腺病毒抗原多肽及其应用的制作方法

1.本发明涉及免疫学领域，具体而言，涉及一种腺病毒抗原多肽及其应用。


背景技术：

2.人肠道腺病毒(human adenovirus，hadv)于1953年最早从人类的腺样组织分离出来，故名为腺病毒。其对淋巴腺有亲和力，可以在淋巴腺中潜伏很久。它们引起多种疾病，包括上呼吸道感染，结膜炎(眼部感染)，膀胱感染，肺炎，脑炎和肠胃炎。它们也与心脏病和肥胖症有关。
3.hadv包括两种型别hadv
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40和hadv
‑
41，是引起儿童病毒性腹泻的第二重要病原，目前没有特异性药物和疫苗，临床以支持、对症治疗为主。重组蛋白疫苗成本低、制备方便，目前已有多种重组蛋白疫苗在临床使用，但没有针对人肠道腺病毒的疫苗。
4.腺病毒衣壳主要包括纤毛蛋白、五邻体基座和六邻体，现有技术研究一般认为六邻体是腺病毒的主要中和抗原，而纤毛蛋白是吸附细胞的受体结合蛋白，是次要的中和抗原，其诱导中和抗体的能力较差，与受体结合的主要结构域位于纤毛蛋白头(knob)。腺病毒包括有7组52种血清型，不同血清型间没有交叉中和作用，包括hadv
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40和hadv
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41之间也没有交叉中和作用。本发明申请人之前已经发现并证明大肠杆菌表达系统分别重组表达人3型、7型、11型、55型腺病毒knob多肽，免疫小鼠可以诱导高滴度中和抗体，并发现其中一些型别的knob抗体有一定的交叉中和作用，可以作为多价腺病毒疫苗候选。
5.完整的hadv
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40和hadv
‑
41病毒粒子免疫只能诱导型特异性中和抗体，没有型间交叉保护作用；不同型别腺病毒基因组间易发生重组，可能产生毒力更强的新型腺病毒；人肠道腺病毒细胞培养困难，产量低；因此人肠道腺病毒难于研制传统的灭活或减毒活疫苗。因此如何研制一种能够同时预防hadv
‑
40和hadv
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41的高免疫原性、低成本的疫苗是我们要解决的问题。


技术实现要素：

6.本发明发明人在研究hadv
‑
40和hadv
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41两种腺病毒的基因组时，意外地发现hadv
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40和hadv
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41的长纤毛蛋白有非常较高的相似性，而短纤毛蛋白差异较大，推测长纤毛蛋白可能是受体结合蛋白，长纤毛蛋白的纤毛头部分(l
‑
knob)可能是受体结合结构域，可能作为亚单位疫苗候靶标。经过测试，由此提出本发明。具体的为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
7.本发明的第一方面涉及抗原多肽，其为seq id no：1和/或seq id no：2所示的多肽。
8.本发明的第二方面涉及分离的核酸，其表达权利要求1所述的抗原多肽。
9.可选的，如上所述的核酸，其为seq id no：3和/或seq id no：4所示的核苷酸片段。
10.本发明的第三方面涉及载体，其含有如上所述的核酸。
11.本发明的第四方面涉及宿主细胞，其含有如上所述的核酸，或被如上所述的载体所转化。
12.可选的，如上所述的宿主细胞，其为大肠杆菌。
13.本发明的第五方面涉及生产如上所述的抗原多肽的方法，包括：
14.在合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞；以及
15.从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的抗原多肽。
16.本发明的第六方面涉及疫苗，其含有如上所述的抗原多肽，或权利要求2或3所述的核酸，或权利要求4所述的载体。
17.可选的，如上所述的疫苗，其进一步包含佐剂。
18.本发明的第七方面涉及试剂盒，其包含如上所述的疫苗。
19.本发明的第八方面涉及如上所述的抗原多肽，或如上所述的核酸，或如上所述的载体，或如上所述的疫苗在制备用于预防hadv
‑
40和/或hadv
‑
41型腺病毒感染的药物中的应用。
20.与现有技术相比，本发明的有益效果为：
21.本发明所提供的抗原多肽制备简单，可以使用最简单的大肠杆菌表达系统进行表达，且表达knob多肽为三聚体结构，表达量高、免疫原性强，生产和纯化方便、成本低；knob多肽免疫原性强，可以诱导高滴度的中和抗体；最重要的是，hadv
