一种真菌类生物农药的保藏方法与流程

1.本发明涉及真菌类生物农药的保藏技术领域，具体涉及一种真菌类生物农药的保藏方法。


背景技术：

2.真菌类生物农药是一类利用有益真菌防治植物病虫害的农药，具有绿色、安全、环保、高效的特点。目前已经有大量的真菌类生物农药已经得到广泛应用。例如，使用白僵菌防治玉米螟和森林的松毛虫，使用绿僵菌防治蛴螬和金龟子，使用淡紫拟青霉防治线虫等，还有哈茨木霉、木霉、蜡蚧轮枝菌、玫烟色棒束孢等。
3.多数真菌类生物农药的活性成分为真菌孢子，真菌孢子通过制备为农药制剂进行包装储存，在包装存储中真菌孢子多为休眠状态。使用时，将含有真菌孢子的农药制剂兑水稀释喷雾或者对植物进行灌根。当真菌孢子兑水稀释后，打破休眠状态，喷雾到使用靶标上时，孢子萌发，发生作用，达到杀灭病虫害的效果。例如，白僵菌粘附在害虫体表，穿透气孔，进行孢子萌发生长，最后侵染害虫，导致害虫死亡。
4.但是真菌类生物农药常常货架期短，不耐储存，保质期短，这极大的限制了真菌类生物农药的使用。其中重要的原因是，真菌类生物农药的休眠孢子容易逐渐失活。这种失活一部分由于休眠孢子的弱代谢造成孢子的营养物质的消耗而导致孢子死亡，例如包装中存在微弱的氧气和水分，使得孢子的呼吸仍在继续消耗孢子中残存的营养物质；一部分由于包装的不恰当环境使得休眠孢子解除休眠状态进行萌发生长，造成孢子死亡，例如包装存在气密性泄露，外界的潮湿空气使得孢子解除休眠状态，萌发死亡。
5.文献“effect of storage conditions on the survival of two potential biocontrol agents of nematodes,the fungi paecilomyces lilacinus and pochonia chlamydosporia”weijun duan,ence yang,meichun xiang，xingzhong liu，biocontrol science and technology，vol.18,no.6,2008,605
‑
612研究了生物农药淡紫拟青霉的储存条件。文献中采用将液体发酵的淡紫拟青霉paecilomyces lilacinus和海藻酸钠、硅藻土混合，然后滴加到氯化钙的溶液中形成微球。然后研究保藏温度、水的活度以及保藏的气体环境对淡紫拟青霉的保藏影响。结果表明，保藏温度对保藏影响最大,温度越低保藏的时间越长，4℃与
‑
20℃没有显著差异。水的活度越低，也就是环境越干燥保藏时间越长。通入氮气对比在空气环境下，提高了保藏时间，然而通入二氧化碳会降低保藏时间，因为二氧化碳对真菌有毒性。该文献提供了一些理论性的指导，但是存在其缺陷。首先，将液体发酵的淡紫拟青霉和海藻酸钠混合制备微球，微球中含有大量的残余水分，虽然文献通过和饱和盐溶液进行平衡来控制水的活度，但这些水分的存在会使得淡紫拟青霉提前萌发，降低其保藏期。最佳的环境应该是一个无水的干燥的环境。另外，文献采用的液体发酵的淡紫拟青霉采用的是液体孢子和液体菌丝体的混合物，这些混合物与固体发酵产生的固体孢子有很大不同，固体发酵的孢子因为是在固体表面产生，较液体发酵的孢子和菌丝体更耐储存。再次，文献没有考虑到包装材料的透气性。虽然包装材料密封包装被认为是密闭的体系，但是
塑料本身存在微弱的透气性。在短期的储存下这种透过包装材料的气体交换不是很显著，但长期储存状态下，特别是外界的潮湿气体，可以渗透入包装材料改变包装材料内的水分和空气的状态。


技术实现要素：

6.本方案的目的在于提供一种真菌类生物农药的保藏方法，将真菌孢子长期保持在休眠状态，并充分考虑保持包装材料内部的干燥和无氧环境，对以真菌孢子为有效活性成分的真菌类生物农药都适用。
7.为达到上述目的，本方案如下：一种真菌类生物农药的保藏方法，该方法包括：将真菌孢子、填料、惰性吸水辅料混合均匀置于容器中，同时向容器内加入去除剂和充入非活性气体，密封保藏。
8.优选地，所述惰性吸水辅料包括脱脂奶粉、米粉、面粉、环糊精、麦芽糖糊精和硅藻土中的一种或者几种。
9.优选地，所述填料包括滑石粉、轻质碳酸钙。
10.优选地，所述去除剂置于透气封口的无纺布包装袋内。
11.优选地，所述去除剂包括铁粉、锌粉、铝粉、亚硫酸钠、连二亚硫酸钠、抗坏血酸、抗坏血酸钙、叔丁基对苯二酚、苯三酚、无水氧化钙、无水氯化钙、无水氯化铁、无水氯化镁、无水硫酸钠、无水碳酸钾、无水碳酸钠、无水氢氧化钠、无水氢氧化钾、无水硅胶和无水氢氧化钙中的一种或者几种。
12.优选地，所述去除剂为质量比2:1:2的铁粉、无水氧化钙和无水硅胶。
13.优选地，所述去除剂为质量比为5:2:2:1:2的铁粉、无水硫酸钠、无水碳酸钾、无水氧化钙和无水硅胶。
14.优选地，所述非活性气体是氮气、氦气或者氩气。
15.优选地，所述真菌孢子通过固体发酵产生。
16.优选地，密封保藏的温度为0～30℃，优选温度为25～30℃。
17.本方案的有益效果如下：
18.(1)采用加入惰性吸水辅料混合物及密封保藏能够保持真菌类生物农药及包装袋内部的干燥，利于提高真菌类生物农药保藏效果；
19.(2)在包装袋中加入具有脱氧脱水脱二氧化碳功能的去除剂袋能够保持包装袋内部的干燥，利于提高真菌类生物农药保藏效果；
20.(3)通入氮气等非活性气体，在包装袋内部创造出无氧环境，利于提高真菌类生物农药保藏效果；
21.(4)上述三种方法结合使用，能更好的保持包装袋内部的干燥和无氧环境，将休眠孢子长期保持在休眠状态，有效延长真菌类生物农药保质期；
22.(5)本技术公开的一种真菌类生物农药的保藏方法为广谱的保藏方法，对以真菌孢子为有效活性成分的真菌类生物农药都适用。
附图说明
23.为了更清楚地说明本方案的实施，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简
单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本方案的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
24.图1为实施例中包装袋内部示意图；
25.其中：1
‑
真菌孢子及惰性吸水辅料混合物；2
‑
包装袋；3
‑
去除剂袋。
具体实施方式
26.下面将结合附图对本方案的实施方式作进一步地详细描述。显然，所描述的实施例仅是本方案的一部分实施例，而不是所有实施例的穷举。需要说明的是，在不冲突的情况下，本方案中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
27.多数真菌类生物农药的活性成分为真菌孢子，真菌孢子与填料混合制备为农药制剂进行包装储存，存储阶段真菌孢子多为休眠状态，使用时打破真菌孢子休眠状态使其萌发并发生作用，达到杀灭病虫害的效果。但是真菌类生物农药常常货架期短，不耐储存，保质期短，这极大的限制了真菌类生物农药的使用。其中重要的原因是，真菌类生物农药的休眠孢子容易逐渐失活。
28.本发明提供一种真菌类生物农药的保藏方法，通过保持包装材料内部的干燥和无氧环境，将真菌孢子长期保持在休眠状态，来提高真菌孢子的保藏效果，有效延长真菌类生物农药保质期。
29.一种真菌类生物农药的保藏方法，该方法包括：将真菌孢子、填料、惰性吸水辅料混合均匀置于容器中，同时向容器内加入去除剂和充入非活性气体，密封保藏。
30.其中，惰性吸水辅料是具有吸水功能的惰性辅料。辅料是为了分散和混合真菌孢子加入的填料，惰性是指这种辅料不会对真菌孢子有害，吸水指的是这些辅料具有一定的吸水吸湿气能力，可以保持孢子周围环境的干燥。真菌孢子粉通常含量很高，大于1000亿孢子每克。使用时候不需要这么高的浓度的孢子粉，需要对孢子粉进行稀释，所以用这些物质和真菌孢子混合是对其进行混合稀释。干燥的奶粉，米粉和面粉在密封条件下可以保藏两年左右外观不会发生变化，将真菌孢子加入干燥的奶粉，米粉和面粉中，在这种干燥条件下孢子不会萌发。将真菌孢子和这些辅料混合就是为了给真菌孢子制造干燥的环境。
31.在一个实施例中，和真菌孢子混合的惰性吸水辅料，可以是脱脂奶粉、米粉、面粉、环糊精、麦芽糖糊精、硅藻土中的一种或几种。
32.去除剂具有吸水功能或者与氧气反应功能而脱除氧气的一种或几种物质组成，在一个实施例中，去除剂可以选择如铁粉、锌粉、铝粉、亚硫酸钠、连二亚硫酸钠、抗坏血酸、抗坏血酸钙、叔丁基对苯二酚、苯三酚、氧化钙、无水氯化钙、无水氯化铁、无水氯化镁、无水硫酸钠、无水碳酸钾、无水碳酸钠、无水氢氧化钠、无水氢氧化钾无水硅胶和无水氢氧化钙中的一种或几种。去除剂可以用独立小包装袋包装封口，该小包装袋上有小的透气孔，如将去除剂置于透气封口的无纺布包装袋内。
