具有中和活性的抗人CD146单克隆抗体及其应用的制作方法

具有中和活性的抗人cd146单克隆抗体及其应用
技术领域
1.本发明涉及用于预防和/或治疗肿瘤生长、转移的新型抗体，具体而言，本发明涉及一种靶向cd146的抗体。


背景技术：

2.生物技术药物包括抗体药物、小分子化学药、疫苗、蛋白质与多肽药物、基因治疗和细胞治疗药物，目前处于临床iii期研究的在研新药中，单抗药物占大约50％，抗体药物逐渐占据较大的市场份额。抗体药物广泛地用于治疗癌症、自身免疫病、感染疾病、心血管疾病等。
3.单克隆抗体是只作用于单一抗原表位的高度靶向特异性抗体，已被广泛用于许多疾病的治疗，例如，癌症、炎症和自身免疫性疾病、感染性疾病等，尤其是在癌症的化疗失效后，这种靶向特异性药物尤为重要。
4.cd146又称黑色素瘤细胞黏附分子，是一种单次跨膜糖蛋白受体，属于免疫球蛋白超家族(igsf)。cd146作为非ca
2
依赖性细胞黏附分子(cell adhesion molecule，cam)，参与异嗜性细胞间及细胞与细胞外基质间黏附作用，与肿瘤发生及转移密切相关。在正常的成熟组织中，cd146分子的表达水平很低，血管生成处于沉默状态。肿瘤微环境中的诱导因子促进cd146阳性内皮细胞的增殖和成管腔，促进肿瘤血管生成，为肿瘤细胞的生长提供必需的营养同时为转移提供便利。肿瘤细胞表面的cd146与胞外基质以及胞内细胞骨架蛋白结合，促进细胞骨架重排从而促进肿瘤细胞的迁移。总之，cd146参与了肿瘤细胞的黏附、转移、血管及新病灶的生成。已经证实cd146与黑素瘤、前列腺癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、绒毛膜上皮癌、骨肉瘤等的发生发展密切相关。此外，已有文献报道cd146还表达于血管周细胞、激活的淋巴细胞、神经细胞、人体滋养层细胞及早期胚胎上。
5.中国专利cn1124284c公开了一种高效广谱抑制肿瘤生长和转移的cd146抗体，包括鼠单克隆抗体aa98、人-鼠嵌合抗体chiaa98以及其fab和fv功能片段，其能特异性识别肿瘤新生血管，具有诱发adcc和cdc的能力，能够特异而广谱地抑制肿瘤的生长和转移。在炎症性肠道疾病中，cd146通过促进血管增生，辅助促炎症反应的淋巴细胞的外溢从而促进炎症的发展。aa98抗体能显著改善肠炎的症状，抑制小鼠中结直肠癌的发生。(xing et al.targeting endothelial cd146 attenuates colitis an prevents colitis-associated carcinogenesis,am j pathol 2014,184:1604-1616)。
6.该抗体存在与抗原cd146亲和力低等不足之处，本领域仍存在对更高效的靶向cd146的抗体的需求。


技术实现要素：

7.本发明的第一方面涉及一种分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物，其来源于aa98抗体并具有针对cd146的至少8
×
10-10
m的亲和力，例如至少7
×
10-10
m、6.5
×
10-10
m、6
×
10-10
m、5.5
×
10-10
m、5
×
10-10
m、4.5
×
10-10
m、4
×
10-10
m、3.5
×
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m、3
×
10
-
10
m、2.5
×
10-10
m、2
×
10-10
m、1.8
×
10-10
m、1.6
×
10-10
m、1.5
×
10-10
m、1.4
×
10-10
m或更高；任选地，其还具有大于40％的抑制内皮细胞的成管腔的能力，例如大于45％、50％、55％、60％、65％或更高，和/或大于60％的抑制内皮细胞迁移的能力，例如大于65％、70％、75％、80％、85％或更高。所述aa98抗体的轻链核苷酸序列如seq id no.2所示，重链核苷酸序列如seq id no.3所示，重链氨基酸序列如seq id no.6所示，轻链氨基酸序列如seq id no.7所示，重链可变区氨基酸序列如seq id no.4所示，轻链可变区氨基酸序列如seq id no.5所示，fab的轻重链氨基酸序列分别如seq id no.8和16所示，scfv的氨基酸序列如seq id no.9所示，重链cdr1-3的氨基酸序列分别如seq id no.10-12所示，轻链cdr1-3的氨基酸序列分别如seq id no.13-15所示。
8.在一些实施方案中，所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物相对于aa98抗体在轻链的i31、s32和/或l51和/或重链的i28、i57和/或y59具有亲水性氨基酸残基的取代突变；优选地，所述亲水性氨基酸残基选自arg、asn、asp、gln、glu、his、lys和tyr；更优选地，所述轻链的取代突变选自i31e、s32t、l51y、l51h和/或所述重链的取代突变选自i28k、i57e、y59r。
9.在一些实施方案中，所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物的cdr序列如下所示或在如下所示序列的基础上有一个或2个保守取代：
10.重链cdr1：sgyiftnyw(seq id no.10)，和/或
11.重链cdr2：ypgtdity(seq id no.11)，和/或
12.重链cdr3：sggywyfdv(seq id no.12)，和/或
13.轻链cdr1：asksvsisgysym(seq id no.13)，和/或
14.轻链cdr2：iylasnl(seq id no.14)，和/或
15.轻链cdr3：hsrelpytfgg(seq id no.15)，
16.优选地，其包含所述6个cdr。
17.在一些实施方案中，所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物的重链可变区序列与seq id no.4所示的序列具有至少95％但不是100％的序列同一性或与seq id no.4所示序列相比具有至少一个氨基酸取代，例如至少约96％、97％、98％或99％，例如至少2、3、4、5个或更多个氨基酸取代，优选保守取代，和/或其轻链可变区序列与seq id no.5所示的序列具有至少95％但不是100％的序列同一性或与seq id no.5所示序列相比具有至少一个氨基酸取代，例如至少约96％、97％、98％或99％，例如至少2、3、4、5个或更多个氨基酸取代，优选保守取代。所述氨基酸取代不会破坏所述分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物与其抗原的结合。
18.在一些实施方案中，所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物的重链氨基酸序列与seq id no.6所示的序列具有至少95％但不是100％的序列同一性或与seq id no.6所示序列相比具有至少一个氨基酸取代，例如至少约96％、97％、98％、99％、99.3％、99.6％或99.8％，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个氨基酸取代，优选保守取代，和/或所述抗cd146抗体的轻链氨基酸序列与seq id no.7所示的序列具有至少95％但不是100％的序列同一性或与seq id no.6所示序列相比具有至少一个氨基酸取代，例如至少约96％、97％、98％、99％或99.5％，例如至少2、3、4、5、6个或更多个氨基酸取代，优选保守取代。所述氨基酸取代不会破坏所述分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其
变体或其衍生物与其抗原的结合。
19.在一些实施方案中，所述抗cd146抗体选自igg、iga、igm或ige，优选地，所述抗cd146抗体是igg，更优选地，所述抗cd146抗体是igg2亚型；和/或抗原结合片段选自sdr、cdr、fv、dab、fab、fab2、fab'、(fab')2、fd、scfv、纳米抗体，例如fab的序列与seq id no.8和16所示序列具有至少95％但不是100％的序列同一性或与seq id no.8和16所示序列相比具有至少一个氨基酸取代，例如至少约96％、97％、98％、99％、99.5％序列同一性，例如至少2、3、4、5或更多个氨基酸取代，例如scfv的序列与seq id no.9所示序列具有至少95％但不是100％的序列同一性或与seq id no.9所示序列相比具有至少一个氨基酸取代，例如至少约96％、97％、98％、99％、99.2％、99.6％序列同一性，例如至少2、3、4、5、6或更多个氨基酸取代；和/或变体序列是与上述抗体或其抗原结合片段具有至少80％序列同一性的变体序列，或经删除、替换和/或添加一个或多个氨基酸残基后获得的保留相应母体序列生物活性的变体序列，例如至少约96％、97％、98％、99％，例如至少2、3、4、5、6或更多个氨基酸取代；和/或衍生物选自来源于完整抗体的嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、重组抗体、双特异抗体、包含修饰的氨基酸的产物、偶联到聚合物的产物、包含放射性标记的产物、包含荧光标记的产物、包含酶标记物的产物、包含化学发光物的产物、包含顺磁标记的产物。所述的分离的抗cd146抗体的抗原结合片段、变体或衍生物具有与所述的分离的抗cd146抗体相似或相同的性质。
