多肽衍生物、药物及其用途的制作方法

1.本发明属于生物材料应用领域，具体地，涉及多肽衍生物、药物及其用途。


背景技术：

2.仿生矿化以及实现牙釉质等硬组织的修复再生目前已经成为实现牙齿修复的新兴研究领域。诱导牙齿矿物质的形成和牙釉质的修复的过程中，最重要的是要有合适的有机基质作为矿化基质。生理的矿化过程中包括胶原蛋白等基质蛋白，调节矿化过程的非胶原蛋白以及相关细胞的调控。目前已经发展的仿生矿化有机基质包括带有负电荷的高分子、蛋白、多肽、核酸等，旨在模拟体内胶原蛋白的作用，作为矿化的有机骨架实现对矿化过程的调控。
3.但是，之前的策略主要集中在对胶原蛋白或者其它矿化基质蛋白的模拟，大多以刚性稳定的组装结构发挥模板作用。因此，如何实现更全方位的仿生矿化是十分重要的。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提供了一种多肽衍生物、药物及其用途，该多肽衍生物或药物能够实现磷酸钙矿化，具有促进缺失牙釉质的修复、抑菌等作用。
5.需要说明的是，本发明是基于发明人的下列工作而完成的：
6.研究发现，以源自肉瘤融合(fused in sarcoma,fus)蛋白的
37
sysgys
42
蛋白片段为代表的低复杂蛋白质片段(low
‑
complexity protein segment,lcps)具有高水溶性、结构柔性和多价弱相互作用介导的分子缠结及网络结构形貌等特点。发明人通过试验发现，当将上述lcps中丝氨酸磷酸化和/或膦酸化后依然具有类似的组装或聚集特性，且还有利于招募离子实现矿化的效果；并且还发现，磷酸化和/或膦酸化后的lcps可以作为仿生矿化的骨架基质，同时其柔性结构兼具模板效果和调节作用。因此，发展磷酸化和/或膦酸化的低复杂蛋白片段来实现仿生矿化诱导以及硬组织修复是具有重要潜在应用价值。
7.因而，在本发明的一个方面，本发明提出了一种多肽衍生物。根据本发明的实施例，所述多肽衍生物具有如seq id no：1所示的氨基酸序列，且所述氨基酸序列中的丝氨酸被磷酸化修饰和/或膦酸化修饰。
8.根据本发明的实施例，seq id no：1为sysgys。
9.发明人通过大量试验发现，将上述多肽衍生物涂覆在牙釉质表面，能够使牙釉质表面形成薄膜，且该薄膜为排列规则有序的晶体结构，其与天然的牙釉质非常相似，可实现磷酸钙矿化，具有促进缺失牙釉质的修复。并且，上述多肽衍生物还能够抑制细菌的黏附，实现对牙釉质的保护。
10.根据本发明的实施例，所述多肽衍生物的结构如式i所示：
[0011][0012]
其中，r1、r2和r3各自独立地为
‑
oh2po3、
‑
(ch2)nh2po3或
‑
oh，且r1、r2和r3中的至少之一为
‑
oh2po3或
‑
(ch2)nh2po3，n为大于1的整数。上述结构的多肽衍生物能够实现磷酸钙矿化，具有促进缺失牙釉质的修复、抑菌的作用。
[0013]
根据本发明的实施例，n<5(例如，n为1～4、2～4、1～3的整数)。该多肽衍生物的效果较佳。
[0014]
根据本发明的实施例，所述多肽衍生物具有如式ii
‑
vii之一的结构：
[0015]
[0016][0017]
发明人通过大量试验发现，采用上述多肽衍生物能够明显刺激细胞成骨分化，还能够在牙釉质表面形成排列规则有序的晶体结构，使牙釉质得到修复，其还能够有效的抑
制蛀牙菌群生长，尤其是变形链球菌。并且，发明人还发现，天然磷酸基团在存在大量碱性磷酸酶的环境中往往容易被水解，进而失去磷酸基团的调节作用，而通过引入非水解的膦酸化氨基酸取代天然的磷酸化氨基酸，能够提高多肽衍生物对牙釉质的修复作用。
[0018]
在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物。根据本发明的实施例，所述药物包含上述的多肽衍生物。根据本发明的实施例，该药物能够实现磷酸钙矿化，具有促进缺失牙釉质的修复、避免口腔中主要蛀牙菌群的黏附。
