牙鲆成熟树突状细胞标志分子CD83的特异性抗体制备方法与流程

牙鲆成熟树突状细胞标志分子cd83的特异性抗体制备方法
技术领域
1.本发明属于鱼类免疫学技术领域，具体涉及一种用于鉴定牙鲆成熟树突状细胞的特异性抗体，以及使用该抗体来鉴定牙鲆成熟树突状细胞的方法。


背景技术：

2.树突状细胞是专职的抗原递呈细胞，在组织中时以未成熟的形式存在，可以直接吞噬机体内的多种类型病原体，并在趋化因子等的作用下，在体内迁移到淋巴区，将抗原肽表达并运输到细胞表面，待t淋巴细胞进行识别，从而完成抗原递呈。鱼类是最早的具有获得性免疫的动物群体，具备发挥抗原加工和递呈功能所必需的分子机制，如mhc、tcr、bcr等。在斑马鱼中已通过分离培养单核细胞的方法获得树突状细胞，且培养获得的细胞树突状形态明显，可以引起混合淋巴细胞反应；对分离的树突状细胞进行klh和lps刺激后，cd83、mhcⅱ、cd80/86均出现上调表达。在虹鳟中，通过分离培养头肾单细胞的方法获得树突状细胞，细胞的形态特征与哺乳动物树突状细胞形态特征相符，具备吞噬、引起混合淋巴细胞反应及迁移等功能，对分离的树突状细胞进行poly i：c刺激后cd83、mhcⅱ的表达量均呈现上调表达。
3.由于缺乏树突状细胞标志分子的抗体，关于鱼类树突状细胞的鉴定方法目前大多还限于形态、功能以及标记分子的基因表达层面；即通过对细胞染色观察细胞形态、细胞核形状，判断其是否具备树突状细胞的形态特征；通过吞噬、迁移以及引起混合淋巴细胞反应的特性，判断其是否具备树突状细胞的功能特点。
4.但是，功能鉴定实验难免有细胞数量的要求，仅对体外培养的具有一定数量的树突状细胞有效，加重了操作的复杂性；而形态鉴定方法的检测结果并不够严谨。目前，t淋巴细胞的鉴定主要依赖于其表面特定表达的表面分子cd3/cd4/cd8等，而树突状细胞成熟状态下，特异性表达cd83。因此，以cd83分子为树突状细胞标志物，制备其特异性抗体，可使树突状细胞的鉴定更加高效和便利。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种用于鉴定牙鲆成熟树突状细胞的特异性抗体，以及使用该抗体来鉴定牙鲆成熟树突状细胞的方法；从而弥补现有技术的不足。
6.本发明首先提供一种用于鉴定牙鲆成熟树突状细胞的特异性抗体，是使用如下氨基酸序列的多肽作为抗原制备的；
7.gavmgtvmecvsgadcvvqcfaehvegvqyravrwyrvresssshls glltrrlpngtttyyygldrevelldeslslylpnvtcsdggvymchlaapl geqnrdgqvllilkdcpdgskekltidd(seq id no:1)；
8.所述的多肽，其编码基因的一种具体序列如下：
9.ggggcagtgatgggcactgtgatggaatgtgtctcaggagcagattgtgttgttca
10.gtgcttcgctgaacatgtggagggtgttcagtaccgagctgtgaggtggtacagggtca
11.gagagtcttcatcgtctcatctcagcggcctcctgacccgacgcctccccaacggcacg
12.acgacatactactatggtctggacagagaggtggagctgctggacgagtccctcagcct
13.ctacctgcccaacgtgacgtgcagcgatggcggcgtgtacatgtgtcacctggcagcac
14.ctttgggagagcagaacagggatgggcaggtcctcctcattctgaaagattgtcccgat
15.ggttccaaagaaaaactgaccatcgatgac(seq id no:2)。
16.更具体的是，所述的特异性抗体是使用多肽免疫兔后制备的；
17.本发明所提供的特异性抗体在制备检测树突状细胞的制品中的应用；
18.本发明再一个方面还提供一种检测牙鲆成熟树突状细胞的方法，是使用所述的特异性抗体来进行检测。
19.本发明筛选获得了能够制备特异性抗体的抗原表位，制备重组蛋白作为抗原来制备特异性抗体，制备抗体所提供的特异性抗体可以从标志分子层面对树突状细胞进行鉴定，为检测牙鲆树突状细胞提供了重要工具。
附图说明
20.图1为牙鲆cd83分子结构域预测图，其中a为smart结构域预测结果，b为三维立体模型；
21.图2为牙鲆cd83分子的二级结构分析图。
22.图3为牙鲆cd83分子的抗原表位参数分析图。
23.图4为牙鲆cd83分子的b细胞线性抗原表位预测图。
24.图5为cd83重组蛋白诱导表达及纯化的sds
‑
page结果图，其中条带m表示分子量标准蛋白；条带1表示未诱导的大肠杆菌总蛋白；条带2表示诱导后的大肠杆菌总蛋白；条带3表示纯化后的重组蛋白。
25.图6为elisa方法分析单克隆抗体对牙鲆cd83重组蛋白特异性结合效果表图。
26.图7为免疫印迹法分析多抗与cd83原核蛋白和真核蛋白的特异性结合反应图，其中a为抗体与重组蛋白反应结果，条带m表示分子量标准蛋白，条带1表示多抗与重组原核蛋白发生结合反应，条带2表示阴性对照；b为抗体与真核蛋白反应结果，条带m表示分子量标准蛋白，条带1表示多抗与真核蛋白发生结合反应，条带2表示阴性对照。
27.图8为间接免疫荧光法分析多抗与cd83真核蛋白的特异性结合反应图。
28.图9为间接免疫荧光法检测cd83

树突状细胞的结果图，其中a表示lps刺激之后的树突状细胞间接免疫荧光结果，b表示未经刺激的树突状细胞间接免疫荧光结果。
具体实施方式
29.申请人在研究中发现通过牙鲆cd83分子制备特异性抗体，可以从标志分子的蛋白表达层面鉴定牙鲆树突状细胞，使鉴定手段更加简便，结果也更加明确。但由于cd83分子序列中不同区域的抗原特性不同，并不是cd83分子序列所有的抗原区域制备出的抗体都能有效的检测树突状细胞。因此，本发明从cd83分子的序列出发，经过生物信息学分析筛选得到抗原性强且易于被抗体识别的氨基酸序列；以此序列的原核表达蛋白作为抗原获得的抗体特异性良好，将为牙鲆成熟树突状细胞的鉴定提供一种新的方法。
30.下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明。
31.实施例1：cd83分子抗原目的片段的筛选
32.(1)通过扩增获得了牙鲆cd83氨基酸序列，运用smart软件对牙鲆cd83的结构特点进行分析。结果显示，牙鲆cd83的跨膜区在152～174位区域，其中1～151位区域显示为胞外区，175～222位区域为胞内区，胞外区有1个ig样结构域(图1a)。
33.(2)利用sopma server对牙鲆cd83的二级结构进行预测。结果显示，牙鲆cd83基因中柔性结构占氨基酸总数的46.4％，其中无规则卷曲占38.74％，β
‑
转角为7.66％。α
‑
螺旋和延伸链即β
‑
折叠分别占30.18％和23.24％，各种结构在牙鲆cd83氨基酸序列中的分布情况见图2。
34.(3)采用dnastar软件对牙鲆cd83分子抗原表位参数进行分析，参数主要包括亲水性(hydrophilicity plot
‑
kyte
‑
doolittle)、柔韧性(flexible regions
‑
karplus
‑
schulz)、抗原性(antigenic index
‑
jameson
‑
wolf)和表面可及性(surface probability plot
‑
emini)。
35.采用iedb在线预测软件，结合dnastar软件分析结果，对牙鲆cd83分子抗原表位进一步预测，预测出可能的b细胞线性表位；
36.从图3中可以看出牙鲆cd83分子抗原表位可能存在的位置大多位于序列为seq id no:1的区域。而图4所示的b细胞线性表位也分步在该区域。
37.实施例2：cd83目的片段抗原的制备及多抗的研制
38.一、抗原的制备
39.(1)利用pcr扩增所筛选的编码抗原表位(氨基酸序列为seq id no:1)的编码基因(核苷酸序列为seq id no:1)，构建pet
‑
32a
‑
cd83原核表达载体，转化至bl21感受态细胞中。
40.(2)加入iptg进行诱导表达，利用his标签层析柱对诱导蛋白进行纯化(图5)，并作为抗原使用。
41.二、免疫
42.(1)将重组蛋白的浓度调整为2mg/ml，取1.5ml重组蛋白与等量弗氏完全佐剂充分乳化，采取皮下六点注射法进行免疫接种，每点的注射剂量100μl。
43.(2)两周后，对新西兰大白兔进行初次加强免疫。以弗氏不完全佐剂代替完全佐剂，并采用与步骤(1)相同的方法进行免疫注射。
44.(3)一周后，采用耳缘静脉注射的方式，将cd83重组蛋白悬液(不混佐剂)进行耳缘静脉注射，注射剂量为600μl。
45.(4)一周后重复步骤(3)。
46.(5)最后一次免疫后，间隔一周，进行心脏采血。将采集的血液，于室温下倾斜静置2h，4℃冰箱中过夜。次日，将离心管在4℃、8000g条件下离心10min，小心吸取上清作为特异性抗体。
47.实施例3：多抗的间接酶联免疫法鉴定
48.(1)取cd83重组蛋白悬液，用无菌pbs将其浓度稀释为50μg/ml，加入到酶标板中，每孔加入100μl。每组设置三个重复，在4℃条件下包被过夜。
49.(2)次日，甩出孔内液体，用排枪向每个孔内加入200μl pbst(含0.5％tween
‑
20的pbs溶液)，浸洗5min，重复浸洗三次。
50.(3)浸洗完毕后，向每孔加入200μl浓度为5％的bsa，放入37℃恒温箱中封闭1.5h，
而后甩干酶标板中的bsa溶液，浸洗三次。
51.(4)一抗孵育：将制备的兔抗牙鲆cd83特异性抗体，进行梯度稀释(800，1600，3200，6400，12800，25600，51200，1
×
105，2
×
105倍)，用移液枪分别加到酶标板内，每孔100μl，每个梯度重复滴加三个孔。同时，用未免疫的兔阴性血清作为对照组，重复滴加三个孔。随后，37℃孵育1.5h，而后浸洗三次。
52.(5)二抗孵育：取ap标记的羊抗兔igg抗体作为二抗，参照说明书稀释，每孔加入100μl，放入37℃恒温箱中孵育1h，而后浸洗三次。
53.(6)发色：取10ml发色缓冲液，加入10mg pnpp
‑
na粉末，避光充分混匀，向每个孔内每孔加入200μl，在避光条件下，孵育5min。
54.(7)读数：将酶标板放入酶标仪内，读取405nm波长下各孔的od值，以p/n>2为阳性判定标准。
55.结果显示，当制备的抗体以1
×
105倍数稀释时，检测的od值为0.1741，高于阴性对照组od值的2倍；而当抗体以2
×
105倍数稀释时，od值为0.1402，低于阴性对照od值的两倍。因此，制备的兔抗牙鲆cd83特异性抗体效价可达1：100000(图6)。
56.实施例4：多抗的免疫印迹法鉴定
57.(1)重组原核蛋白western
‑
blot
58.①
将纯化的cd83重组蛋白，进行sds
‑
page，而后将跑好的凝胶浸泡在转移buffer里。用直尺测量分离胶的长度的宽度，按照相同规格，剪下同样大小的pvdf膜，放入倒有甲醇的培养皿中，用镊子将pvdf膜轻轻按压到液面一下，充分浸润30s。然后，将其放于超纯水中，浸泡2min。最后，转移到电转移缓冲液中。
59.②
将三层滤纸和海绵垫，充分浸泡在缓冲液中，排出气泡，安装夹子。
60.③
将安装固定好的夹子置于电转移槽中，黑色面与正极相对，红色面与负极相对，向中倒入缓冲液至夹子全部浸没，进行蛋白转膜，转膜条件设定条件设置为为30v，2h。
61.④
转膜结束后取出pvdf膜，若在膜上可看到预染的彩虹marker，则证明蛋白转移成功。可弃去凝胶，用平头镊子将pvdf膜取出，小心剪下蛋白marker和各泳道pvdf膜。
62.⑤
bsa封闭：将pvdf膜置于5％的bsa溶液中封闭过夜。
63.⑥
次日，用pbst将pvdf膜反复浸洗三次，每次5min。
64.⑦
孵育一抗：取制备的兔抗牙鲆cd83特异性抗体、未免疫的兔血清(对照)以1：5000的比例进行稀释，分别倒入干净的培养皿中，将pvdf膜浸没其中，在37℃恒温箱中孵育1.5h，而后浸洗三次。
65.⑧
孵育二抗：二抗为ap标记的羊抗兔igg抗体，在37℃孵育1h，pbst将浸洗三次，每次5min。
66.⑨
发色：将配制好的发色液倒入发色缸中，用平头镊子将浸洗好的pvdf膜放入其中发色。发完色后将其与marker条带拼接观察。
67.(2)真核蛋白western
‑
blot
68.①
将ptag
‑
rfp
‑
cd83重组真核质粒转染至hinae细胞系，在荧光显微镜下观察转染情况。
69.②
待视野中的红色荧光强度较强时，胰酶消化细胞。首先，在680g条件下，离心5min。其次，用1ml pbs将细胞重悬，再次离心5min，清洗细胞。
70.③
用500μl pbs重悬细胞，加入ripa和pmsf，冰上30min，4℃，12000g离心5min吸上清。
71.④
将裂解后的蛋白悬液参照3.2.3(2)中操作进行western
‑
blot，发色后观察发色结果。
72.结果：制备的兔抗cd83特异性抗体分别可以在33kda处(图7a)和52kda处(图7b)发出单一条带，与cd83重组原核蛋白和真核蛋白的预期大小相符，而阴性兔血清对照组则均未发出条带，表明制备的抗体特异性良好。
73.实施例5:多抗的间接免疫荧光方法鉴定
74.(1)将ptag
‑
rfp
‑
cd83质粒和ptag
‑
rfp分别转染至hinae细胞系并收集。其次，调整细胞浓度为6x106/ml。
75.(2)在湿盒中摆放粘附载玻片，将细胞悬液滴到粘附载玻片上，盖上盖子，在室温下沉降2h。
76.(3)2h后，轻轻地磕掉载玻片上的液体，滴加4％多聚甲醛，将细胞固定15min。然后，用pbst清洗5min，晾干备用。
77.(4)bsa封闭：将5％bsa滴加到载玻片上。然后，将湿盒放入37℃恒温箱中，封闭1.5h。封闭完成后，将粘附载玻片放入清洗盒中，用pbst清洗三次，每次清洗5min。
78.(5)孵育一抗：取制备的兔抗牙鲆cd83特异性抗体、阴性兔血清以1：1000的比例进行稀释。将稀释好的一抗滴加到载玻片上，向一组转染重组质粒的细胞上滴加cd83兔血清，向另一组转染重组质粒的细胞上滴加阴性血清；向转染空载质粒的细胞上滴加cd83的血清。然后，将湿盒放入37℃恒温箱中，孵育1.5h。一抗孵育完成后，将粘附载玻片放入清洗盒中，用pbst清洗三次，每次清洗5min。
79.(6)孵育二抗：取488标记的羊抗兔igg抗体作为二抗，参照说明书进行稀释，滴加到载玻片上，放入37℃恒温箱中继续孵育1h。二抗孵育结束后，将粘附载玻片放入清洗盒中，用pbst清洗三次，每次清洗5min。
80.(5)孵育dapi：按照说明书，将dapi进行稀释，滴加到载玻片上，室温下孵育15min。随后，用pbst清洗三次。孵育结束后，将粘附载玻片放入清洗盒中，用pbst清洗三次，每次清洗5min。
81.(6)用甩干机将载玻片甩干，在细胞上滴加一滴米粒大小的甘油，缓缓放上盖玻片，进行封片，在荧光显微镜下进行观察。
82.结果：制备的cd83多抗可以结合转染ptag
‑
rfp
‑
cd83真核质粒的细胞，无法结合转染ptag
‑
rfp空质粒的细胞，而阴性血清无法结合转染ptag
‑
rfp
‑
cd83真核质粒的细胞(图8)。由此表明，制备的cd83特异性抗体特异性良好，可以用于后续实验。
83.实施例6：多抗在检测树突状细胞中的应用
84.(1)取牙鲆头肾树突状细胞，在生物安全柜中将细胞浓度调整为5x106/ml，滴加到24孔板中。将细胞分为实验组和对照组，每组设置三个复孔。向实验组中每孔加入1mg/ml的lps溶液10μl，向对照组细胞中加入等量的pbs溶液，用移液枪上下吹吸几次，将lps和细胞培养液充分混匀。然后，放入20℃培养箱中，培养24h。
85.(2)将实验组和对照组的树突状细胞进行滴片沉降和固定，放入湿盒中，向其上滴加5％bsa溶液。然后，将湿盒放入37℃恒温箱中，封闭1.5h。将制备的兔抗牙鲆cd83特异性
抗体、未免疫的兔血清(对照)，以1：500的比例进行稀释，分别滴加到两张载玻片上。然后，将湿盒放入37℃恒温箱中，孵育1.5h。一抗孵育完成后，将粘附载玻片放入清洗盒中，用pbst清洗三次，每次清洗5min。取cy3标记的羊抗兔igg抗体作为二抗，参照说明书进行稀释，并分别滴加到两张载玻片上。然后，将湿盒放入37℃恒温箱中，继续孵育1h。二抗孵育完成后，将粘附载玻片放入清洗盒中，用pbst清洗三次，每次清洗5min。按照说明书，将dapi进行稀释，分别滴加到两张载玻片上，在室温下孵育15min。随后，将粘附载玻片放入清洗盒中，用pbst清洗三次，每次清洗5min。用甩干机将片子甩干，并用甘油封片，在荧光显微镜下进行观察。
86.结果：可以利用制备的抗体在lps刺激组的树突状细胞中检测到cd83阳性细胞，而未刺激组则没有检测到明显的阳性信号(图9)。
87.本领域的普通技术人员都会理解，在本发明的保护范围内，对于上述实施例进行修改，添加和替换都是可能的，其都没有超出本发明请求保护的范围。