20.在一些实施方案中，所述抗cd146抗体的重链氨基酸序列选自seq id no.17、19、21、23、25、27、29或31，轻链氨基酸序列选自seq id no.18、20、22、24、26、28、30或32。在进一步的实施方案中，所述抗cd146抗体是由下述序列组合组成的抗体：seq id no.17和18，seq id no.19和20，seq id no.21和22，seq id no.23和24，seq id no.25和26，seq id no.27和28，seq id no.29和30，或seq id no.31和32。在更进一步的实施方案中，所述抗cd146抗体是由下述序列组合组成的抗体：seq id no.17和18，seq id no.27和28，seq id no.29和30，或seq id no.31和32。在一个实施方案中，所述抗cd146抗体是由seq id no.17和18所示序列组成的抗体。
21.本发明的第二方面涉及如上述第一方面所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物的编码核苷酸序列。
22.本发明的第三方面涉及包含上述第二方面所述的编码核苷酸序列的重组载体。
23.本发明的第四方面涉及包含第二方面所述的编码核苷酸序列或第三方面所述的重组载体的细胞。
24.本发明的第五方面涉及一种组合物，其包含第一方面所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物，和/或第二方面所述的编码核苷酸序列，和/或第三方面所述的重组载体，和/或第四方面所述的细胞。
25.本发明的第六方面涉及一种生产第一方面所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物的方法，其包括步骤：将第四方面所述的细胞在适合所述抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物表达的培养条件下表达，任选地，分离、纯化所得的产物。
26.本发明的第七方面涉及第一方面所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物，第二方面所述的编码核苷酸序列，第三方面所述的重组载体，第四方面所
述的细胞和/或根据第五方面所述的组合物在制备用于干扰血管新生和发展的药物中的用途。
27.本发明的第八方面涉及第一方面所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物，第二方面所述的编码核苷酸序列，第三方面所述的重组载体，第四方面所述的细胞和/或根据第五方面所述的组合物在制备用于治疗受试者的肿瘤和/或血管相关疾病和/或炎症性疾病的药物中的用途。
28.本发明的第九方面涉及第一方面所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物，第二方面所述的编码核苷酸序列，第三方面所述的重组载体，第四方面所述的细胞和/或根据第五方面所述的组合物在制备用于诊断受试者的肿瘤和/或血管相关疾病和/或炎症性疾病的试剂中的用途。
29.本发明的第十方面涉及一种干扰血管新生和发展的方法，其包括步骤：将第一方面所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物，第二方面所述的编码核苷酸序列，第三方面所述的重组载体，第四方面所述的细胞和/或根据第五方面所述的组合物施与有此需要的受试者中，优选地，所述受试者是哺乳动物或人。
30.本发明的第十一方面涉及一种治疗受试者的肿瘤和/或血管相关疾病和/或炎症性疾病方法，其包括步骤：将第一方面所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物，第二方面所述的编码核苷酸序列，第三方面所述的重组载体，第四方面所述的细胞和/或根据第五方面所述的组合物施与有此需要的受试者中，优选地，所述受试者是哺乳动物或人。
31.本发明的第十二方面涉及一种诊断受试者的肿瘤和/或血管相关疾病和/或炎症性疾病的方法，其包括步骤：将第一方面所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物，第二方面所述的编码核苷酸序列，第三方面所述的重组载体，第四方面所述的细胞和/或根据第五方面所述的组合物与有此需要的受试者的离体样品接触。
32.本发明的第十三发明涉及第一方面所述的分离的抗cd146抗体、其抗原结合片段、其变体或其衍生物，第二方面所述的编码核苷酸序列，第三方面所述的重组载体，第四方面所述的细胞和/或根据第五方面所述的组合物，其用于干扰血管新生和发展，和/或治疗受试者的肿瘤和/或血管相关疾病和/或炎症性疾病，和/或诊断受试者的肿瘤和/或血管相关疾病和/或炎症性疾病。
33.在一些实施方案中，上述方面中的所述肿瘤是良性或恶性肿瘤，优选地，所述肿瘤选自黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、鼻咽癌、肝癌、胃癌、食道癌、乳腺癌、肾癌、喉癌、胆囊癌、膀胱癌、前列腺癌、宫颈癌、乳腺癌、卵巢癌、子宫癌、头颈癌、皮肤癌、甲状腺癌、舌癌、胸腺癌、囊性脑肿瘤、神经胶质瘤、淋巴瘤，优选地，选自黑色素瘤、胰腺癌、结直肠癌和乳腺癌；和/或所述血管相关疾病和/或炎症性疾病选自老年黄斑变性、增殖性糖尿病视网膜病变、早产儿视网膜病变、青光眼、黄斑水肿、脉络膜新生血管疾病、视网膜静脉阻塞、结直肠炎、多发性硬化、动脉粥样硬化、动脉中层硬化、小动脉硬化、动脉炎、系统性脉管炎、胃炎、大肠炎、胰腺炎、关节炎、糖尿病炎症、炎症性肠病、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、硬皮病、皮肌炎、甲状腺自身免疫病、阿尔茨海默病、帕金森病或肌萎缩性脊髓侧索硬化症、炎症性中枢神经系统疾病、糖尿病、足溃疡、肺动脉高压、缺血性心肌病、缺血性脑病、心力衰竭和急性后肢缺血，优选地，选自老年黄斑变形、增殖性糖尿病视网膜病变、结直肠炎、多
发硬化和动脉粥样硬化。
34.本发明的抗体或其抗原结合片段与现有的抗体相比，具有广谱、特异、高效、低毒、不易产生耐药性的优点，其作用于肿瘤血管内皮细胞，特异且高亲和力的识别新生血管内皮细胞、肿瘤细胞、血管周细胞、淋巴细胞等表达的cd146，具有显著抑制内皮细胞迁移和成血管的能力，特异且高效地抑制肿瘤的生长和转移，可以用于开发广谱、高效、低毒的抗体药物，用于肿瘤、炎症性疾病、新生血管疾病的治疗和早期诊断。尽管不同类型的实体瘤的特异性靶分子不同，但其赖以发生、发展的新生血管结构却大致相同。当肿瘤血管被本发明的抗体或其抗原结合片段完全或不完全破坏时，会不同程度的抑制肿瘤的生长或转移。同时，本发明的抗体或其抗原结合片段直接作用于肿瘤血管的内皮细胞，无需深入穿透到肿瘤内部，从而避免了肿瘤组织局部高压引起的药物渗透和分布的问题。抗体根据其结构特点可分为五类，大多数仅具有识别功能，少数不仅具有识别功能还具有杀伤作用。本发明的单克隆抗体具有一定的诱发抗体依赖性细胞毒作用(adcc)和补体依赖性细胞毒作用(cdc)，能够直接杀伤肿瘤细胞。相对于aa98抗体，本发明对原aa98抗体及其抗原结合片段的相关序列进行了改造，显著的提高了其与抗原cd146的亲和力，并能更为有效的抑制三阴性乳腺癌细胞和内皮细胞的迁移以及内皮细胞的成管腔。此外，该抗体还能与黑色素瘤细胞和肝癌细胞结合。
附图说明
35.图1的a图显示了cd146与aa98抗体的fab片段复合物的晶体结构全图。图片上方为来自于cd146的第四和第五结构域，以d4和d5标记。紧邻cd146 d4-d5的是aa98 fab的轻链的v
l
结构域和重链的v
h
结构域，这两个结构域含抗原结合区域，分别有三个cdr环。这两个结构域的下方分别是轻链的c
l
结构域和重链的c
h1
结构域。b图显示了cd146与aa98抗体的fab片段复合物晶体结构中抗原/抗体结合面的详图。本图的取向与晶体结构全图相同，为cd146 d4-d5和aa98 fab相互作用区域的局部细节图。上方为cd146 d4-d5部份(浅灰色)，左下方为aa98 fab的轻链(中灰色)，右下方为aa98 fab的重链(深灰色)，以飘带表示。相互作用区域有相互作用的残基以球棍模型展示，突变靶标的残基则以黑色球棍模型表示，分别是轻链的s32、i31和l54以及重链的i28、i57以及y59。
