抗猪GasderminD蛋白单克隆抗体、分泌该单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用的制作方法

抗猪gasdermin d蛋白单克隆抗体、分泌该单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用
技术领域
1.本发明涉及一种单克隆抗体、分泌该单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，具体涉及一种抗猪gasdermin d蛋白单克隆抗体、产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明还涉及上述单克隆抗体用于检测猪的组织和细胞培养物中猪gasdermin d蛋白表达和切割情况检测的方法。本发明属于生物技术领域。


背景技术：

2.细胞焦亡(pyroptosis)是一种重要的程序性细胞死亡(programmed cell death,pcd)形式。与细胞凋亡不同，细胞焦亡是一种具有促炎特性的pcd形式。早期的研究发现，细胞焦亡发生的过程中，细胞中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶
‑
1(caspase
‑
1)、人的caspase
‑
4/5和小鼠的caspase
‑
11被活化。同时，细胞焦亡发生的过程中会增加il
‑
1β和il
‑
18等主要促炎性细胞因子以及高迁移率族蛋白b1(hmgb1)等炎性介质的释放。gasdermin d(gsdmd)是介导细胞焦亡的效应分子之一。全长gsdmd蛋白具有氨基酸结构域(gsdmd
‑
n)和羧基端结构域(gsdmd
‑
c)两个结构域，两个结构域之间通过柔性结构相连，柔性结构中有高度保守的caspases的酶切位点。完整的gsdmd分子，gsdmd
‑
n和gsdmd
‑
c相互结合，呈现自抑制状态。当细胞中的caspase
‑
1、caspase
‑
4/5以及caspase
‑
11被激活时，可以在gsdmd
‑
n和gsdmd
‑
c之间对gsdmd进行切割。产生分子量30kda左右的gsdmd
‑
n和20kda左右的gsdmd
‑
c。gsdmd
‑
n可以在细胞膜和线粒体膜上形成穿膜孔道。gsdmd
‑
n在细胞膜上形成的穿膜孔道是il
‑
1β和il
‑
18以及il
‑
33等细胞因子向细胞外释放的主要途径。当gsdmd
‑
n形成的穿膜孔道对细胞膜破坏严重时，细胞发生焦亡性裂解，大量内容物释放，加剧炎症反应。gsdmd除了可以被caspase
‑
1、caspase
‑
4/5和caspase
‑
11切割为gsdmd
‑
n和gsdmd
‑
c两段外，还可以被caspase
‑
3切割，切割产物为一个10kda左右的肽段和一个43kda左右的肽段。gsdmd被caspase
‑
3切割产生的两段多肽均不表现生物学功能。gsdmd被caspase
‑
3的切割被认为是细胞调控自身发生程序性死亡方式的重要机制之一。gsdmd的活化已被证实与多种疾病(如肿瘤、自身免疫性疾病以及传染性疾病等)的发生有密切关联，并且被认为是一个新的疾病治疗靶点。
3.目前，市售的gsdmd抗体均是针对人和小鼠gsdmd特异性的抗体，而缺少针对其他生物gsdmd具有特异性的抗体，这对于在其他生物中探讨gsdmd功能的工作来说是不利的。特异性抗体是研究蛋白质功能的重要工具之一，本发明旨在提供一种小鼠抗猪gsdmd蛋白单克隆抗体，以及运用该单克隆抗体对猪源细胞和猪组织中gsdmd表达和切割情况进行免疫印迹检测的方法。


技术实现要素：

4.本发明的目的之一是提供一种分泌抗猪gsdmd蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；
5.本发明的目的之二是提供由所述杂交瘤细胞株分泌产生的抗猪gsdmd蛋白单克隆
抗体；
6.本发明的目的之三是提供所述单克隆抗体的用途。
7.为了达到以上目的，本发明所采用的技术方案为：
8.本发明的一株分泌抗猪gasdermin d蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述的杂交瘤细胞株命名为4g7
‑
d7，分类命名为抗猪gasdermin d单克隆抗体杂交瘤细胞株，保藏在中国典型培养物保藏中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其菌种保藏编号为：cgmcc no.22321，保藏时间为2021年05月10日。