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40l
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knob或hadv
‑
41l
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knob诱导的中和抗体对hadv
‑
40和hadv
‑
41有交叉中和作用，中和滴度相似，可以作为广谱人肠道腺病毒疫苗应用。
附图说明
22.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
23.图1为本发明一个实施例中腺病毒纤毛蛋白knob纯化产物sds
‑
page；r为煮沸样品，nr为未煮沸样品；
24.图2为本发明一个实施例中的细胞微量中和实验结果。
具体实施方式
25.现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
26.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
27.本发明涉及抗原多肽，其为seq id no：1和/或seq id no：2所示的多肽。
28.当同时含有seq id no：1和seq id no：2时，二者可以为混合物的形式使用，也可以融合蛋白的形式使用。
29.本发明所提供的抗原多肽制备简单，可以使用最简单的大肠杆菌表达系统进行表达，且表达knob多肽为三聚体结构，表达量高、免疫原性强，生产和纯化方便、成本低；knob多肽免疫原性强，可以诱导高滴度的中和抗体；最重要的是，hadv
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40l
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knob或hadv
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41l
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knob诱导的中和抗体对hadv
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40和hadv
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41有交叉中和作用，中和滴度相似，可以作为广谱人肠道腺病毒疫苗应用。
30.本发明所涉及的组分还包含与seq id no：1和seq id no：2所示的多肽实质上相似的多肽，例如与seq id no：1和seq id no：2所示的氨基酸序列具有至少约80％同一性、至少约90％同一性、至少约95％同一性、至少约96％同一性、至少约97％同一性、至少约98％同一性或至少约99％同一性的序列，优选保留各自的功能。
[0031]“实质上相似”氨基酸序列还可以为仅包括seq id no：1和seq id no：2所示的多肽的保守氨基酸置换。例如给定的氨基酸序列与参比序列共有至少85％、更优选至少90％和甚至更优选至少95％的同一性。此外，总的来说，仅描述或编码其中在保守区中作出仅保守置换的蛋白的序列实质上相似。优选地，实质上相似的序列亦保留多肽的独特活性。通常视为保守置换的置换是在脂肪族氨基酸ala、val、leu和ile中的彼此置换、羟基残基ser和thr的互换、酸性残基asp和glu的交换、酰胺残基asn和gln之间的置换、碱性残基lys和arg的交换以及芳香残基phe、tyr间的置换。
[0032]“实质上相似”氨基酸序列还可以为seq id no：1和seq id no：2所示的多肽的衍生物。术语“衍生物”是指化学修饰的蛋白质或多肽，其已经通过天然过程(诸如加工和其他翻译后修饰)还通过化学修饰技术，例如通过添加一个或多个聚乙二醇分子、糖、磷酸酯和/或其他这样的分子来进行化学修饰，其中一个或多个分子不是天然地附着到野生型蛋白质。衍生物包括盐。这样的化学修饰在基础教科书和更详细的专论中以及在大量研究文献中有详细描述，并且它们是本领域技术人员熟知的。应当理解，相同类型的修饰可以以相同或不同程度存在于给定蛋白质或多肽中的几个位点。此外，给定的蛋白质或多肽可以含有许多类型的修饰。修饰可发生在蛋白质或多肽中的任何位置，包括肽骨架，氨基酸侧链以及氨基或羧基末端。修饰包括例如乙酰化、酰化、adp
‑
核糖基化、酰胺化、共价连接黄素、共价连接血红素部分、共价连接核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接脂质或脂质衍生物、共价连接磷脂酰肌醇、交联、环化、形成二硫键、脱甲基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲基化、γ
‑
羧化、糖基化、形成gpi锚接、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰化、氧化、蛋白质酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、糖基化、脂质连接、硫酸化、谷氨酸残基的γ