33.在一个实施例中，去除剂包括质量比2:1:2的铁粉、无水氧化钙和无水硅胶。其中铁粉可以吸收氧气，无水氧化钙可以吸收二氧化碳，无水硅胶可以吸水，
34.在另一个实施例中，去除剂包括质量比为5:2:2:1:2的铁粉、无水硫酸钠、无水碳酸钾、无水氧化钙和无水硅胶。其中铁粉可以吸收氧气，无水硫酸钠可以吸收水，无水碳酸钾可以吸收二氧化碳，无水氧化钙可以吸收水和二氧化碳，无水硅胶可以吸收水。选择这些
物质作为去除剂，充分利用了每种物质的吸收特性，混合在一起发挥作用。
35.非活性气体可以是氮气、氦气、氩气等，优先选择氮气。通过充入非活性气体替代空气，目的是将真菌孢子周围维持在一个干燥无氧的环境，使得真菌孢子处于休眠状态。
36.在一个实施例中，所述填料包括滑石粉、轻质碳酸钙。
37.在一个实施例中，真菌孢子通过固体发酵产生。
38.在一个实施例中，密封保藏的温度可以是4，5，10，15，20，25，26，27，28，29或30℃。本实施例中的保藏温度为接近室温的保藏温度，该保藏条件在实际生产中较为容易达到，适宜生产使用。温度低于该保藏温度可以进一步延长保藏时间，例如在4℃保藏。本方案采用加入惰性吸水辅料混合物及密封保藏能够保持真菌类生物农药及包装袋内部的干燥，利于提高真菌类生物农药保藏效果；在包装袋中加入具有脱氧脱水脱二氧化碳功能的去除剂袋能够保持包装袋内部的干燥，利于提高真菌类生物农药保藏效果；通入氮气等非活性气体，在包装袋内部创造出无氧环境，利于提高真菌类生物农药保藏效果；上述三种方法结合使用，能更好的保持包装袋内部的干燥和无氧环境，将休眠孢子长期保持在休眠状态，有效延长真菌类生物农药保质期；该保藏方法为广谱的保藏方法，对以真菌孢子为有效活性成分的真菌类生物农药都适用。
39.下面结合具体的实施例对本方案进行说明。
40.实施例1：一种真菌类生物农药的报酬方法，包括：
41.s1、取固体发酵制备得到的淡紫拟青霉孢子粉进行孢子计数后，加入经过计算数量的灭菌的惰性吸水辅料脱脂奶粉，进行混合，制备为2亿孢子/克的样品1000克,此为真菌孢子及惰性吸水辅料混合物1，将真菌孢子及惰性吸水辅料混合物1装入包装袋2；
42.s2、将铁粉：无水氧化钙：无水硅胶按照2:1:2的比例配制，取约10克，加入无纺布袋中，然后封口，制备为具有脱氧脱水脱二氧化碳功能的去除剂袋3，将去除剂袋3置于所述包装袋2中；
43.s3、向所述包装袋2通入氮气，密封为样品1。
44.对比例1：采用的保藏方法与实施例1中不同之处在于步骤s3，所述包装袋2中为自然空气，密封为对照样品1；其他步骤相同。
45.对比例2：采用的保藏方法与实施例1中不同之处在于没有步骤s2，其他步骤相同，密封为对照样品2。
46.对比例3：采用的保藏方法与实施例1中不同之处在于没有步骤s2，步骤s1相同，所述包装袋2中为自然空气，密封为对照样品3。
47.对比例4：采用的保藏方法如下，取固体发酵制备得到的淡紫拟青霉孢子粉进行孢子计数后，加入灭菌后的草炭，进行混合，制备为2亿孢子/克的样品1000克，袋中为自然空气，密封为对照样品4。
48.实施例1及对比例1
‑
4所保藏的真菌类生物农药活性成分是淡紫拟青霉，包装袋2为常用的聚乙烯包装袋。每个样品做48袋，放于28℃培养箱中，每个月第一天取出两个，拆封，取其中的样品，进行孢子萌发计数，取平均值，计数结果见表1。
49.从结果可见，实施例1及对比例1都表现出很好的保藏效果，保藏时间明显延长，加入惰性吸水辅料混合物1及使用去除剂袋3较为重要；实施例1较对比例1的保藏效果更优，通入氮气可以进一步提高保藏效果。
50.表1
[0051][0052][0053]
实施例2：一种真菌类生物农药的报酬方法，包括：
[0054]
s1、取固体发酵制备得到的白僵菌孢子粉进行孢子计数后，加入经过计算数量的灭菌的惰性吸水辅料脱脂奶粉，进行混合，制备为10亿孢子/克的样品1000克,此为真菌孢子及惰性吸水辅料混合物1，将真菌孢子及惰性吸水辅料混合物1装入包装袋2；