9.上述杂交瘤细胞株通过以下途径制备得到：
10.将重组质粒pet
‑
30a( )
‑
pgsdmd转化大肠杆菌，iptg诱导下获得包涵体形式表达的重组猪gsdmd蛋白(pgsdmd)，对该蛋白进行纯化；将纯化的pgsdmd蛋白作为免疫原，皮下接种5周龄balb/c小鼠。按照常规杂交瘤细胞融合技术将免疫小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞进行融合。用纯化的pgsdmd蛋白为筛选抗原，建立间接elisa方法，最终筛选出1株持续分泌抗猪gsdmd蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株4g7
‑
d7。本发明进一步从杂交瘤细胞上清液中或从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，获得抗猪gsdmd蛋白的单克隆抗体。
11.进一步的，本发明还提出了一种抗猪gsdmd蛋白单克隆抗体，所述的单克隆抗体由保藏编号为cgmcc no.11188的杂交瘤细胞株分泌产生。
12.更进一步的，本发明还提供了所述的抗猪gsdmd蛋白单克隆抗体在制备检测猪gasdermin d蛋白试剂中的应用。
13.其中，优选的，所述的试剂为用于免疫印迹法检测的试剂。更优选的，所述的试剂为用于elisa方法检测的试剂。
14.其中，优选的，所述的试剂能够用于gsdmd表达和切割情况的检测。
15.相较于现有技术，本发明的有益效果是：
16.本发明提供了一种小鼠抗猪gsdmd蛋白单克隆抗体，并且建立了运用该单克隆抗体对猪源细胞和猪组织中gsdmd表达和切割情况进行免疫印迹检测的方法。实验证明，该单克隆抗体对猪gasdermin d蛋白具有反应特异性，所述的单克隆抗体不仅能够检测猪gsdmd全蛋白，还能够检测活化切割后的猪gsdmd蛋白羧基端节段。本发明的提出对猪gsdmd生物学功能的研究具有重要意义。
附图说明
17.图1为抗猪gsdmd单克隆抗体用于免疫印迹方法检测猪肠组织中gsdmd蛋白表达及切割情况的结果图；
18.图2为抗猪gsdmd单克隆抗体用于免疫印迹方法检测猪ipec
‑
j2细胞中gsdmd表达情况的结果图。
具体实施方式
19.下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
20.实施例1抗猪gasdermin d蛋白单克隆抗体的制备
21.1、重组质粒pet
‑
30a( )
‑
pgsdmd的构建
22.根据已公布的猪gsdmd蛋白编码基因开放阅读框的核苷酸序列(ncbi reference sequence:xm_021090504.1)进行猪gsdmd(pig gsdmd，缩写为pgsdmd)全基因合成并连接于puc57质粒中。用表1所述引物，从puc57
‑
pgsdmd质粒中扩增gsdmd基因。将扩增产物和pet
‑
30a( )载体质粒分别用sal i和ecor i进行双酶切，并对酶切产物进行胶回收。将回收的猪gsdmd基因与pet
‑
30a( )片段混合，并在连接酶的作用下进行连接。连接产物转化至e.coli dh5感受态细胞中，并将转化产物涂布在含有卡那霉素(30μg/ml)的lb琼脂平板上。挑取单个菌落，扩增培养，提取质粒。对提取的质粒进行酶切、pcr及测序鉴定，鉴定连接成功的质粒命名为pet
‑
30a( )
‑
pgsdmd，其中，gsdmd基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
23.表1.扩增猪gsdmd基因所用引物
[0024][0025]
2、重组猪gsdmd蛋白(recombinant pig gsdmd，缩写为rpgsdmd)的制备
[0026]
(1)重组质粒pet
‑
30a( )
‑
pgsdmd的转化
[0027]
1)取0.2dm重组质粒转化至e.coli rosetta(de3)tm感受态细胞中，涂布于含有卡那霉素(30态细胞中，)的lb琼脂平板上。
[0028]
2)随机挑取1个转化子接种至lb培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃振荡培养。
[0029]
(2)重组蛋白的诱导表达
[0030]
