍。