一种能够溶血栓和靶向吞噬癌细胞的微生物的制作方法

1.本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种能够溶血栓和靶向吞噬癌细胞的微生物。


背景技术：

2.血栓形成是由一组遗传和环境因素相互作用、相互影响的多因素变化过程。临床常见的血栓患者，最主要的特点有家族遗传性，反复发作性，症状严重性，血栓形成部位异常性，以及发病时间年轻化。细胞坏死指的是长期以来被认为是因病理而产生的被动死亡，如物理性或化学性的损害因子及缺氧与营养不良等均导致细胞坏死。坏死细胞的膜通透性增高，致使细胞肿胀，细胞器变形或肿大，早期核无明显形态学变化，最后细胞破裂。细胞裂解要释放出内含物，并常引起炎症反应；在愈合过程中常伴随组织器官的纤维化，形成瘢痕。
3.而现有技术没有将微生物的代谢产物用于治疗血栓，且没有将微生物本身用于靶向吞噬癌细胞。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术存在的上述问题，本发明目的在于提供一种能够溶血栓和靶向吞噬癌细胞的微生物。
5.本发明所采用的技术方案为：一种能溶血栓和靶向吞噬癌细胞的微生物的培养方法，包括以下步骤：
6.s1：微生物活化：将微生物接到含有200ml lb斜面培养基的500ml培养器内，培养器放置于恒温箱内培养，恒温箱设定温度为33～38℃，培养时间为20～28小时；
7.s2：种子液制备：将活化的微生物，用接种环接种到含有200mllb种子培养基的500ml培养器中，培养器放置于恒温摇床内培养，恒温摇床的设定温度为33～38℃，转速为180～220转/分钟，培养时间为15～23小时；
8.s3：发酵液制备：种子液以发酵液体积4％的接种量接种到含有75ml液体发酵培养基的250ml培养器中，培养器放置于恒温摇床内培养，恒温发酵温度为33～38℃，发酵时间为45～50小时，ph值为7.0，恒温摇床转速为150～190转/分钟，接种龄为10～14小时。
9.其中，所述lb斜面培养基中蛋白胨的含量为2.2～2.8g，琼脂粉的含量为3.8～4.2g，nacl的含量为0.8～1.2g，蒸馏水200ml，ph值为6.8～7.2。
10.其中，所述种子培养基中葡萄糖0.8～1.2g，蛋白胨1.8～2.2g，nacl 0.8～1.2g，牛肉膏0.5～0.7g，蒸馏水200ml，ph值为6.8～7.2。
11.其中，所述液体发酵培养基可溶性淀粉含量为1.5％，酵母膏含量为0.7％，磷酸二氢钾含量为0.3％，磷酸氢二钠含量为0.2％，cacl2含量为0.02％，mgso4含量为0.03％，feso4含量为0.04％。
12.一种能溶血栓和靶向吞噬癌细胞的微生物的应用方法，
13.将发酵完成后的发酵液在高速冷冻离心机内离心，取上清液，逐滴向上清液滴入8～12％的hcl，直到ph值为2时停止滴入，将上清液放置在3～5℃冰箱中静置22～26小时，取出上清液，继续用高速冷冻离心机离心，收集此次离心所得的沉淀并干燥，将所得干燥物在磁力搅拌机上用二氯甲烷萃取10～14小时，将所得液体过滤，滤液用旋转蒸发仪旋干，即得到含有靶向蛋白水解酶的干粉，将干粉收集，每1微克干粉使用10毫升注射用水溶解，并向溶液中添加增溶剂、潜溶剂、防腐剂、助悬剂和湿润剂，经灭菌、过滤和质量检查得到能够靶向吞噬癌细胞的微生物注射液。
14.其中，所述添加增溶剂、潜溶剂、防腐剂、助悬剂和湿润剂在注射液中的含量分别为0.01mg/10ml、0.05mg/10ml、0.001mg/10ml、0.011mg/10ml和0.008mg/10ml。
15.其中，将发酵完成后的发酵液在高速冷冻离心机内离心，取上清液，继续用高速冷冻离心机离心，收集此次离心所得的沉淀并干燥，将所得干燥物在磁力搅拌机上用二氯甲烷萃取10～14小时，将所得液体过滤，滤液用旋转蒸发仪旋干，得到含有微生物的干粉，将干粉收集，每1维克干粉与1克粉状填充剂混合，并向混合物中添加润湿剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂，经压制烘干制成能够溶血栓的微生物药片。
16.其中，所述润湿剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂在药片中的含量分别为0.005mg/1g、0.003mg/1g、0.003mg/1g和0.004mg/1g。
17.本发明的有益效果为：本发明提高了该微生物的培养效率，且发明了一种直接利用微生物生产能够溶血栓的药片，和直接利用微生物生产能够靶向吞噬癌细胞的注射液。