36.图2：示出了cd146 d4-d5蛋白(点线)与aa98 fab(断续线)结合后(实线)在superdex 75分子筛上的聚集状态的变化。
37.图3：示出了母本aa98抗体针对cd146的亲和力为1.12
×
10-9
m(a图)，改造后抗体h13-112的亲和力为1.44
×
10-10
m(b图)，改造后的抗体h13-112的亲和力提高了将近10倍。
38.图4：示出了h13-112抗体与人静脉内皮细胞系huvec(a图)、黑色素瘤细胞系a375(b图)、肝癌细胞系hepg2(c图)、结肠癌细胞系ht-29(d图)、cd146阳性的三阴性乳腺癌细胞系mda-mb-231(e图)以及cd146阴性/低表达的乳腺癌细胞系mcf-7(f图)与h13-112突变体抗体的的facs结果。
39.图5：利用transwell系统研究抗体作用下huvec细胞的迁移能力。使用的抗体分别为作为阴性对照的migg，原始aa98抗体，h13-112、h14-114、106-112以及106-114等基于aa98的突变体抗体。a图示出了与对照组migg相比抗体aa98和aa98抗体突变体能有效抑制内皮细胞的迁移。b图为图a的统计结果。与aa98相比，h13-112具有更强的抑制作用，抑制率
为86％，而原有的aa98抑制率为49％。
40.图6：利用transwell系统研究h13-112抗体对三阴性乳腺癌细胞系mda-mb-231迁移能力的抑制。使用的抗体分别为作为阴性对照的migg，原始aa98抗体和h13-112突变体抗体。a图示出了与对照组migg相比抗体aa98和aa98抗体突变体h13-112能有效抑制内皮细胞的迁移。b图为图a的统计结果。与aa98相比，h13-112具有更强的抑制作用，抑制率为82％，而原有的aa98抑制率为57％。
41.图7:与阴性对照组migg以及对照组aa98抗体相比，h13-112、h14-114、106-112以及106-114等基于aa98的突变体抗体都能有效抑制内皮细胞的成管腔。a图为实际观测到的结果，b图为a图的统计结果。与aa98相比，突变体h3-112对内皮细胞的成管腔具有更强的抑制作用。
42.图8：示出了与对照组migg相比，抗体aa98及h13-112都能有效抑制肿瘤的生长。与aa98相比，h13-112具有更强的抑制作用，抑制率达到了74％，而原有的aa98抑制率仅为46％。
具体实施方式
43.定义
44.术语“cd146”是指黑色素瘤细胞黏附分子，其可以是任何哺乳动物来源的cd146分子，在一些实施方案中，其是灵长类动物来源的cd146分子，在一些实施方案中，其是人类来源的cd146分子。
45.术语“抗体”是指免疫球蛋白分子或根据本发明的一些实施方案，免疫球蛋白分子的具有结合到抗原的表位上的能力的片段。天然存在的抗体典型地包含四聚体，其通常由至少两条重(h)链和至少两条轻(l)链构成。每条重链由重链可变区(在此缩写为vh)和重链恒定区构成，重链恒定区通常由3个结构域(ch1、ch2和ch3)构成。重链可以具有任何同种型，包括igg(igg1、igg2、igg3和igg4亚型)、iga(iga1和iga2亚型)、igm以及ige。每条轻链由轻链可变区(在此缩写为vl)和轻链恒定区(cl)构成。轻链包括κ链和λ链。重链和轻链可变区典型地负责抗原识别，而重链和轻链恒定域可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(c1q))的结合。vh和vl区还可以被进一步细分成称作“互补性决定区”的超变区，它们中间穿插着更保守的称为“构架区”(fr)的区域。每个vh和vl由三个cdr域和四个fr域构成，按以下顺序从氨基末端排到羧基末端：fr1-cdr1-fr2-cdr2-fr3-cdr3-fr4。重链和轻链可变区含有与抗原相互作用的结合区。
46.同时，除非另外指明，否则术语“抗体”还包括抗体样多肽，如通过任何已知技术(如酶促切割、肽合成和重组技术)提供的嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体、产生于转基因非人类动物的人抗体、选自利用本领域技术人员可使用的富集技术产生的库的抗体以及保留与抗原结合能力的抗体片段(抗原结合片段)。这样产生的抗体可以具有任何同种型。
47.术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指单分子组合物的抗体分子制剂，指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即包含个体抗体的群体除可能少量存在的天然发生的突变之外是相同的。术语“多克隆抗体”是指包括抗不同决定簇(“表位”)的不同抗体的制备物。常规的单克隆抗体组合物表现出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。在某些实
施方案中，单克隆抗体可以由多于一种fab域构成，由此增加对多于一种靶标的特异性。术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”并不受限于任何具体的产生方法(例如，重组的、转基因的、杂交瘤等)。
48.本文的单克隆抗体包括“嵌合”抗体，其中部分重链和/或轻链与来自特定物种的或属于特定抗体类别或亚类的抗体的相应序列是相同或同源的，而链的其余部分与来自另一个物种或属于另一个抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段的相应序列是相同的或同源的，只要它们展现出期望的生物学活性。本发明提供了来自人抗体的可变区抗原结合序列。因此，本文主要关注的嵌合抗体包括具有一个或多个人抗原结合序列(如cdr)并含有一个或多个来自非人抗体的序列如fr或c区序列的抗体。此外，本文所述的嵌合抗体是包含一种抗体类别或亚类的人可变区域抗原结合序列以及来自另一个抗体类别或亚类的另一个序列如fr或c区序列的抗体。
49.术语“可变”是指抗体间可变(v)区的某些片段在序列上存在广泛差异。所述v结构域介导抗原结合并且定义了特定抗体对于其特定抗原的特异性。然而，可变性并非均匀分布在跨越110个氨基酸的可变区域中。相反，v区域由每个均长9-12个氨基酸的被称为“超变区”的具有极度可变性的较短区域所分割的具有15-30个氨基酸的相对不变的被称为框架区(fr)的片段组成。天然的重链和轻链的可变区每一个都包括四个fr，大多采取β-片层构型，通过3个超变区相连，其形成连接部分β-片层结构，并且在某些情况中形成部分β-片层结构的环。每条链中的超变区通过fr紧密相连，并与来自其它链的超变区一起促进抗体的抗原结合位点形成。
50.本文的术语“超变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。超变区通常包含来自“互补决定区”(“cdr”)的氨基酸残基。
[0051]“fv”是包含完整的抗原识别和抗原结合位点的最小抗体片段。该片段包含由一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域以紧密的非共价结合的方式形成的二聚体。从这两个结构域的折叠产生出6个超变环(从h和l链各形成3个环)，其提供氨基酸残基用于抗原结合，并赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单个可变区域(或fv的一半，其仅包含3个抗原特异的cdr)也具有识别和结合抗原的能力，虽然与完整结合位点相比，其亲和力较低。
[0052]
术语“抗体的抗原结合片段”指能够与表位结合的抗体的片段、部分、区域或结构域(例如可经由切割、重组、合成等获得)，因此术语“抗原结合”与“表位结合”以及“抗体的抗原结合片段”与“抗体的表位结合片段”是相同的。抗原结合片段可以含有该类抗体的1、2、3、4、5或所有6个cdr域，并且尽管能够结合到所述表位，仍可以展现出不同的特异性、亲和力或选择性。优选地，抗原结合片段含有所述抗体的所有6个cdr域。抗体的抗原结合片段可以是单条多肽链(例如，scfv)的一部分或包含单条多肽链，或者可以是两条或更多条多肽链(各自具有氨基末端和羧基末端)(例如，双抗体、fab片段、fab2片段等)的一部分或包含两条或更多条多肽链。
[0053]
结构域抗体(dab)可以以完全人的形式进行生产，是抗体的最小已知的抗原结合片段，其范围为约11kda至约15kda。dab是免疫球蛋白的重链和轻链的可变区(分别是vh和vl)。其高表达于微生物细胞培养物中，显示出良好的生物物理特性，包括例如但不限于，溶解度和温度稳定性，并且非常适合于在体外筛选系统如噬菌体展示中进行筛选和亲和力成
熟。dab作为单体具有生物活性，并且由于它们的小尺寸和固有的稳定性，可以形成较大的分子以产生具有延长的血清半衰期或其它药理活性的药物。
[0054]