1)按1％剂量接种阳性菌至10ml的lb培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃，220r/min培养2
‑
3h。
[0031]
2)培养至od600nm达0.4
‑
0.6，加入iptg(终浓度1mmol/l)诱导表达4～6h。
[0032]
3)收集菌体并超声破碎，离心后分别取上清和沉淀进行sds
‑
page，确定目的蛋白的表达情况。
[0033]
最终得到以包涵体形式表达的rpgsdmd蛋白。
[0034]
3、rpgsdmd的纯化
[0035]
(1)溶液配制：
[0036]
1)le buffer
[0037]
50mm nah2po4·
h2o，300mm nacl，去离子水1l(调节ph至8.0)。
[0038]
2)10mm/ml咪唑
[0039]
10mm咪唑，1l le buffer(调节ph至8.0)。
[0040]
3)80mm/ml咪唑
[0041]
80mm咪唑，1l le buffer(调节ph至8.0)。
[0042]
4)pbs
[0043]
nacl 8.0g，na2hpo4·
12h2o 2.9g，kcl 0.2g，kh2po
4 0.24g，去离子水1l。
[0044]
(2)方法
[0045]
具体步骤如下：
[0046]
1)参照上述的方法，按照1％的比例将阳性菌接种入100ml lb培养基(含50μg/ml卡那霉素)，对重组蛋白进行扩大规模诱导表达。
[0047]
2)采用ni
‑
nta purification system按照说明书进行重组蛋白的纯化。
[0048]
3)收集纯化蛋白至透析袋，将纯化的蛋白以2l pbs甘油进行透析，每12h换液一次，连续透析72h。
[0049]
4)采用peg6000将透析完毕的蛋白溶液进行浓缩，碧云天蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。
[0050]
5)得到纯化的浓度为0.2
‑
0.5mg/ml的rpgsdmd蛋白。
[0051]
4、elisa方法的确定
[0052]
(1)试剂配制：
[0053]
1)包被液(ph9.6的碳酸盐缓冲液)
[0054]
无水na2co
3 0.1696g，nahco
3 0.2856g，去离子水100ml，完全溶解至4℃,一周内使用。
[0055]
2)pbst配方
[0056]
nacl 8.0g，na2hpo4.
·
12h2o 2.9g，kcl 0.2g，kh2po
4 0.24g，tween 20 0.5ml，去离子水1l。
[0057]
3)终止液
[0058]
浓硫酸:去离子水＝1:8(体积比)，浓硫酸缓慢加入到无菌水中，并搅拌散热。
[0059]
(2)方法
[0060]
具体步骤如下：
[0061]
1)包被
[0062]
以ph9.6碳酸盐缓冲液作为包被液，将rpgsdmd蛋白100ng/ml每孔100μl包被elisa板，4℃过夜。
[0063]
2)洗涤
[0064]
包被结束后弃掉包被液，用pbst进行洗涤，方法为pbst加满每孔，静置5
‑
10min，弃掉洗液，重新加满，重复洗涤3
‑
5次，最后拍干elisa板等待下一步封闭。
[0065]
3)封闭
[0066]
取步骤2)的elisa板加pbst(内含5％脱脂乳)作为封闭液，每孔300μl，37℃2h。
[0067]
4)洗涤
[0068]
封闭结束的elisa板进行洗涤，方法同步骤2)。最后拍干等待加入一抗。
[0069]
5)加入一抗
[0070]
一抗样品(杂交瘤细胞培养上清或小鼠腹水纯化的单抗)先用pbst稀释后加入到相应孔中(每孔100μl)，37℃孵育1h。
[0071]
6)洗涤
[0072]
具体同步骤4)。
[0073]
7)加入hrp
‑
标记的商品化二抗
[0074]
加相应的商品化hrp
‑
标记的二抗，参考二抗说明书，将二抗用pbst稀释至适当倍数。将稀释好的二抗加入各孔(每孔100μl)，37℃反应1h。
[0075]
8)洗涤
[0076]
具体同步骤4)。
[0077]
9)显色
[0078]
待步骤8)完成后取100μl tmb底物显色液分加至elisa各孔中，然后将elisa板置于37℃反应约10min。
[0079]
10)终止
[0080]
将elisa板取出，每孔加终止液(1mol/l硫酸溶液)终止反应，立即在酶标仪上读数，tmb为底物时检测波长为450nm。
[0081]
5、单克隆抗体的制备
[0082]
(1)免疫动物
[0083]
