基于金属钛离子亲和色谱的核酸-蛋白复合物提取方法与流程

基于金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法
技术领域
1.本发明涉及核酸结合蛋白领域，具体是涉及一种基于金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法。


背景技术：

2.核酸结合蛋白(nabps)既是基因表达的产物，又是基因表达过程中的调节者，它们在复制、转录和翻译水平上发挥着重要作用，从而决定细胞的命运和功能(hentze,castello et al.2018)。nabps的异常表达与癌症在内的许多疾病的发生和发展密切相关，如肺癌(shang,qian et al.2018)、乳腺癌(neelamraju,gonzalez
‑
perez et al.2018)、胶质瘤(wang,tang et al.2020)以及口腔癌(weisse,rosemann et al.2020)等。
3.nabps包括rna结合蛋白(rbps)和dna结合蛋白(dbps)。近年来，dbps和rbps之间的界限日益模糊，比如一些蛋白质可以同时结合dna和rna来促进三维基因组中的相互作用。因此，全面绘制核酸结合蛋白质组(nabpome)图谱可以揭示生物过程中和病理情况下核酸
‑
蛋白相互作用网络。
4.目前对nabps的分离主要依赖不同的纳米材料(包括一维纳米碳纳米管和二维纳米石墨烯)。利用纳米材料与核酸之间的之间强π
‑
π堆叠作用吸附核酸从而富集nabps。但其缺点在于分离nabps的选择性很低，分别只有12％和42％，因此导致了不能全面地分析鉴定nabpome。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种基于金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法。
6.本发明采用ti
4
‑
imac用于富集核酸及交联至其上的核酸结合蛋白，核酸结合蛋白被甲醛交联至核酸上，原本应该在上相的rna迁移至中间相，再用异丙醇沉淀中间相和有机相得到核酸
‑
蛋白复合物。
7.本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
8.本发明涉及一种基于金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法，所述方法包括如下步骤：
9.s1、收集对数生长期细胞，用甲醛交联；加入甘氨酸淬灭交联，然后离心收集细胞；
10.s2、用trizol裂解s1所得的细胞；再加入氯仿分相；在中间相和有机相中加入异丙醇后离心，将细胞膜、脂质小分子去除，离心得到沉淀即为核酸
‑
蛋白复合物的粗提物；
11.s3、利用ti
4
‑
imac与核酸上磷酸基团之间的相互作用捕获核酸
‑
蛋白复合物，在碱性环境中洗脱；
12.s4、将步骤s3得到的核酸
‑
蛋白复合物解交联后，对得到的核酸结合相关蛋白进行蛋白质组学分析。
13.作为本发明的一个实施方案，步骤s1中，所述甲醛交联的交联条件为4
‑
37℃，终浓
度0.1
‑
1.0％，1
‑
30分钟。
14.作为本发明的一个实施方案，所述甲醛交联的交联条件为37℃，0.1
‑
1.0％终浓度，10分钟。
15.作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述trizol和氯仿的体积比为1：1
‑
10：1。
16.作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述异丙醇的加入量为中间相和有机相总体积的1
‑
9倍。
17.作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述离心的温度为4
‑
20℃，离心的离心力为10000
‑
20000g，离心的时间为5
‑
30分钟。
18.作为本发明的一个实施方案，步骤s2中，所述离心的温度为4℃，离心的离心力为12000g，离心的时间为10分钟。
19.作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述捕获的步骤包括：将沉淀物充分溶解在sds中；再按照核酸和ti
4
‑
imac质量比为1：10
‑
1：60的比例加入ti
4
‑
imac，震荡孵育30min
‑
2h后，洗涤，再采用10000
‑
20000g的离心力离心5
‑
30min，弃去上清液即可。
20.作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述捕获的步骤包括：用移液器吸头反复吹吸沉淀物，使之充分溶解在sds中；再按照核酸和ti
4
‑