可以例如通过完整抗体的蛋白酶切割来获得展现出抗原结合能力的抗体片段。更优选地，尽管fv片段的两个结构域vl和vh由单独基因或编码这样的基因序列的多核苷酸(例如，其编码cdna)天然地编码，但是可以将这两个结构域使用重组方法通过柔性接头连接，该柔性接头使得这两个结构域能够成为单条蛋白链，在该单条蛋白链中vl区和vh区结合，形成单价抗原结合分子(称为单链fv(scfv)；参见例如，bird等人，1988,science,242:423-426；和huston等人，1988,proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)85:5879-5883)。可替代地，通过采用超短(例如，小于约9个残基)的柔性接头，使得单条多肽链的vl区和vh区不能结合在一起，可以形成双特异性抗体、双抗体或类似分子(其中两条这样的多肽链结合在一起可以形成二价抗原结合分子)(关于双抗体的描述，参见例如pnas usa 90(14),6444-8(1993))。
[0055]
fv和scfv是唯一的具有完整结合位点而缺少恒定区的种类。因此，它们在体内使用中适合于减少非特异结合。构建scfv融合蛋白以产生在scfv的氨基末端或羧基末端任意一端的效应蛋白的融合。抗体片段还可以是“线性抗体”。此类线性抗体片段可以是单特异的或双特异的。
[0056]
本发明所包括的抗原结合片段的实例包括(i)fab'或fab片段，由vl、vh、cl和ch1域组成的单价片段，或如描述于wo 2007059782中的单价抗体；(ii)f(ab')2片段，包含两个由二硫键在铰链结构域连接的fab片段的二价片段；(iii)基本上由vh区和chl域组成的fd片段；(iv)基本上由vl区和vh区组成的fv片段；(v)dab片段(ward等人，nature，341，544-546(1989))，其基本上由vh区组成并且也称为结构域抗体(holt等人，trends biotechnol.，2i(ll):484-90)；(vi)骆驼或纳米抗体(revets等人，expert opin biol ther.，5(l):111-24)以及(vii)分离的互补决定区(cdr)。
[0057]
术语“人抗体”(“humab”或“humab”)包括具有衍生自人种系免疫球蛋白序列的可变域和恒定域的抗体。本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，在体外通过随机或位点特异性诱变或在基因重排期间或在体内通过体细胞突变引入的突变)。
[0058]
本发明的抗体及其抗原结合片段优选是人源化的或全人的，例如对于小鼠抗体aa98而言，其是“人源化的”。术语“人源化的”是指通常使用重组技术制备的具有衍生自来自非人物种的免疫球蛋白的抗原结合位点和基于人免疫球蛋白的结构和/或序列的剩余免疫球蛋白结构的分子。抗原结合位点可以包含融合至人恒定区的完全非人抗体可变区，或仅包含连接到人可变区的适当人框架区的此类可变区的互补决定区(cdr)。此类人源化分子的框架残基可以是野生型的(例如，全人的)，或者它们可以被修饰成包含一种或多种未在其序列中充当人源化基础的人抗体中发现的氨基酸取代。人源化减小或消除该分子的恒定区充当人体中的免疫原的可能性(lobuglio,a.f.等人，(1989)，mouse/human chimeric monoclonal antibody in man:kinetics and immune response，proc.natl.acad.sci.(u.s.a.)，86:4220-4224)。
[0059]
另一种方法不仅关注于提供衍生于人的恒定域，还关注于修饰可变区以便将它们改造地尽可能接近于人的形式。已知重链和轻链的可变区都含有三个互补决定区(cdr)，它
们特异于相应抗原且改变并决定结合能力，其侧翼为四个框架区(fr)，这些框架区在给定物种中是相对保守的并且为cdr提供支架。当针对特定抗原制备非人抗体时，可以通过在待修饰的人抗体中存在的fr上连接源自非人抗体的cdr来“改造”或“人源化”可变区，参见例如sato,k.等人，(1993),cancer res,53:851-856；riechmann,l.等人,(1988),reshaping human antibodies for therapy,nature,332:323-327；verhoeyen,m.等人,(1988),reshaping human antibodies:grafting an antilysozyme activity,science,239:1534-1536；kettleborough,c.a.等人,(1991),humanization of a mouse monoclonal antibody by cdr-grafting:the importance of framework residues on loop conformation,protein engineering,4:773-3783；maeda,h.等人,(1991),construction ofreshaped human antibodies with hiv-neutralizing activity,human antibodies hybridoma,2:124-134；gorman,s.d.等人,(1991),reshaping a therapeutic cd4 antibody),proc.natl.acad.sci.(u.s.a.),88:4181-4185；tempest,p.r.等人,(1991),reshaping a human monoclonal antibody to inhibit humanrespiratory syncytial virus infection in vivo),bio/technology,9:266-271；co,m.s.等人,(1991),humanized antibodies for antiviral therapy,pnas,88:2869-2873；carter,p.等人,(1992),humanization of an anti-p185her2antibody for human cancer therapy),pnas,89:4285-4289；以及科，m.s.等人,(1992),chimeric and humanized antibodies with specificity for the cd33 antigen),j.immunol.,148:1149-1154。在一些实施方案中，人源化抗体保留所有6个cdr序列(例如，含有来自小鼠抗体的所有六个cdr的人源化小鼠抗体)。在其他实施方案中，人源化抗体具有一个或多个cdr(一个、两个、三个、四个、五个、六个)。人源化抗原的能力是众所周知的(参见例如，美国专利号5,225,539；5,530,101；5,585,089；5,859,205；6,407,213；6,881,557)。
[0060]
变体抗体也包括在本发明范围之内。因此，申请中所列举的序列的变体也包括在本发明范围之内。可以通过使用本领域已知的方法获得具有改良的亲和性的抗体序列的其他变体并且这些变体也包括在本发明范围之内。例如，氨基酸替换可用于获得具有进一步改良的亲和性的抗体。或者，核苷酸序列的密码子优化可用于改善抗体生产中的表达系统的翻译效率。
[0061]
这样的变体抗体序列与申请中列举的序列具有70％或更多(例如80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更高)的序列同源性。这样的序列同源性是相对于参考序列(即，申请中列举的序列)的全长计算获得的。
[0062]
本发明区域中的氨基酸残基的编号是根据the international immunogenetics information或kabat,e.a.，wu,t.t.，perry,h.m.，gottesmann,k.s.&foeller,c.,(1991),sequences of proteins of immunological interest,第5版，nih公开号91-3242，美国卫生与公众服务部；chothia,c.&lesk,a.m.,(1987),canonical structures for the hypervariable domains of immunoglobulins.,j.mol.biol.,196,901-917进行的。
[0063]
抗体或其抗原结合片段“特异性地”结合另一分子的区域(即，表位)是指，它相对于另外的表位与该表位更加频繁地、更加快速地、以更长的持续时间和/或以更大的亲和力或亲合力反应或结合。在一些实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段相对于aa98抗