将纯化的rpgsdmd蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合，乳化后对小鼠(50μg/只)进行颈背部皮下注射。两周后，将纯化的rpgsdmd蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合，乳化后对小鼠进行加强免疫。再间隔两周，用二免同样的方法进行第三次免疫。三免后14d，用纯化的rpgsdmd蛋白(100μg/只)对小鼠进行腹腔注射，3d后，取小鼠脾细胞与sp2/0骨髓瘤细胞进行融合。
[0084]
(2)阳性杂交瘤细胞株的建立
[0085]
取上述免疫鼠的脾制成细胞悬液与处于对数生长期的sp2/0细胞以8:1的比例进行融合。待融合细胞长至孔底1/3时，通过上述间接elisa筛选出阳性杂交瘤细胞株，再利用有限稀释法连续克隆2～3次。至阳性率为100％后进行扩大培养，冻存于液氮中。
[0086]
最终获得1株杂交瘤细胞株，命名为4g7
‑
d7，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为：cgmcc no.22321，保藏日期为2021年05月10日。
[0087]
(3)单克隆抗体的制备
[0088]
将筛选得到的杂交瘤细胞进行扩大培养后，以5
×
106/0.5ml杂交瘤细胞腹腔注射balb/c小鼠1ml，14d后待小鼠腹围增大后用注射器收集腹水，1000r/min离心10min，上清以0.45μm滤器过滤后即为单抗粗制品。用饱和硫酸铵沉淀法将单抗粗制品进行初步提纯，之后用protein a亲和层析法将单抗进一步纯化。
[0089]
实施例2抗猪gsdmd蛋白单克隆抗体用于免疫印迹方法检测猪组织及猪源细胞中gsdmd蛋白表达及切割情况
[0090]
1、抗猪gsdmd蛋白单克隆抗体(实施例1制备)用于免疫印迹实验检测猪组织中gsdmd分子的表达及切割情况
[0091]
1)采集健康和肠致病性大肠杆菌接种的仔猪的肾和肠组织，匀浆后进行蛋白质电泳，并将蛋白转印至nc膜上。
[0092]
2)nc膜用5％脱脂乳室温振荡封闭1h。用tbst洗膜3次，每次5分钟。
[0093]
3)将抗猪gsdmd单克隆抗体用tbst 1：2000稀释，与nc膜于4℃孵育过夜。用tbst洗膜3次，每次5分钟。
[0094]
4)将hrp标记的山羊抗兔igg用tbst 1：5000稀释后作为二抗，与nc膜于室温孵育1h。用tbst洗膜3次，每次5分钟。
[0095]
5)向nc膜上滴加ecl发光液，并用化学发光检成像仪检测并拍照。
[0096]
结果如图1所示。结果显示用上述免疫印迹方法能够较为特异地在对照猪的组织提取物中检测到全长gsdmd蛋白(分子量约为53kda)，而在接种了大肠杆菌的猪的组织提取物中检测到gsdmd蛋白羧基端节段(分子量约为20kda)，说明接种大肠杆菌导致了gsdmd的切割。
[0097]
2、抗猪gsdmd蛋白单克隆抗体(实施例1制备)用于免疫印迹实验检测猪肠上皮细胞猪(ipec
‑
j2)和猪肾细胞猪(pk
‑
15)中gsdmd分子的表达情况
[0098]
1)将培养的ipec
‑
j2和pk15细胞按照5
×
105个细胞/孔的密度接种于6孔细胞培养板中，37℃培养至细胞汇合度达到90％。同时，培养小鼠巨噬细胞系(j774a.1细胞)、牛肾细胞株(mdbk细胞)、非洲绿猴肾细胞株(vero细胞)、鸡巨噬细胞系(hd11细胞)和犬肾细胞株(mdck细胞)用作对照。
[0099]
2)用ripa裂解液裂解细胞。
[0100]
3)将裂解产物进行蛋白质电泳，并将蛋白转印至nc膜上。
[0101]
2)nc膜用5％脱脂乳室温振荡封闭1h。用tbst洗膜3次，每次5分钟。
[0102]
3)将抗猪gsdmd蛋白单克隆抗体用tbst 1：2000稀释，与nc膜于4℃孵育过夜。用tbst洗膜3次，每次5分钟。
[0103]
4)将hrp标记的山羊抗鼠igg用tbst 1：5000稀释后作为二抗，与nc膜于室温孵育1h。用tbst洗膜3次，每次5分钟。
[0104]
5)向nc膜上滴加ecl发光液，并用化学发光检成像仪检测并拍照。
[0105]
结果如图2所示。结果显示用上述免疫印迹方法能够较为特异地在猪源的细胞中检测到全长gsdmd蛋白(分子量约为53kda)，而在其他动物来源的细胞中无法检测到相应的蛋白，说明制备的单克隆抗体能够较为特异地识别猪gsdmd。
[0106]
以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。