[0055]
s2、将铁粉：无水硫酸钠：无水碳酸钾：无水氧化钙：无水硅胶按照5:2:2:1:2比例配制，取约30克加入无纺布袋中，然后封口，制备为具有脱氧脱水脱二氧化碳功能的去除剂袋3，将去除剂袋3置于所述包装袋2中；
[0056]
s3、向所述包装袋2通入氮气，密封为样品2。
[0057]
对比例5：采用的保藏方法与实施例2中不同之处在于步骤s3，所述包装袋2中为自然空气，密封为对照样品5；其他步骤相同。
[0058]
对比例6：采用的保藏方法与实施例2中不同之处在于没有步骤s2，其他步骤相同，密封为对照样品6。
[0059]
对比例7：采用的保藏方法与实施例2中不同之处在于没有步骤s2，步骤s1相同，所述包装袋2中为自然空气，密封为对照样品7。
[0060]
对比例8：采用的保藏方法如下，取固体发酵制备得到的白僵菌孢子粉进行孢子计
数后，加入灭菌后的草炭，进行混合，制备为10亿孢子/克的样品1000克，袋中为自然空气，密封为对照样品8。
[0061]
实施例2及对比例5
‑
8所保藏的真菌类生物农药活性成分是白僵菌孢子，所述包装袋2为常用的聚乙烯包装袋。每个样品做48袋，放于28℃培养箱中，每个月第一天取出两个，拆封，取其中的样品，进行孢子萌发计数，取平均值，计数结果见表2。
[0062]
从结果可见，白僵菌属孢子为较不耐储藏的真菌孢子，对比例8在保藏第7个月即开始出现萌发孢子数下降。实施例2及对比例5都表现出很好的保藏效果，保藏时间明显延长，加入惰性吸水辅料混合物1及使用去除剂袋3较为重要；实施例2较对比例5的保藏效果更优，通入氮气可以进一步提高保藏效果；对比例6不加入去除剂袋3但通入氮气，保藏效果明显优于不通入氮气的对比例7的保藏效果，通入氮气对保藏效果提升非常显著。
[0063]
表2
[0064][0065]
本技术中实施例1
‑
2及对比例1
‑
8都是采用对于测试孢子萌发的方式来评测孢子的活力，下面对测试方法进行具体说明。
[0066]
配制pda琼脂培养基平板：马铃薯200克，葡萄糖20克，琼脂20克，蒸馏水1000毫升，自然ph。先洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20
‑
30分钟，能被玻璃棒戳破即可)，用八层纱布过滤，加热，加20g琼脂，继续加热搅拌混匀，待琼脂溶解完后，加入葡萄糖，搅拌均匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装锥形瓶，加塞、包扎，121℃灭菌20
分钟左右后取出，趁热倒平板，平板凝固后备用。
[0067]
测试产品中孢子萌发率的方法：取约1克左右的含有孢子的产品样品，准确称重，得到样品重量，然后配制0.1％吐温蒸馏水，在121℃高压灭菌30分钟，冷却到室温备用，为0.1％吐温无菌水，加入吐温无菌水10ml于样品中，在摇床上180rpm摇动30分钟，为孢子液体样品，然后用吐温无菌水对孢子液体样品进行10倍梯度稀释，稀释到10,100,1000,10000,105,106,107,108,109倍。取稀释后的样品1ml分别在pda琼脂培养基平板上进行涂布，涂布完成后，放于28℃进行培养。待菌落长出后，进行计数，取平板上菌落数为约10
‑
100个的平板计算萌发的活孢子数，样品中的活孢子数为：平板上的菌落数
×
稀释倍数
×
10
÷
样品重量(g)。
[0068]
本技术公开的一种真菌类生物农药的保藏方法为广谱的保藏方法，对以真菌孢子为有效活性成分的真菌类生物农药都适用，真菌类生物农药包括但不限于：白僵菌、绿僵菌、淡紫拟青霉、木霉菌、哈茨木霉菌、蜡蚧轮枝菌、玫烟色棒束孢、玫烟色拟青霉等。其中，孢子优选为固体发酵产生的真菌孢子。
[0069]
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举。本发明实施例子所述的保藏温度为接近室温的保藏温度，该保藏条件在实际生产中较为容易达到，适宜生产使用。温度低于该保藏温度可以进一步延长保藏时间，例如在4℃保藏。
[0070]
凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。