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羧化、烃基化和adp
‑
核糖基化、硒化、硫酸化、蛋白质的氨基酸的传递rna介导加成(诸如精氨酰化)以及泛素化。它们还可以结合至维生素，例如生物素、叶酸或维生素b12。参见例如proteins
‑‑
structure and molecular properties,2nd ed.,t.e.creighton,w.h.freeman and company,new york(1993)和wold,f.,“posttranslational protein modifications：perspectives and prospects,”pgs.1
‑
12in posttranslational covalent modification of proteins,b.c.johnson,ed.,academic press,new york(1983)；seifter等人.,meth.enzymol.182：626
‑
646(1990)和rattan等人,“protein synthesis：posttranslational modifications and aging,”ann.n.y.acad.sci.663：48
‑
62 1992)。术语“衍生物”包括导致蛋白质或多肽在支链化或不支链化的情况下变成支链的或环状的化学修饰。环状、支链和支链圆形蛋白质或多肽可以从翻译后自然加工得来并且还可以完全由合成方法制成。在一些实施方式中，化合物可以共价连接至载体蛋白质，诸如血清白蛋白或其他血浆蛋白质。
[0033]
在一些实施方式中，所述融合多肽中还包括一个或多个连接肽。
[0034]
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸数目为1～30个；可以是1，2，3，4，5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个。
[0035]
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸是不具有除连接以外的额外功能(例如蛋白定位、酶切位点等)的无意义多肽。
[0036]
在一些实施方式中，所述连接肽为柔性连接肽；
[0037]
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自gly、ser、pro、ala以及glu中的一种或多种。
[0038]
在一些实施方式中，所述连接肽的氨基酸序列选自(ggggs)n、(gggs)n、(ggs)n、(gs)n或(g)n，其中n代表重复次数，选自1，2，3，4，5或6。
[0039]
连接肽通常是柔性的，可以减少融合蛋白与目的蛋白之间的空间位阻，从而更有利于蛋白正确折叠。
[0040]
在另外的实施方案中，连接肽是刚性接头肽；即相对非柔性肽接头。刚性连接肽不要求完全缺乏柔性，而是比柔性接头肽如富甘氨酸肽接头柔性少。由于其相对缺乏柔性，刚性连接肽降低通过刚性连接肽连接在一起的两个蛋白结构域(在当前情况下是稳定剂蛋白和热稳定逆转录酶)的运动。提供有序链(例如α螺旋结构)的连接肽可提供刚性接头肽。例如，精氨酸、亮氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺和甲硫氨酸都显示出相对高的螺旋接头结构倾向。然而，包含许多脯氨酸残基的非螺旋接头也可表现显著的刚性。刚性连接肽的实例包括聚赖氨酸和聚
‑
dl
‑
丙氨酸聚赖氨酸。刚性肽接头的进一步描述由wriggers等，biopolymers，80，第736
‑
46页(2005)提供。此外，刚性接头肽在由george等，protein engineering，15，第871
‑
79页(2003)描述的接头数据库中描述。优选地，刚性连接肽也是非可切割接头肽，即非可切割刚性连接肽。
[0041]
本发明还涉及分离的核酸，其表达如上所述的抗原多肽。
[0042]
核酸可以为rna或dna。
[0043]
在一些实施方式中，所述核酸是经过密码子优化的。
[0044]
在一些实施方式中，所述的核酸其为seq id no：3和/或seq id no：4所示的核苷酸片段。
[0045]
当同时含有seq id no：3和seq id no：4时，二者可以融合表达。
[0046]
根据本发明的一方面，还涉及载体，其含有如上所述的核酸。
[0047]
术语“载体(vector)”是指，可将多聚核苷酸插入其中的一种核酸运载工具。当载体能使插入的多核苷酸编码的蛋白获得表达时，载体称为表达载体。载体可以通过转化，转导或者转染导入宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞中获得表达。载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体，例如酵母人工染色体(yac)、细菌人工染色体(bac)或p1来源的人工染色体(pac)；噬菌体如λ噬菌体或m13噬菌体及动物病毒等。可用作载体的动物病毒包括但不限于，逆转录酶病毒(包括慢病毒)、腺