of proteins of immunological interest,national institutes of health,公开号91-3242；chothia,c.等人，(1987),canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins,j.mol.biol.,196:901-917)中鉴定不接触相关表位并且不在sdr中的cdr残基。在此类人源化抗体中，在一个或多个供体cdr残基不存在或整个供体cdr被省略的位置处，占据该位置的氨基酸可以是在受体抗体序列中占据相应位置(通过kabat编号)的氨基酸。此类取代在降低人源化抗体中小鼠氨基酸的数目以及因此降低潜在的免疫原性方面是潜在有利的。然而，取代还可能引起亲和力的变化，并且优选避免亲和力的显著减少。还可以凭经验选择cdr内的取代位置和待取代的氨基酸。
[0076]
利用cdr残基的单个氨基酸改变可以导致失去功能性结合的事实(rudikoff,s.等人，(1982),single amino acid substitution altering antigen-binding specificity,proc.natl.acad.sci.(usa))79(6):1979-1983)，可以系统性鉴定可替代的功能性cdr序列。在一种用于获得此类变体cdr的优选方法中，将编码cdr的多核苷酸诱变(例如经由随机诱变或通过位点定向方法)以产生具有取代的氨基酸残基的cdr。通过比较原始(功能性)cdr序列中的相关残基的身份与取代的(非功能性)变体cdr序列的身份，可以鉴定出该取代的blosum62.iij取代得分。blosum系统提供了通过分析序列数据库创建的氨基酸取代矩阵，用于可信比对(eddy,s.r.,(2004),where did the blosum62 alignment score matrix come from？,nature biotech.,22(8):1035-1036；henikoff,j.g.,(1992),amino acid substitution matrices from protein blocks),proc.natl.acad.sci.(usa),89:10915-10919；karlin,s.等人，(1990),methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes),pnas,87:2264-2268；altschul,s.f.,(1991),amino acid substitution matrices from an information theoretic perspective,j.mol.biol.,219，555-565。目前，最先进的blosum数据库是blosum62数据库(blosum62.iij)。表1呈现了blosum62.iij取代得分(得分越高取代越保守，并且因此更加可能地，该取代将不会影响功能)。例如，如果包含所得cdr的抗原结合片段不能结合到cd146，则blosum62.iij取代得分被认为是不充分保守的，并且选择且产生新的具有更高取代得分的候选取代。因此，例如，如果原始残基是谷氨酸(e)并且非功能性取代残基是组氨酸(h)，则blosum62.iij取代得分将为0，并且更保守的变化(如到天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺或赖氨酸)是优选的。
[0077]
[0078]
[0079][0080]
本发明因此考虑了随机诱变用于鉴定改进的cdr的用途。在本发明的背景下，保守取代可以由反映在以下三个表中的一个或多个中的氨基酸类别内的取代定义：
[0081]
保守取代的氨基酸残基类别：
[0082][0083]
替代性保守氨基酸残基取代类别：
[0084][0085]
氨基酸残基的物理和功能替代性分类：
[0086][0087]
更保守的取代分组包括：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸以及天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0088]
在一些实施方案中，亲水性氨基酸选自arg、asn、asp、gln、glu、his、tyr和lys。
[0089]
还可以使用描述于例如creighton,(1984),proteins:structure and molecular properties,w.h.freeman and company)中的原理制定另外的氨基酸组群。
[0090]
因此，所包含的抗体或其抗原结合片段的cdr变体的序列可以通过取代而不同于亲本抗体的cdr的序列；例如4、3、2或1个氨基酸残基的取代。根据本发明的实施方案，cdr区中的氨基酸可以用保守取代进行取代，如在以上3个表中所定义的。
[0091]“同源性”或“序列同一性”是指在序列比对和引入缺口后，多核苷酸或多肽序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。在具体实施方式中，多核苷酸和多肽变体与本文所述的多核苷酸或多肽具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、或至少约99％的多核苷酸或多肽同源性。
[0092]
这样的变体多肽序列与申请所列举的序列具有70％或以上(即80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或更多)的序列同一性。在其他实施方式中，本发明提供了多肽片段，其包括本文所公开的氨基酸序列的各种长度的连续延伸段。例如，适用的情况下，本发明提供的肽序列包含至少约5、10、15、20、30、40、50、75、100、150或更多的本发明公开的一个或多个序列的连续肽以及其之间所有的中间长度的肽。
[0093]
术语“治疗”指改善、减缓、减弱或逆转疾病或病状的进展或严重性，或者改善、减缓、减弱或逆转这种疾病或病状的一种或多种症状或副作用。在本发明中，“治疗”还指用于获得有益的或希望的临床结果的方法，其中“有益的或希望的临床结果”包括但不限于症状的缓解、病状或疾病程度的减小、稳定化的(即没有恶化的)疾病或病状状态、疾病或病状状态进展的延缓或减缓、疾病或病状状态的改善或减轻以及疾病或病状的缓解，不论是部分
地或全部地、可检出的或不可检出的。
[0094]
当应用于本发明的抗体或其抗原结合片段时，术语“有效量”是指以所需剂量并且持续所需时间段足以达到预期的生物效应或希望的治疗结果(包括但不限于临床结果)的量。当应用于本发明的抗体或其抗原结合片段时，术语“治疗有效量”表示足以改善、减轻、稳定、逆转、减缓、减弱或延缓病状或疾病状态的进展，或者该病状或疾病的症状的进展的抗体或其抗原结合片段的量。在一些实施方案中，本发明的方法提供了抗体或其抗原结合片段与其他化合物的组合物的给药。在此类情况下，“有效量”是足以引起预期的生物效应的该组合物的量。
[0095]
本发明的抗cd146抗体(如h13-112)或其抗原结合片段的治疗有效量可以根据以下因素而变化：个体的疾病状态、年龄、性别和体重，以及抗cd146抗体或其抗原结合片段在个体中引起希望的应答的能力。治疗有效量还是抗体或其抗原结合片段的有益治疗效果超过其任何毒性或有害效果的量。
[0096]
本发明的抗体可以是通过重组dna产生的单克隆抗体。
[0097]
本发明的抗体可以具有任何同种型。同种型的选择通常由希望的效应物功能(如adcc诱导)来决定。示例性同种型是igg1、igg2、igg3和igg4。可以使用人轻链恒定域κ或λ中任一者。如果需要，可以通过已知方法转换本发明的抗cd146抗体的类别。例如，最初是igg的本发明抗体可以类别转换为本发明的igm抗体。此外，类别转换技术可以用来将一个igg亚类转化成另一亚类，例如从iggl转换为igg2。因此，本发明抗体的效应物功能可以通过同种型切换变为例如igg1、igg2、igg3、igg4、igd、iga、ige或igm抗体，以用于各种治疗用途。在一些实施方案中，本发明的抗体是igg2抗体，例如igg2a。如果抗体的氨基酸序列相对于其他同种型与该同种型大部分同源，则该抗体属于特定同种型。
[0098]
在一些实施方案中，本发明的抗体是全长抗体，优选igg抗体。在另一些实施方案中，本发明的抗体是抗体抗原结合片段或单链抗体。
[0099]
在一些实施方案中，抗cd146抗体是单价抗体，优选如在wo2007059782(通过引用将其全文并入此处)中描述的具有铰链区缺失的单价抗体。因此，在一些实施方案中，抗体是单价抗体，其中所述抗cd146抗体通过以下方法构建：i)提供编码单价抗体的轻链的核酸构建体，所述构建体包含编码所选抗原特异性抗cd146抗体的vl区的核苷酸序列和编码ig的恒定cl区的核苷酸序列，其中编码所选抗原特异性抗体的vl区的所述核苷酸序列和编码ig的cl区的所述核苷酸序列被有效连接在一起，并且其中，在igg1亚型的情况下，编码cl区的核苷酸序列已经被修饰，这样使得在多克隆人igg的存在下或当给予动物或人时，该cl区不含有能够与包含该cl区的一致氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价键的任何氨基酸；ii)提供编码单价抗体的重链的核酸构建体，所述构建体包含编码所选抗原特异性抗体的vh区的核苷酸序列和编码人ig的恒定ch区的核苷酸序列，其中编码ch区的核苷酸序列已经被修饰，这样使得在多克隆人igg的存在下或当给予动物人时，对应于铰链区和(如由ig亚型所要求的)ch区的其他区域(如ch3区)的区域不包含参与和包含人ig的ch区的一致氨基酸序列的其他肽形成二硫键或共价或稳定的非共价重链间键的任何氨基酸残基，其中编码所选抗原特异性抗体的vh区的所述核苷酸序列和编码所述ig的ch区的所述核苷酸序列被有效连接在一起；iii)提供用于产生单价抗体的细胞表达系统；iv)通过在(iii)的细胞表达系统的细胞中共表达(i)和(ii)的核酸构建体来产生所述单价抗体。