附图说明
18.图1是碳源od值和透明圈折线图；
19.图2是氮源od值和透明圈折线图；
20.图3是碳源和氮源比例图；
21.图4是磷酸二氢钾的od值和透明圈折线图；
22.图5是磷酸二氢钠的od值和透明圈折线图；
23.图6是磷酸氢二钾的od值和透明圈折线图；
24.图7是磷酸氢二钠的od值和透明圈折线图；
25.图8是不同浓度金属离子的透明圈图。
具体实施方式
26.为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处附图中描述和示出的本发明实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
27.在本发明实施例的描述中，需要理解的是，术语“上”、“前”、“后”、“左”、“右”、“底”、“侧面”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于
描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本实施例的限制。
28.在本发明实施例的描述中，还需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“设置”、“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以视具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
29.下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步阐述。
30.一种利用微生物生产溶血栓酶的方法，包括以下步骤：
31.实施例1
32.s1：微生物活化：将微生物接到含有200ml lb斜面培养基的500ml培养器内，培养器放置于恒温箱内培养，恒温箱设定温度为35℃，培养时间为24小时；
33.s2：种子液制备：将活化的微生物，用接种环接种到含有200mllb种子培养基的500ml培养器中，培养器放置于恒温摇床内培养，恒温摇床的设定温度为35℃，转速为200转/分钟，培养时间为19小时；
34.s3：发酵液制备：种子液以发酵液体积4％的接种量接种到含有75ml液体发酵培养基的250ml培养器中，培养器放置于恒温摇床内培养，恒温发酵温度为35℃，发酵时间为48小时，ph值为7.0，恒温摇床转速为170转/分钟，接种龄为12小时。
35.将发酵完成后的发酵液在高速冷冻离心机内离心，取上清液，继续用高速冷冻离心机离心，收集此次离心所得的沉淀并干燥，将所得干燥物在磁力搅拌机上用二氯甲烷萃取10～14小时，将所得液体过滤，滤液用旋转蒸发仪旋干，得到含有微生物的干粉，称量干粉重量为0.8g。
36.实施例2
37.s1：微生物活化：将微生物接到含有200ml lb斜面培养基的500ml培养器内，培养器放置于恒温箱内培养，恒温箱设定温度为33℃，培养时间为22小时；
38.s2：种子液制备：将活化的微生物，用接种环接种到含有200mllb种子培养基的500ml培养器中，培养器放置于恒温摇床内培养，恒温摇床的设定温度为33℃，转速为180转/分钟，培养时间为17小时；
39.s3：发酵液制备：种子液以发酵液体积4％的接种量接种到含有75ml液体发酵培养基的250ml培养器中，培养器放置于恒温摇床内培养，恒温发酵温度为33℃，发酵时间为44小时，ph值为7.0，恒温摇床转速为150转/分钟，接种龄为10小时。
40.将发酵完成后的发酵液在高速冷冻离心机内离心，取上清液，继续用高速冷冻离心机离心，收集此次离心所得的沉淀并干燥，将所得干燥物在磁力搅拌机上用二氯甲烷萃取10～14小时，将所得液体过滤，滤液用旋转蒸发仪旋干，得到含有微生物的干粉，称量干粉重量为0.75g。
41.实施例3
42.s1：微生物活化：将微生物接到含有200ml lb斜面培养基的500ml培养器内，培养器放置于恒温箱内培养，恒温箱设定温度为37℃，培养时间为26小时；
43.s2：种子液制备：将活化的微生物，用接种环接种到含有200mllb种子培养基的
500ml培养器中，培养器放置于恒温摇床内培养，恒温摇床的设定温度为37℃，转速为220转/分钟，培养时间为23小时；
44.s3：发酵液制备：种子液以发酵液体积4％的接种量接种到含有75ml液体发酵培养基的250ml培养器中，培养器放置于恒温摇床内培养，恒温发酵温度为37℃，发酵时间为50小时，ph值为7.0，恒温摇床转速为190转/分钟，接种龄为14小时。