[0019]
在本发明的另一方面，本发明提出一种上述多肽衍生物或上述药物在制备促进牙釉质修复的产品中的用途。根据本发明的实施例，将上述多肽衍生物或上述药物涂覆在牙釉质表面，能够使牙釉质表面形成薄膜，且该薄膜为排列规则有序的晶体结构，其与天然的牙釉质非常相似，使损坏的牙釉质得到修复。
[0020]
根据本发明的实施例，所述牙釉质修复包括牙釉质再矿化。由此，采用上述多肽衍生物或药物，能够促进牙釉质表面的再矿化，从而实现对牙釉质的修复。
[0021]
在本发明的另一方面，本发明提出了一种上述多肽衍生物或上述药物在制备抑制口腔中蛀牙菌群黏附的产品中的用途。发明人通过试验发现，采用上述多肽衍生物或药物，能够抑制牙釉质表面细菌的黏附，起到对牙釉质的保护作用。
[0022]
根据本发明的实施例，所述蛀牙菌群包括变形链球菌、乳酸杆菌、唾液链球菌、血链球菌及粘性放线菌中的至少之一。由此，采用上述多肽衍生物或药物，能够抑制牙釉质表面上述的细菌。
[0023]
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
[0024]
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0025]
图1为实施例1中制得的lcps
‑
oh、lcps
‑
op和lcps
‑
cp三种蛋白片段的化学结构示意图；
[0026]
图2为实施例1中lcps
‑
oh(a)、lcps
‑
op(b)和lcps
‑
cp(c)的hplc色谱图和esi
‑
ms质谱图；
[0027]
图3为实施例2中lcps
‑
oh、lcps
‑
op和lcps
‑
cp组装形貌电镜图；
[0028]
图4为实施例2中lcps
‑
oh组、lcps
‑
op组、lcps
‑
cp组和对照组的体外矿化的电镜图和元素能谱图；
[0029]
图5为实施例2中lcps
‑
oh组、lcps
‑
op组、lcps
‑
cp组和对照组的体外矿化过程形成图；
[0030]
图6为实施例3中不同组的mc3t3
‑
e1细胞成骨分化的光学显微镜图(a)和定量分析柱形图(b)；
[0031]
图7为实施例4中不同组的牙釉质表面吸附蛋白片段的含量图；
[0032]
图8为实施例4中不同组的牙釉质的扫描电镜图(a)和表面能谱分析图(b)；
[0033]
图9为实施例5中不同组的牙釉质的电镜表面形貌图(a)、x射线衍射图谱(b)、表面模量图(c)和硬度图(d)；
[0034]
图10为实施例6中牙片表面的变形链球菌的共聚焦显微镜层扫三维重建表征图(a)和活死细菌的分布图(b)。
具体实施方式
[0035]
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0036]
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
[0037]
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0038]
本发明中涉及的膦酸化丝氨酸是采用已知的常规技术手段合成的，其余氨基酸均可市售获得。本发明实施例中采用live/dead baclight细菌活力检测试剂盒进行细菌死活染色。
[0039]
实施例1：lcps及其磷酸化和膦酸化衍生物的合成
[0040]
采用传统的多肽固相合成方法手动合成lcps
‑
oh、lcps
‑
op和lcps
‑
cp三条蛋白片段，如图1所示。具体为，采用fmoc
‑
ser(tbu)
‑
王树脂(0.295mmol/g，gl biochem)作为合成树脂，在二氯甲烷中溶胀30min后，使用20％的哌啶n,n