imac质量比为1：10
‑
1：60的比例加入ti
4
‑
imac，震荡孵育30min
‑
2h后，洗涤液洗两次，再采用10000
‑
20000g的离心力离心5
‑
30min，弃去上清液即可。
21.作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述捕获的步骤包括：用移液器吸头反复吹吸沉淀物，使之充分溶解在sds中；再按照核酸和ti
4
‑
imac质量比为1：10
‑
1：60的比例加入ti
4
‑
imac，震荡孵育1h后，洗涤液洗两次，再采用12000g的离心力离心5min，弃去上清液即可。
22.作为本发明的一个实施方案，所述sds的体积浓度为0.05
‑
0.5％。
23.本发明选择sds的体积浓度为0.05
‑
0.5％，若sds的体积浓度小于0.05％，则使得ti
4
‑
imac同时吸附磷酸化蛋白和核酸(dna)，带来非特异性吸附；若sds的体积浓度大于0.5％，则会使得ti
4
‑
imac几乎不吸附核酸(dna)。
24.作为本发明的一个实施方案，所述洗涤采用的洗涤液为50
‑
500mm nacl,10
‑
100mm tris
‑
cl,0.2
‑
1.0mm edta和0.1％
‑
1％np
‑
40的混合液。其中，0.1％
‑
1％np
‑
40是指以洗涤液的总体积为计，np
‑
40的体积浓度为0.1％
‑
1％。
25.作为本发明的一个实施方案，所述洗涤液为100mm nacl,20mm tris
‑
cl,0.5mm edta和0.5％np
‑
40的混合液。
26.作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述洗脱方法为在nh3·
h2o震荡后进行冰浴超声。
27.作为本发明的一个实施方案，步骤s3中，所述洗脱方法为在10％nh3·
h2o震荡15min后，冰浴超声15min。
28.作为本发明的一个实施方案，步骤s4中，所述解交联条件为56℃
‑
70℃、8
‑
12h。
29.作为本发明的一个实施方案，步骤s4中，所述解交联条件为65℃、8
‑
12h。
30.与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
31.1、本发明利用有机相分离方法代替传统裂解法获得粗提物，不仅能够去除细胞中膜、脂质小分子，还能使核酸
‑
蛋白复合物中蛋白变性，从而将核酸暴露出来。
32.2、本发明利用ti
4
‑
imac与核酸上磷酸根基团的特异性相互作用，用ti
4
‑
imac进一步捕获核酸
‑
蛋白复合物。本发明对核酸结合蛋白的富集具有较高的选择性和特异性，在293t细胞系中鉴定的蛋白中有62％为nabps，包括417个dbps和999个rbps。且在应用于具有不同转移能力的肺癌细胞系95c和95d，发现不同的nabps可能在不同的癌症进展阶段与核酸特异性结合。因此，本技术作为一种广泛应用的工具，可以全面地揭示核酸和蛋白质在细胞环境中的真实相互作用，为研究核酸和蛋白质的动态变化提供了一个新的视角。
附图说明
33.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
34.图1为实施例1制备方法的步骤流程示意图；
35.图2为琼脂糖凝胶电泳图，其中左图(a)为采用对比例2的方法裂解后，ti
4
‑
imac捕获核酸
‑
蛋白复合物情况；右图(b)为采用实施例1的方法裂解细胞后，有机相分离法获得核酸
‑
蛋白复合物粗提物；
36.图3为实施例1得到蛋白的蛋白质组学分析(a)对比例1(ncl)和实施例1(cl)中ti
4
‑
imac捕获到的蛋白数量韦恩图，；(b)实施例1中dbps、rbps和nabps富集倍数分布图；(c)实施例1中ti
4
‑
imac捕获到的蛋白kegg通路图；
37.图4为实施例2应用于肺癌细胞系dbps、rbps和nabps富集情况，其中(a)为95c中dbps、rbps和nabps富集情况，(b)为95d中dbps、rbps和nabps富集情况，(c)为95c和95d中nabps富集倍数数量变化；
38.图5全细胞裂解液、有机粗提蛋白和实施例1的方法所捕获蛋白中nabps比例分布；
39.图6为对比例4中不同捕获缓冲液中ti
4
‑
imac对dna和α
‑
casein的吸附效率；
40.图7为对比例5中不同sds浓度下中ti
4
‑
imac对dna和α
‑
casein的吸附效率。
具体实施方式
41.下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。
42.实施例1
43.图1为实施例1制备方法的步骤流程示意图：
44.s1：甲醛交联
45.取对数生长期hek293t细胞(5
×