病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如sv40)。在一些实施方式中，本发明所述载体中包含基因工程中常用的调控元件，例如增强子、启动子、内部核糖体进入位点(ires)和其他表达控制元件(例如转录终止信号，或者多腺苷酸化信号和多聚u序列等)。
[0048]
在一些实施方式中，本发明所述载体中还可以包含筛选所用的基因(例如抗生素抗性基因)、用于生成荧光蛋白的核酸等片段。荧光蛋白可以选择绿色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白、黄色荧光蛋白、橙色荧光蛋白或红色荧光蛋白。
[0049]
绿色荧光蛋白可以采用常见的gfp，也可以采用经过改造后的gfp基因，例如增强型gfp基因egfp等；蓝色荧光蛋白可以选自ebfp、azuritc、tagbfp等；黄色荧光蛋白可以选自eyfp、ypct、phiyfp等；橙色荧光蛋白可以选自mko、morange、mbanana等；红色荧光蛋白可以选自tagrfp、mruby、mcherry、mkate等。
[0050]
本发明还涉及宿主细胞，其含有如上所述的核酸，或被如上所述的载体所转化。
[0051]
术语“宿主细胞”是指，可用于导入载体的细胞，其包括但不限于，如大肠杆菌或枯草菌等的原核细胞，如酵母细胞或曲霉菌等的真菌细胞，如s2果蝇细胞或sf9等的昆虫细胞，或者如纤维原细胞，cho细胞，cos细胞，nso细胞，hela细胞，bhk细胞，hek 293细胞或人细胞等的动物细胞。宿主细胞优选为原核细胞，更优选为大肠杆菌。
[0052]
本发明还涉及生产如上所述的抗原多肽的方法，包括：
[0053]
在合适的培养条件下培养如上所述的宿主细胞；以及
[0054]
从培养基中或从所培养的宿主细胞中回收如此产生的抗原多肽。
[0055]
本发明还涉及疫苗，其含有如上所述的抗原多肽，或如上所述的核酸，或如上所述的载体。
[0056]
疫苗可以是溶液形式存在的，也可以是干粉状的，优选为冻干粉。
[0057]
在一些实施方式中，所述疫苗进一步包含佐剂。
[0058]
如本文所使用，“佐剂”是这样的物质，其能够有利于或放大免疫学事件级联，最终导致更好的免疫应答，即针对抗原的整合的身体应答。佐剂通常不是免疫应答发生所需的，但有利于或放大该应答。
[0059]
适用于本发明疫苗的佐剂包括可增强针对上述抗原肽的免疫反应的佐剂，优选的能够激活树突状细胞(dc)或者t细胞(特别是ctl细胞)的活性以使其更容易产生免疫应答，所述佐剂能够这些佐剂是本领域所熟知的。
[0060]
佐剂可以为铝盐、脂质体、不完全弗氏佐剂、完全弗氏佐剂、明矾佐剂、mf59、单磷酰脂质a、鞭毛蛋白、cpg
‑
odn以及poly(i：c)中的至少一种。优选的佐剂是适用于人的。在一些实施方案中，所述铝盐选自磷酸铝、磷酸铝钾和氢氧化铝。其他众所周知的佐剂包括烃油、聚合物、皂苷类和/或由水中的丙烯酸钠的凝胶颗粒构成的佐剂，例如，montanidetm pet gel atm(seppic,paris france)。一种低分子量共聚物佐剂可以在溶液中形成交联以变成高分子量凝胶，例如polygentm(mvplaboratories,omaha)。当添加时，疫苗中的佐剂的量通常在约1％～20％(v/v)之间。在具体实施方案中，所述佐剂的量在约2％～10％(v/v)之间。在更具体实施方案中，所述佐剂的量在约3％～6％(v/v)之间。
[0061]
在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的油包水乳液。
[0062]
在一些实施方式中，所述疫苗是具有水相和油相的水包油乳液。
[0063]
疫苗典型地被配制用于肠胃外施用。典型的免疫接种是通过皮下(sc)或肌内(im)注射实现，但本发明还考虑了鼻腔途径的疫苗接种、或者口腔、静脉内(iv)、腹膜内(ip)或真皮内(id)注射实现。或者，所述疫苗还可以经由皮肤贴剂、在延迟释放植入物中、划痕或局部施用进行施用。还可以经由受体动物/人的饮用水和/或食物进行施用。
[0064]
上述疫苗是以与剂量配方相容的方式，以及诸如治疗有效量和免疫原性有效量的用量被施用的。施用量取决于接受治疗的对象、该对象的免疫系统合成抗体的能力，以及预期的保护程度。需施用的活性成分的准确数量取决于医师的判断，个体不同，用量也不同。最初施用和加强接种的合适方案也可变化，但典型地在首次施用后的一定间隔时间(数周或数月)后再进行1次注射或以其它方式施用。
[0065]
疫苗也可以通过递送系统将抗原肽、核酸或载体运送到受试者体内。非病毒递送核酸的方法包括脂转染，核转染，微注射，生物射弹，病毒体，脂质体，免疫脂质体，聚阳离子或脂质:核酸缀合物，裸dna，人工病毒粒子和dna的试剂增强摄取。
[0066]