‑
二甲基甲酰胺分别处理5min、15min连续两次除去fmoc基团使得王树脂上出现裸露的胺基；然后通过1
‑
羟基
‑7‑
氮杂苯并三唑(hoat，4eq)、2
‑
(7
‑
氮杂
‑
1h
‑
苯并三唑
‑1‑
基)
‑
1,1,3,3
‑
四甲基尿nium六氟磷酸盐(hatu，3.8eq)和碱n，n
‑
二异丙基乙胺(diea，8eq)，使得王树脂上的胺基和下一个fmoc
‑
氨基酸的羧基室温偶联1h。在完成所有氨基酸偶联之后，王树脂需要真空抽干后，加入三氟乙酸(tfa)/三异丙基硅烷(tis)/水(95/2.5/2.5，v)反应2h实现多肽从王树脂上的切除，进一步浓缩后在冰乙醚中沉淀得到蛋白片段粗产物。将蛋白片段粗产物通过反相制备级高效液相色谱纯化并用分析级液相色谱鉴定和esi
‑
ms鉴定分子量，如图2所示，最终成功得到所设计的三条蛋白片段，即为lcps
‑
oh、lcps
‑
op和lcps
‑
cp。
[0041]
实施例2：lcps及其磷酸化和膦酸化衍生物的组装和体外矿化
[0042]
将lcps
‑
oh、lcps
‑
op和lcps
‑
cp三条蛋白片段分别溶于水中配制成浓度为10mg/ml的蛋白溶液，于ph值为7.0、温度为4℃的条件下孵育一周后，分别作为lcps
‑
oh组、lcps
‑
op组和lcps
‑
cp组，然后通过透射电镜观察lcps
‑
oh组、lcps
‑
op组和lcps
‑
cp组中的蛋白片段组装形貌，如图3所示，其中lcps
‑
oh组装形貌形成刚性纳米纤维，lcps
‑
op组装形貌和lcps
‑
cp组装形貌形成交错的网络装结构。
[0043]
分别取10μl的lcps
‑
oh组、lcps
‑
op组和lcps
‑
cp组的蛋白片段组装溶液和超纯水(对照组)，然后分别加入等体积的超纯水稀释后，加入100μl浓度为1.35mm cacl2，振荡1小时确保钙离子和蛋白片段组装体的结合，然后逐滴滴加100μl的0.81mm k2hpo4，滴加的时间大概1小时，边滴加边振荡，得到的蛋白溶液在室温孵育，然后进行检测成核过程和磷酸钙
晶体的生长。
[0044]
取过夜后的lcps
‑
oh组、lcps
‑
op组、lcps
‑
cp组和对照组的溶液进行电镜观察，如图4所示，发现lcps
‑
oh组中本身蛋白片段形成的纤维依然保持，同时在其周围形成磷酸钙矿物质，二者没有明显的关系，有的矿化产物附着在纤维表面，而lcps
‑
op组和lcps
‑
cp组出现了较为均一的矿化产物，不能明显区分矿物质和蛋白片段组装体。并且，如图4所示，通过对上述四组溶液进行高分辨透射电镜元素能谱分析，发现lcps
‑
op组和lcps
‑
cp组的组装体可以参与到体外磷酸钙的矿化过程中，形成非常好的融合结构，但是对于没有磷酸基团的lcps
‑
oh组的组装体的纳米纤维结构并没有参与到整体矿化的过程中。通过酶标仪检测矿化过程中矿化溶液的od
405 nm，如图5所示，发现相比于没有蛋白片段的对照组(no peptide)，lcps
‑
op组和lcps
‑
cp组可以延缓磷酸钙从无定形结构向羟基磷灰石(hap)的转变。
[0045]
实施例3：lcps组装体对鼠源成骨前细胞的成骨分化评价
[0046]
选择鼠源的mcsts
‑
e1成骨前细胞系作为i评价细胞系，设置四组相同的i评价细胞系，将成骨前细胞铺板过夜，待成骨前细胞贴壁后，以换液的方式分别加入相同体积的实施例2中的lcps
‑
oh组的蛋白片段组装溶液、lcps
‑
op组的蛋白片段组装溶液、lcps
‑
cp组的蛋白片段组装溶液和超纯水，并加入细胞培养基进行稀释至上述三组的蛋白片段组装体的浓度为25μm，均共同孵育16天后，分别作为lcps
‑
oh组、lcps
‑
op组、lcps
‑