[0100]
类似地，在一些实施方案中，抗cd146抗体是单价抗体，其包含：
[0101]
(i)如本文所述的本发明抗体的可变区或所述结构域的抗原结合部分，以及
[0102]
(ii)免疫球蛋白的ch区或其包含ch2和ch3域的结构域，其中该ch区或其结构域已经被修饰，这样使得对应于铰链区和(如果该免疫球蛋白不是igg4亚型的话)ch区的其他结构域(如ch3域)的结构域不包含任何氨基酸残基，这些任何氨基酸残基能够与相同ch区形成二硫键或在多克隆人igg的存在下与相同ch区形成其他共价或稳定的非共价重链间键。
[0103]
在另外的一些实施方案中，单价抗体的重链被修饰，使得缺失整个铰链区。
[0104]
在另外的实施方案中，单价抗体的序列被修饰，使得它不包含用于n-连接的糖基化的任何受体位点。
[0105]
本发明还包括“双特异性抗体”，其中抗cd146结合区(例如，抗cd146单克隆抗体的cd146结合区)是靶向一种以上表位的二价或多价双特异性框架的一部分(例如第二表位可以包含主动转运受体的表位，这样使得该双特异性抗体将展现出跨生物屏障(如血脑屏障)的改进的胞转作用)。因此，在另外的实施方案中，抗cd146抗体的单价fab可以连接到另外的靶向不同蛋白的fab或scfv，以产生双特异性抗体。双特异性抗体可以具有双重功能，例如由抗cd146结合区赋予的治疗功能和可以结合到受体分子以增强跨生物屏障(如血脑屏障)转移的转运功能。
[0106]
本发明的抗体及其抗原结合片段还包括单链抗体。单链抗体是重链和轻链fv域被连接的肽。在一些实施方案中，本发明提供了单链fv(scfv)，其中本发明的抗cd146抗体的fv中的重链和轻链由柔性肽接头(典型地为约10、12、15或更多个氨基酸残基)连接成单条肽链。产生此类抗体的方法描述于例如us 4,946,778；pluckthun,the pharmacology of monoclonal antibodies,vol.113,rosenburg and moore ed.,springer-verlag,new york,pages:269-315(1994)；bird等人,science,242，423-426(1988)；huston等人,pnas usa 85，5879-5883(1988)和mccafferty等人,nature,348，552-554(1990)。如果仅使用单个vh和vl，单链抗体是单价的；如果使用两个vh和vl，则是二价的；或如果使用两个以上vh和vl，则是多价的。
[0107]
可以通过包含任何“适合”数目的经修饰的氨基酸和/或与偶联取代基结合来修饰本发明的抗体及其抗原结合片段。在这种情况下，“适合”通常由至少基本上保留与非衍生化亲本抗cd146抗体相关的cd146选择性和/或cd146特异性的能力决定。包含一个或多个经修饰的氨基酸在例如增加多肽血清半衰期、降低多肽抗原性或增加多肽储存稳定性中可以是有利的。对一种或多种氨基酸进行修饰，例如，在重组生产的过程中与翻译同时进行或在翻译之后进行(例如，在哺乳动物细胞表达过程中在n-x-s/t基序上的n-连接的糖基化作用)，或通过合成手段进行修饰。经修饰的氨基酸的非限制性实例包括糖基化的氨基酸、硫酸化的氨基酸、异戊二烯化(例如，法尼基化、香叶基-香叶基化)的氨基酸、乙酰化的氨基酸、酰化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、羧基化的氨基酸、磷酸化的氨基酸等。进行氨基酸修饰的参考文献在本领域中司空见惯，参见例如walker,(1998),protein protocols on cd-rom,humana press,totowa,new jersey。经修饰的氨基酸可以例如选自糖基化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素酰化的氨基酸、偶联到脂质部分的氨基酸或偶联到有机衍化剂的氨基酸。
[0108]
本发明的抗体及其抗原结合片段还可以通过共价偶联到聚合物而化学修饰，以增
加其循环半衰期。示例性聚合物以及将它们连接到肽的方法参见例如us 4,766,106；us 4,179,337；us 4,495,285和us 4,609,546。另外的示例性聚合物包括聚氧乙基化的多元醇和聚乙二醇(peg)(例如，分子量在约1,000～40,000d之间，如在约2,000～20,000d之间，例如约3,000～12,000d的peg)。
[0109]
在一些实施方案中，本发明提供包含一个或多个放射性标记的氨基酸的抗体及其抗原结合片段。放射性标记的抗cd146抗体可以用于诊断和/或治疗目的。此类标记的非限制性实例包括但不限于铋(
213
bi)、碳(
11
c、
13
c、
14
c)、铬(
51
cr)、钴(
57
co、
60
co)、铜(
64
cu)、镝(
165
dy)、铒(
169
er)、氟(
18
f)、钆(
153
gd、
159
gd)、镓(
68
ga、
67
ga)、锗(
68
ge)、金(
198
au)、钬(
166
ho)、氢(3h)、铟(
111
in、
112
in、
113
in、
115
in)、碘(
121
i、
123
i、
125
i、
131
i)、铱(
192
ir)、铁(
59
fe)、氪(
81m
kr)、镧(
140
la)、镥(
177
lu)、锰(
54
mn)、钼(
99
mo)、氮(
13
n、
15
n)、氧(
15
o)、钯(
103
pd)、磷(
32
p)、钾(
42
k)、镨(
142
pr)、钷(
149
pm)、铼(
186
re、
188
re)、铑(
105
rh)、铷(
81
rb、
82
rb)、钌(
82
ru、
97
ru)、钐(
153
sm)、钪(
47
sc)、硒(
75
se)、钠(
24
na)、锶(
85
sr、
89
sr、
92
sr)、硫(
35
s)、锝(
99
tc)、铊(
201
tl)、锡(
113
sn、
117
sn)、氙(
133
xe)、镱(
169
yb、
175
yb、
177
yb)、钇(
90
y)以及锌(
65
zn)。用于制备放射性标记的氨基酸和相关肽衍生物的方法在本领域是已知的(参见例如，junghans等人,cancer chemotherapy and biotherapy,655-686(version 2,chafner and longo,ed.lippincott raven,(1996))以及us 4,681,581、us 4,735,210、us 5,101,827、us 5,102,990(us re35,500)、us 5,648,471和us 5,697,902)。例如，放射性同位素可以氯胺t方法进行偶联(lindegren,s.等人,(1998),chloramine-t in high-specific-activity radioiodination of antibodies using n-succinimidyl-3-(trimethylstannyl)benzoate as an intermediate),nucl.med.biol.,25(7):659-665；kurth,m.等人,(1993),site-specific conjugation of a radioiodinated phenethylamine derivative to a monoclonal antibody results in increased radioactivity localization in tumor,j.med.chem.,36(9):1255-1261；rea,d.w.等人,(1990),site-specifically radioiodinated antibody for targeting tumors,cancer res.,50(supple.3):857s-861s)。
[0110]
本发明还提供了使用下述检测标记物标记的抗cd146抗体及其抗原结合片段：荧光标记(如稀土螯合物(例如，铕螯合物))、荧光素型标记(例如，荧光素、荧光素异硫氰酸酯、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素、二氯三嗪基胺荧光素)、罗丹明型标记(例如，alexa568(invitrogen)、或丹磺酰氯)、vivotag 680xl fluorochrome