病毒递送核酸的方法可以直接施用到所述主体或可以用于体外处理细胞(特别是免疫细胞)，且可以任选地将被处理的细胞施用到所述主体。
[0067]
疫苗中还可以包含药学上可接受的载体。
[0068]“药学上可接受的载体”意在帮助疫苗的稳定和施用，同时无害且被目标良好耐受。此类载体可以例如是无菌水或无菌生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体可以例如是缓冲液，其可以包含进一步的添加剂，例如稳定剂或防腐剂。水或水溶液盐水溶液和糖(例如，右旋糖和/或甘油)水溶液可以用作载体，特别是用于可注射溶液。此外，所述载体可以是和/或包含水胶体和/或聚合物溶液，例如，以使疫苗变稠。
[0069]
在一些实施方式中，所述的疫苗进一步包含灭活的病毒和/或灭活的细菌(例如菌苗)和/或菌苗的抗原。
[0070]
本发明还涉及试剂盒，其包含如上所述的抗原肽，或如上所述的核酸，或如上所述的载体，或如上所述的疫苗。
[0071]
所述试剂盒还可以包含用于接种所述疫苗的容器。接种容器优选为医用注射器。
[0072]
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如，包装或容器)。试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
[0073]
本发明还涉及如上所述的抗原多肽，或如上所述的核酸，或如上所述的载体，或如上所述的疫苗在制备用于预防hadv
‑
40和/或hadv
‑
41型腺病毒感染的药物中的应用。
[0074]
本发明进一步提供了保护受试者免于hadv
‑
40和/或hadv
‑
41型腺病毒感染的方法，其包括给所述受试者施用有效量的根据本发明的抗原肽、核酸、载体或疫苗。
[0075]
在一些实施方式中，所述受试者为动物，优选哺乳动物，例如牛、猪、犬、猫、羊、大鼠、小鼠、兔、马。受试者进一步优选为灵长类动物，更优选为人。
[0076]
本发明中所述的术语“有效量”是指该术语所对应的组分在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解本发明中所述疾病或病症的剂量。
[0077]
影响优选剂量方案的因素可以包括例如主体的物种或品种(例如受试者的物种或品种)、年龄、重量、饮食、活动、肺大小，和状况；施用途径；使用的特定疫苗的功效、安全性和免疫持续时间概况；是否使用递送系统；以及疫苗是否作为药物和/或疫苗组合的一部分
施用。因此，实际上采用的剂量可以对于特定动物不同，并且因此可以偏离上文所述的典型剂量。这样的剂量调整的确定通常在使用常规方法的疫苗开发领域技术人员的技术内。
[0078]
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
[0079]
本实施例分别克隆hadv
‑
40和hadv
‑
41的l
‑
knob基因，根据不同的表达系统进行基因密码子优化后克隆入不同的表达载体，包括原核表达载体pqe30中，转化bl21(de3)进行表达，收集细菌，溶菌酶裂解，用镍柱进行纯化；昆虫细胞
‑
杆状病毒表达系统pfastbac载体，在昆虫细胞sf9中进行表达；pcdna3.1载体，在哺乳动物细胞cho中进行表达。纯化的蛋白表现为同源三聚体结构，纯化后免疫小鼠可以诱导高效价中和抗体，可以作为腺病毒疫苗候选；最终发现抗hadv
‑
40l
‑
knob血清能以相似高效价中和hadv
‑
40和hadv
‑
41；hadv
‑
41l
‑
knob血清也能以相似高效价中和hadv
‑
40和hadv
‑
41，hadv
‑
40l
‑
knob和hadv
‑
41l
‑
knob可以作为hadv
‑
40和hadv
‑
41双价肠道腺病毒疫苗候选。
[0080]
实施例1重组人腺病毒knob多肽的表达
[0081]
本说明书实施例中所述hadv
‑
40病毒株(dugan株)全基因组序列genbank号：nc_001454.1；hadv
‑
41病毒株(tak株)全基因组序列genbank号：dq315364.2。本说明书实施例中knob基因和这些病毒株一致，氨基酸序列无突变；本实施例中中和实验等也使用这些毒株。
[0082]
hadv
‑
40、hadv
‑
41的long fiber的knob基因(l
‑
knob)进行密码子优化以适应大肠杆菌表达，基因合成后克隆入原核表达载体pqe30中，转化bl21(de3)进行低温诱导表达，收集细菌，pbs缓冲液(1mm edta，10％甘油，1％triton x100，10mm咪唑)重悬，溶菌酶裂解细菌，高速离心后取上清，用镍柱进行纯化，用梯度咪唑进行洗涤和洗脱，10kda超滤管离心去咪唑；纯化的蛋白表现为同源三聚体结构。
[0083]
氨基酸序列
[0084]
hadv
‑
40l
‑
knob:
[0085]
gsiavspttttpttlwttadpspnatfyesldakvwlvlvkcngmvngtisikaqkgtllkptasfisfvmyfysdgtwrknypvfdnegilansatwgyrqgqsantnvsnavefmpsskrypnekgsevqnmaltytflqgdpnmaisfqsiynhaiegyslkftwrvrnnerfdipccsfsyvteq(seq id no：1)