45.将发酵完成后的发酵液在高速冷冻离心机内离心，取上清液，继续用高速冷冻离心机离心，收集此次离心所得的沉淀并干燥，将所得干燥物在磁力搅拌机上用二氯甲烷萃取10～14小时，将所得液体过滤，滤液用旋转蒸发仪旋干，得到含有微生物的干粉，称量干粉重量为0.6g。
46.碳源除了满足生物生长合成需要外，还能为细胞提供能量，在微生物的各种营养需求中，对碳的需要量最大。确定液体发酵培养基的碳源时，以蛋白胨为氮源，浓度为0.8～1.2％，分别以葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉和甘油作为碳源，添加的浓度为1.0％(wt/vol)配成液体培养基，33～38℃的恒温摇床，转速为150～190转/分钟恒温培养57～63小时。然后取各自的发酵液测定od值，并将培养液离心上清液滴定在猪血粉平板上，比较不同碳源对透明圈直径产生的影响，并确定碳源。
47.如图1所示，在所有碳源对溶血栓酶的影响中，可溶性淀粉活性最高，微生物生长量最好，所以培养基中加入可溶性淀粉，不仅很好的供微生物生长，而且还能促进产物的活性，故选择可溶性淀粉为最佳碳源。
48.微生物生长和产物合成需要氮源，氮源主要用于微生物细胞物质(氨基酸、蛋白质、核酸等)和含氮代谢物的合成。培养基中使用的氮源可分为两大类：有机氮源和无机氮源。常用的无机氮源包括各种铵盐、硝酸盐和氨水等。常用的有机氮源有花生饼粉、黄豆饼粉、棉子饼粉和蛋白胨等。以碳源为可溶性淀粉，浓度为1.0％(wt/vol)。分别以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏与黄豆粉为有机氮源；分别以氯化铵、硝酸铵、硫酸铵为无机氮源，以1.0％(wt/vol)的浓度添加到液体发酵培养基中，按碳源的方法来确定氮源。
49.如图2所示，在所有氮源对溶血栓酶的影响中，酵母膏活性最高，微生物生长量最好，所以培养基中加入酵母膏，不仅很好的供微生物生长，而且还能促进产物的活性，故选择酵母膏为最佳氮源。
50.得到的最佳碳源和氮源，各自以不同比例分别添加到液体培养基中，制成不同碳氮比的发酵培养基。然后去各自发酵液离心取上清液测定活性物质的透明圈大小，得出最佳碳氮比。
51.如图3所示，可知碳源、氮源浓度含量过高或过低都不利于活性物质的产生，而透明圈直径最大时为最佳，酵母膏含量0.7％，可溶性淀粉含量1.5％。
52.在最优碳氮比例的情况下，培养基中分别添加0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％的磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠，以空白液体培养基作为对照组，按碳源的方法培养，确定最佳磷酸盐。
53.如图4～7所示，实验证明当磷酸二氢钾的浓度为0.3％时，活性物质的排油直径最大，磷酸氢二钠浓度0.2％时，抗血活性物的透明圈直径最大。因此就选择磷酸二氢钾和磷酸氢二钠作为最佳磷酸盐。
54.有些金属离子对微生物的代谢必不可少，有的能促进产物的生成，有的则可抑制
产物的产量，以磷酸盐的结果为基础，将不同浓度的cacl2、mgso4、feso4、cuso4加入液体培养基中，按碳源的方法培养，确定最佳金属离子。
55.如图8所示，得出cacl2的浓度为0.02％时，mgso4的浓度为0.03％时，feso4的浓度为0.04％时为最佳浓度。
56.本发明在使用时，服用能够溶血栓的微生物药片，药片中的微生物在胃部活化，微生物代谢产生能够溶血栓的溶血栓酶，且溶血栓酶能够穿过胃壁进入血管，经血液循环到达血栓位置，溶血栓酶作用于血栓表面，分解消化血栓，达到溶血栓的目的。
57.注射能够靶向吞噬癌细胞的微生物注射液前，先向受靶部位注射标靶药物，待标靶药物完全扩散于受靶部位，肌肉注射能够靶向吞噬癌细胞的微生物注射液，微生物进入体液后，在人体内扩散并汇集于受靶部位，微生物作用于癌细胞表面并吞噬癌细胞，达到治疗癌症的目的。
58.本发明的有益效果为：本发明提高了该微生物的培养效率，且发明了一种直接利用微生物生产能够溶血栓的药片，和直接利用微生物生产能够靶向吞噬癌细胞的注射液。
59.本发明不局限于上述可选实施方式，任何人在本发明的启示下都可得出其他各种形式的产品，但不论在其形状或结构上作任何变化，凡是落入本发明权利要求界定范围内的技术方案，均落在本发明的保护范围之内。