tm
(perkin elmer)、藻红蛋白；伞形酮、丽丝胺；花菁；藻红蛋白、德克萨斯红、bodipy(invitrogen)或其类似物，所有这些都适用于光学检测。本发明的抗体及其抗原结合片段还可以采用化学发光标记(例如，鲁米诺、荧光素酶、荧光素和水母蛋白)。这种诊断和检测还可以通过将本发明的诊断分子偶合至可检测物质(包括但不限于各种酶，酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶)或者偶合至辅基复合体(包括但不限于链霉亲和素/生物素和亲和素/生物素)来完成。
[0111]
还可以采用顺磁性标记，并且优选地使用正电子发射断层术(pet)或单光子发射计算机断层术(spect)进行检测。这样的顺磁性标记包括但不限于含有铝(al)、钡(ba)、钙(ca)、铈(ce)、镝(dy)、铒(er)、铕(eu)、钆(gd)、钬(ho)、铱(ir)、锂(li)、镁(mg)、锰(mn)、钼
(m)、钕(nd)、锇(os)、氧(o)、钯(pd)、铂(pt)、铑(rh)、钌(ru)、钐(sm)、钠(na)、锶(sr)、铽(tb)、铥(tm)、锡(sn)、钛(ti)、钨(w)和锆(zi)并且特别是co
2
、cr
2
、cr
3
、cu
2
、fe
2
、fe
3
、ga
3
、mn
3
、ni
2
、ti
3
、v
3
和v
4
的顺磁离子的化合物，使用各种正电子发射断层术的正电子发射金属以及非放射性顺磁金属离子。
[0112]
因此，在一些实施方案中，可以用荧光标记、化学发光标记、顺磁性标记、放射性同位素标记或酶标记来标记本发明的抗cd146抗体或其cd146结合片段。可以使用经标记的抗体的片段检测或测量所述cd146在受试者体内的存在或量。这种方法可以包括结合到所述cd146的抗cd146抗体或cd146结合片段的体内成像的检测或测量并且可以包括结合到这样的cd146的抗cd146抗体或cd146结合片段的离体成像。
[0113]
因此，在一些实施方案中，本发明的抗cd146抗体及其抗原结合片段包括完整抗体，如igg(igg1、igg2、igg3和igg4亚型)、iga(iga1和iga2亚型)、igm以及ige；抗原结合片段如sdr、cdr、fv、dab、fab、fab2、fab'、(fab')2、fd、scfv、纳米抗体；抗体或其抗原结合片段的变体序列，如与上述抗体或其抗原结合片段具有至少80％序列同一性的变体序列。在一些实施方案中，本发明还包括包含抗cd146或其抗原结合片段的衍生物，如来源于完整抗体的嵌合抗体、人源化抗体、全人抗体、重组抗体、双特异抗体、包含修饰的氨基酸的产物、偶联到聚合物的产物、包含放射性标记的产物、包含荧光标记的产物、包含酶标记物的产物、包含化学发光物的产物、包含顺磁标记的产物。
[0114]
在另外的方面，本发明涉及编码本发明的抗体或其抗原结合片段的一条或多条多肽链的表达载体。此类表达载体可以用于重组产生本发明的抗体和其抗原结合片段。
[0115]
在本发明中，表达载体可以是任何适合的dna或rna载体，包括染色体载体、非染色体载体和合成核酸载体(包含一组适合的表达控制元件的核酸序列)。此类载体的实例包括sv40的衍生物、细菌质粒、噬菌体dna、杆状病毒、酵母质粒、衍生自质粒与噬菌体dna的组合的载体以及病毒核酸(rna或dna)载体。在一些实施方案中，编码抗cd146抗体的核酸被包含在裸dna或rna载体中，包括例如线性表达元件(如描述于例如sykes and johnston,nat biotech,12，355-59(1997))、紧凑型核酸载体(如描述于例如us 6,077,835和/或wo 00/70087)、质粒载体(如pbr322、puc 19/18或puc 118/119)、最小尺寸的核酸载体(如描述于例如schakowski等人,moi ther,3，793-800(2001))，或作为沉淀型核酸载体构建体，如capo4沉淀型构建体(如描述于例如wo 00/46147；benvenisty and reshef,pnas usa 83，9551-55(1986)；wigler等人,cell,14，725(1978)以及coraro and pearson,somatic cell genetics,2，603(1981))。此类核酸载体及其使用在本领域是熟知的(参见例如us 5,589,466和us5,973,972)。
[0116]
在一些实施方案中，载体适用于在细菌细胞中表达抗cd146抗体或其抗原结合片段。此类载体的实例包括例如bluescript(stratagene)、pin载体(van heeke&schuster,j biol chem,264，5503-5509(1989))、pet载体(novagen,madison,wisconsin)等。
[0117]
表达载体还可以是适用于在酵母系统中进行表达的载体。可以采用任何适用于在酵母系统中进行表达的载体。适合的载体包括例如包含组成型或诱导型启动子(如α因子、醇氧化酶和pgh)的载体(综述于：f.ausubel等人,ed.,current protocols in molecular biology,greene publishing and wiley interscience,new york(1987)；grant等人,methods in enzymol,153，516-544(1987)；mattanovich,d.等人,methods mol.biol.,
824，329-358(2012)；celik,e.等人,biotechnol.adv.,30(5)，1108-1118(2012)；li,p.等人,appl.biochem.biotechnol.,142(2)，105-124(2007)；e.等人,appl.microbiol.biotechnol.,77(3)，513-523(2007)；van der vaart,j.m.,methods mol.biol.,178，359-366(2002)和holliger,p.,methods mol.biol.,178，349-357(2002))。
[0118]
在本发明的表达载体中，编码抗cd146抗体的核酸可以包含任何适合的启动子、增强子和其他有助于表达的元件或者与其结合。此类元件的实例包括强表达型启动子(例如，人cmv ie启动子/增强子以及rsv、sv40、sl3-3、mmtv和hiv ltr启动子)、有效的聚(a)终止序列、用于在大肠杆菌中产生质粒的复制起点、作为选择性标记的抗生素抗性基因和/或便利的克隆位点(例如，多聚接头)。核酸还可以包含与组成型启动子(如cmv ie)相对的诱导型启动子。
[0119]
在另外的方面，本发明涉及重组真核或原核宿主细胞(如转染瘤)，其产生本发明的抗体或其抗原结合片段或本发明的双特异性分子。宿主细胞的实例包括酵母、细菌和哺乳动物细胞(如cho或hek细胞)。例如，在一些实施方案中，本发明提供了包含稳定整合进细胞基因组中的核酸的细胞，该基因组包含编码本发明的抗cd146抗体或其抗原结合片段的核酸序列。在另一些实施方案中，本发明提供了包含非整合型核酸(如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件)的细胞，该核酸包含编码本发明的抗cd146抗体或其抗原结合片段的序列。
[0120]
本发明的抗体及其抗原结合片段可以在不同细胞系中产生，如人细胞系、非人哺乳动物细胞系和昆虫细胞系，例如cho细胞系、hek细胞系、bhk-21细胞系、鼠类细胞系(如骨髓瘤细胞系)、纤维肉瘤细胞系、per.c6细胞系、hkb-11细胞系、cap细胞系和huh-7人细胞系(dumont等人,2015,crit rev biotechnol.,sep.18,1-13.，其内容通过引用并入本文)。
[0121]
aa98抗体是指中国专利cn1124284c中公开的抗体，包括鼠单克隆抗体aa98、人-鼠嵌合抗体chiaa98以及其fab和fv功能片段。
[0122]
本发明的抗体作用于各种肿瘤新生血管，可以对各种依赖于肿瘤血管形成的实体肿瘤发挥治疗和/或诊断作用，包括但不限于肝癌、胃癌、大肠癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫颈癌、头颈癌、结直肠癌等。
[0123]
本发明的抗体还可以用于治疗与新生血管相关的疾病及炎性疾病，包括但不限于老年黄斑变形、增殖性糖尿病视网膜病变、结直肠炎、多发性硬化、动脉粥样硬化等。
[0124]
在提供了范围的值时，应该理解，除非文中另有明确说明，否则每个插入值、到下限的单位的十分之一、该范围的上限和下限之间和任何其它在所述范围内的所述值或插入值都包含于本发明范围之内。可独立地包括于较小范围内的这些较小范围的上限和下限也包含在本发明内，只要去除被特地排除在外的极限所述范围内被特定排除在外的任何界限。当所述范围包括界限的一个或两个时，排除被包括的界限的一个或两个的范围也包括于本发明中。