[0086]
大肠杆菌密码子优化后基因碱基序列：
[0087]
ggtagcatcgccgtgagtccaaccacgaccacccctacgacactgtggacgaccgctgatcctagcccgaatgccacgttttatgaatcattagatgctaaagtttggttagtgttagttaaatgtaatggcatggttaatggtaccatctctatcaaagcccagaaaggcacactgctgaaaccgacagcgagctttattagctttgtgatgtatttttatagtgatggtacctggcgtaaaaattatccggtgtttgataatgaaggtattctggccaatagcgcaacctggggctatcgtcagggtcagagtgccaatacaaatgtgtctaatgcggtggaatttatgccgtcaagtaaacgctatccgaatgaaaaaggctcagaagttcagaatatggccttaacgtatacatttttgcaaggcgatcctaatatggcaatctcatttcagagcatctataatcatgcgatcgaaggctatagtctgaaatttacgtggcgcgttcgcaataatgaacgctttgatattccttgttgcagcttttcttatgtgacggaacag(seq id no：3)
[0088]
hadv
‑
41l
‑
knob：
[0089]
gsitvspttttpttlwttadpspnatfyesldakvwlvlvkcngmvngtisikaqkgillrptasfisfvmyfysdgtwrknypvfdnegilansatwgyrqgqsantnvsnavefmpsskrypnqkgsevqnmaltytflqgdpnmaisfqsiynhalegyslkftwrvrnnerfdipccsfsyvteq(seq id no：2)
[0090]
大肠杆菌密码子优化后基因碱基序列：
[0091]
ggtagtatcacggtgtcaccgaccacaacgacacctaccacactgtggacgacagcagatccgtctccgaatgcgacgttttatgaatcattagatgctaaagtttggttagtgctggttaaatgtaatggcatggttaatggtacgatctcaatcaaagcccagaaaggcatcttactgcgtcctaccgcttcatttattagctttgtgatgtatttttatagcgatggtacgtggcgtaaaaattatccggtgtttgataatgaaggcattctggccaattcagcaacctggggctatcgccagggtcagagcgccaatacaaatgtgagcaatgccgtggaatttatgccgagttctaaacgctatcctaatcagaaaggctctgaagtgcagaatatggccttaacatatacatttttgcagggtgatccgaatatggcgattagctttcagtctatctataatcatgcactggaaggttatagtctgaaatttacgtggcgcgttcgcaataatgaacgctttgatattccttgttgctcatttagttatgtgacggaacag(seq id no：4)
[0092]
实施例2：重组蛋白免疫原性试验
[0093]
为分析重组蛋白的免疫原性，我们用重组蛋白加磷酸铝佐剂(1：1)乳化后免疫小鼠，共免疫3次，每只小鼠每次免疫40ug蛋白，末次免疫7天后采集血清，进行elisa检测和细胞微量中和实验。重组knob免疫小鼠均能诱导出高滴度抗体应答，血清中和抗体滴度大于4608。表1和图2结果表明hadv
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40和hadv
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41的l
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knob抗血清可以交叉中和hadv
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40和hadv
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41。
[0094]
表1.细胞微量中和实验检测血清中和抗体效价
[0095][0096]
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
[0097]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。