106个/盘)，pbs洗涤两次后，加入9ml终浓度0.2％的甲醛，在37℃下交联5min后加入45μl浓度2.5m的甘氨酸终止交联；弃去交联溶液，pbs再次洗涤两次，收集交联细胞。
46.s2：trizol法裂解细胞，相分离后获得核酸
‑
蛋白复合物的粗提物
47.交联后的细胞中加入1ml trizol裂解液，反复吹打，裂解5min。向上述裂解液中加入0.2ml氯仿，剧烈震荡15s，室温静置5min，4℃，12000g离心10min。离心后混合物可分3层，小心吸取上层水相至新离心管中，在中间相和有机相中加入等体积异丙醇，颠倒混匀后室
温放置10min，在4℃下，以12000g离心力离心15min，小心弃去上清；加入1ml 75％乙醇，涡旋充分洗涤，并在4℃下，以7500g的离心力离心5min，弃上清。
48.s3：加入0.1％sds复溶s2中粗提的核酸
‑
蛋白复合物，55℃加热20min充分溶解。加入600μg ti
4
‑
imac捕获核酸
‑
蛋白复合物。在重溶的粗提核酸
‑
蛋白复合物中加入ti
4
‑
imac材料，震荡吸附60min，使核酸
‑
蛋白复合物充吸附在材料上。捕获结果如图2所示。再用500μl洗涤液(100mm nacl,20mm tris
‑
cl,0.5mm edta and 0.5％np
‑
40)清洗材料3次，去除非特异性吸附。再用100μl洗脱液(10％nh3·
h2o)洗脱2次，使用30kda超滤管将溶解体系置换为nh4·
hco3，得到的核酸
‑
蛋白复合物。
49.其中，图2为琼脂糖凝胶电泳图，其中左图(a)为采用对比例2的方法裂解后，ti
4
‑
imac捕获核酸
‑
蛋白复合物情况；右图(b)为采用实施例1的方法裂解细胞后，有机相分离法获得核酸
‑
蛋白复合物粗提物。
50.s4：蛋白质组学分析。将s3中得到的得到的核酸
‑
蛋白复合物65℃，过夜解交联，得到核酸结合相关蛋白，利用质谱技术进行免标记定量蛋白质组学分析。
51.图3为实施例1得到蛋白的蛋白质组学分析(a)对比例1(ncl)和实施例1(cl)中ti
4
‑
imac捕获到的蛋白数量韦恩图，；(b)实施例1中dbps、rbps和nabps富集倍数分布图；(c)实施例1中ti
4
‑
imac捕获到的蛋白kegg通路图。
52.由图3(a
‑
b)可知，采用实施例1的方法鉴定到2000个蛋白，大约70％的nabps都得到显著富集，主要参与dna复制、rna转运等生物学过程图3(c)，如此可说明本实施例1的方法的高选择性和可靠性。
53.实施例2
54.一种金属钛离子亲和色谱的核酸
‑
蛋白复合物提取方法，将实施例1的提取方法应用在肺癌细胞系95c和95d中。
55.图4为实施例2应用于肺癌细胞系dbps、rbps和nabps富集情况。如图4所示，表明该方法对肺癌细胞系中的dbps、rbps和nabps均可以显著富集。
56.对比例1
57.本对比例和实施例1的提取方法基本相同，区别仅在于未经过s1甲醛交联处理。
58.由图3(a)可知，未经过s1甲醛交联处理鉴定到蛋白数量仅有270。
59.对比例2
60.本对比例和实施例1的提取方法基本相同，区别仅在于未经过s2处理(直接采用s3，用细胞裂解液(sds)裂解交联细胞)。
61.如图2(a)所示，ti4

‑
imac不能完全捕获核酸
‑
蛋白复合物。
62.对比例3
63.本对比例对比了采用全细胞裂解液及仅有机法粗提((仅有机法即不采用实施例1中的s3)以及实施例1所记载的方法等三种方法所捕获蛋白中nabps比例分布情况。
64.图5全细胞裂解液、有机粗提蛋白和实施例1的方法所捕获蛋白中nabps比例分布。由图5可知，全细胞裂解液和仅有机法粗提得到的蛋白中nabps的比例明显少于采用实施例1的方法所捕获的nabps。
65.对比例4
66.本对比例和实施例1的区别仅在于，s3中的捕获缓冲液不采用sds，采用tfa，np
‑
40
和ddh2o。图6为对比例4中不同捕获缓冲液中ti
4
‑
imac对dna和α
‑
casein的吸附效率。如图6所示，s3中的捕获缓冲液不采用sds，采用tfa和ddh2o，显示ti
4
‑
imac会同时吸附磷酸化蛋白和核酸(dna)，带来非特异性吸附；采用np
‑
40，结果显示ti
4
‑
imac几乎不吸附核酸(dna)。
67.对比例5
68.本对比例和实施例1的区别仅在于s3中的sds的浓度为1％。图7为对比例5中不同sds浓度下中ti
4
‑
imac对dna和α
‑
casein的吸附效率。如图7所示，如果s3中的sds的浓度为1％，结果显示ti
4
‑
imac几乎不吸附核酸(dna)。
69.以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本技术的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。