cp组和对照组(no peptide)，然后选择未孵育的i评价细胞系作为空白对照组(blank control)，通过茜素红染色的方法染色，用光学显微镜观测不同组中的细胞矿化情况，并通过542nm的细胞吸收值进行定量分析。如图6所示，结果显示相较于空白对照组，加入蛋白片段后能够显著地刺激细胞成骨分化，其中lcps
‑
cp的效果是最好的。
[0047]
实施例4：lcps对牙釉质的涂敷情况评价
[0048]
选择三个大小近似一致牛牙切片作为体外硬组织模型，分别加入25μm的实施例2中的lcps
‑
oh组的蛋白片段组装溶液、lcps
‑
op组的蛋白片段组装溶液、lcps
‑
cp组的蛋白片段组装溶液，然后孵育12h。通过bca(bca protein assay kit)试剂盒检测牙片吸附多肽的含量，如图7所示，结果显示3h内lcps
‑
op和lcps
‑
cp被牙片吸附的量明显多于lcps
‑
oh。孵育结束后，通过扫面电镜观测牙片表面形貌以及采用扫描电镜元素能谱分析表面元素分布，如图8所示，表面形貌显示lcps
‑
op组和lcps
‑
cp组的牙片表面明显形成一层涂敷的薄膜，而lcps
‑
oh组的牙片表面大多还是粗糙形貌，元素分析结果显示lcps
‑
oh组的牙片表面主要是p和ca，而lcps
‑
op组和lcps
‑
cp组的牙片表面主要是c，因此，lcsp
‑
op和lcps
‑
cp均可以充分涂敷在牙釉质表面。
[0049]
实施例5：lcps涂敷的缺失牙釉质的再矿化和修复情况评价
[0050]
缺失牙釉质通过37％的磷酸溶液刻蚀3分钟得到，通过实施例4中的方法将lcps
‑
oh、lcps
‑
op和lcps
‑
cp的蛋白片段组装溶液分别涂敷于其中三个缺失牙釉质上，另取一未涂敷的缺失牙釉质，以上4组均于37℃人工唾液中孵育6天后取出，然后置于超纯水中超声清洗3次每次3分钟，进一步将上述4组牙釉质和未矿化的缺失牙釉质进行扫描电镜测试、x射线衍射图谱检测和纳米压痕仪测试，其中，未矿化的缺失牙釉质(acid
‑
etched)和未作处理的空白牙釉质(blank enamel)用作对照。如图9a所示，sem形貌发现lcps
‑
op组和lcps
‑
cp组中的牙釉质上可以形成排列规则有序的晶体结构，其与天然的牙釉质非常相似，而其它
组没有类似的结果。如图9b所示，通过x射线衍射发现lcps
‑
op组和lcps
‑
cp组中显示出明显的羟基磷灰石的特征衍射峰。如图9c和图9d所示，结果表明lcps
‑
cp组和lcps
‑
op组修复的牙釉质在模量和硬度上与天然的牙釉质相当。因此，本发明中的lcps
‑
cp蛋白和lcps
‑
op单子对牙釉质有较佳的修复效果。
[0051]
实施例7：lcps涂敷的牙釉质对变形链球菌的抗黏附评价
[0052]
选择四个相似的无菌牙片，其中三个牙片分别涂覆lcps
‑
oh组、lcps
‑
op组、lcps
‑
cp组的蛋白片段组装溶液，另一个牙片不涂覆任何蛋白片段(no peptide)，四个牙片共同与变形链球菌共同培养24h，然后采用无菌水洗三次后，并选择无菌牙片作为空白对照组(without biofilm)，然后分别对四个牙片进行细菌死活染色后通过激光共聚焦显微镜(zeiss lsm780)拍摄成像获取z轴层扫图像，然后再通过zen software进行三维重建，如图10所示，lcps
‑
op和lcps
‑
cp涂敷的牙片上存留的细菌非常少，尤其是活菌。因此，lcps
‑
op和lcps
‑
cp均可以抑制链球菌的黏附。
[0053]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0054]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。