[0125]
除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的具有相同的含义。虽然任何类似或等同于本文所述的方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但现在公开了优选的方法和材料。本文提及的所有出版物均通过引用而全部并入本文。
[0126]
本发明提供实施例一方面是用于描述本发明抗体制备过程，该制备过程仅是说明
相关方法，并非是限制性的，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。本发明提供实施例另一方面是用于表明本发明抗体的特征和优点，但本发明不限于这些特征和优点。
[0127]
下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。本发明下述实施例中使用的各种抗体均来源于商业途径的标准抗体。
[0128]
实施例
[0129]
实施例1cd146 d4-d5/aa98复合物晶体结构的解析
[0130]
1.cd146 d4-d5表达质粒的构建
[0131]
n端带有信号肽、his-tag、strep-tag和hrv3c识别序列的cd146 d4-d5(336-519)的dna序列(seq id no.1)经pcr、xbai和noti酶切，连接到pcdna3.1/hygro(-)载体上(invitrogen)的xbai和noti之间，经dna测序鉴定序列正确。
[0132]
2.cd146 d4-d5稳定表达细胞株的构建
[0133]
以电击法将上述获得的质粒转入cho lec 3.2.8.1细胞株(atcc)，在含有潮霉素的dmem培养基(sigma-aldrich)中培养，结合以aa98为一抗的elisa法筛选出cd146 d4-d5表达量较高的细胞，转入滚瓶中大量培养，收集培养上清，其中含有目标蛋白cd146 d4-d5。
[0134]
3.cd146 d4-d5蛋白的表达和纯化
[0135]
收集如上含有目标蛋白的培养上清，浓缩后经过ni-nta亲和(qiagen)纯化和strep-tactin亲和(iba)纯化，得到纯度较高的含有his-tag和strep-tag的融合蛋白。经过hrv3c(sino biological)蛋白酶切，经ni-nta亲和纯化去除hrv3c蛋白酶和未去除融合n端的目标蛋白后，进一步经superdex200分子筛，得到纯度超过95％的cd146 d4-d5蛋白。
[0136]
4.aa98抗体的表达、纯化以fab的制备
[0137]
(a)培养aa98杂交瘤he2a5(见中国专利cn1124284c)并收集培养上清，浓缩后调整至tbs缓冲液中，经过protein a亲和纯化和superdex200分子筛纯化，得到纯度较高，均一性较好的aa98抗体。
[0138]
(b)目标抗体经过木瓜蛋白酶酶切，经protein a亲和纯化和superdex200分子筛纯化，去除未经切割的完整抗体和抗体的fc部分，得到了纯度较高，均一性较好的aa98 fab
[0139]
5.cd146 d4-d5/aa98复合物蛋白的纯化
[0140]
以cd146 d4-d5:aa98 fab摩尔比1：4混合两种蛋白，在冰上孵育30分钟后以superdex 200分子筛纯化，得到复合物蛋白溶液。
[0141]
6.cd146 d4-d5/aa98复合物晶体的生长和优化
[0142]
将得到的cd146 d4-d5/aa98 fab复合物蛋白浓缩到12mg/ml，以悬滴法筛选可能的结晶条件，其后经过多轮优化，得到了可用于数据收集的具有较高衍射分辨率的晶体。
[0143]
7.cd146 d4-d5/aa98复合物晶体衍射数据的收集和结构解析
[0144]
冻存的复合物晶体在上海同步辐射收集衍射数据。收集的数据经hkl-2000软件处理后，以d2.3 fab晶体结构(1yec)为模型，用分子置换法破解了相位，并手工搭建了cd146 d4-d5部分，经过多轮的优化，最终解析了2.8埃的复合物晶体结构。图1的a图提供了该复合物晶体结构的全图。图1的b图提供了该复合物晶体结构的抗原/抗体结合面详图。
[0145]
以superdex 75分子筛比较cd146 d4-d5蛋白结合fab aa98前后的聚集状态时发
现，天然状态下cd146 d4-d5蛋白在溶液中为二聚体，而结合aa98 fab后则转变为单体(图2)，解析的复合物晶体结构也表明了一个cd146分子结合了一个fab，aa98的结合打破了cd146二聚化，稳定了cd146的单体结构。
[0146]
在复合物的晶体结构中，aa98 fab结合于cd146的第四和第五结构域间，整个相互作用的中心是以来自于两个蛋白的芳香环残基间的疏水相互作用为主，周围是一些亲水性残基间的氢键和范德华力等。为了提高抗体的亲和力并加强二者间的相互作用，稳定复合物在溶液中的构象，本发明人对抗体进行了定点突变。分析发现，抗体重链的i28、i57和y59位于相互作用面外围的亲水部分，但其却为疏水性残基，设想突变它们为亲水性残基可能有助于增加复合物的稳定性并加强与cd146分子的亲水性相互作用。同样，抗体轻链的i31突变为e，s32突变为t，l51突变为y或h可能有助于加强中心部分的芳香环氨基酸间的疏水性相互作用。
[0147]
实施例2aa98抗体的改造方法
[0148]
1.实验材料、试剂：质粒提取试剂盒(tiangen,dp103-3)、dna纯化试剂盒(transgen,30831)、琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(transgen,eg101-02)；ex taq聚合酶(fastpfu polymerase,transgen,ap221)、限制性内切酶(not i,neb,r3189s；xbai,neb,r0145s)、t4 dna连接酶(takara公司)；蛋白胨、酵母提取物、青霉素、链霉素、rpmi细胞培养基、dmem细胞培养基、二甲基亚砜(dmso)、胎牛血清、胰蛋白酶均购自美国sigma-aldrich公司；
[0149]
2.实验设备：二氧化碳培养箱(nbs)、摇床、pcr仪(applied biosystem)；nanodrop 2000c微型紫外分光光度计(thermo scientific)；hermel z32k冷冻离心机、sigma sk15冷冻离心机；凝胶成像仪(bio-rad)；
[0150]
3.实验方法
[0151]
实验设计：
[0152]
根据上述cd146/aa98复合物晶体结构，得到aa98抗体和cd146分子的作用方式，突变aa98抗体上参与相互作用的氨基酸残基(见下文表5)，以强化二者间的相互作用，提升目标抗体对cd146分子的亲和力。将据此得到的抗体轻、重链的编码序列分别克隆到真核载体上，在人类hek293t细胞(atcc)中分泌表达并纯化得到目标抗体。
[0153]
技术路线：
[0154]
(1)质粒的构建
[0155]
根据目标抗体fab的氨基酸序列，在ncbi网站上经blast搜索后寻找得到了抗体恒定区的dna序列，其后直接由测序公司合成并克隆到真核表达载体上。抗体的重链克隆在pcdna3.1/hygro(-)(invitrogen公司)载体的xba i和not i之间，而抗体的轻链克隆在pef1/v5-hisa载体的bamh i和not i之间，前者含有潮霉素b的筛选标记而后者含有新霉素的筛选标记。
[0156]
seq id no.2和3提供了aa98抗体的轻链和重链核苷酸序列，在此基础上，本发明构建了多种抗体突变体，其中一种突变的抗体的轻链和重链的核苷酸序列涉及将轻链的51位氨基酸leu替换为tyr(l51y)，重链的28位氨基酸ile替换为lys(i28k)。该抗体变体命名为h13-112(重轻链氨基酸序列分别如seq id no.17和28所示)。表5所示的其它突变体可以按照相同的方法依次获得。seq id no.4和5分别示出了aa98抗体轻重链的可变区的氨基酸
序列，seq id no.6和7分别提供了aa98抗体轻重链的全长氨基酸序列，seq id no.8和16提供了aa98抗体的fab的氨基酸序列，seq id no.9提供了aa98抗体的scfv序列，seq id no.10-15分别提供了aa98抗体轻重链的cdr序列。
[0157]
(2)细胞转染
[0158]
目标抗体的表达在人hek293t细胞中进行。将含有目标抗体轻链和重链dna序列的质粒，以摩尔比1：1比例混合，按照thermo fisher公司lipofactamine 2000的操作手册，将抗体轻、重链质粒转染入人hek293t细胞中，转染细胞经24小时培养后转入含有125ug/ml潮霉素b和1mg/ml的新霉素的hdmem选择性培养基(sigma aldrich)中继续培养，期间适时更换并收集含有目标抗体的培养基直至适于进行抗体纯化。
[0159]
(3)抗体纯化
[0160]
按照ge公司hitrap rprotein a ff(ge healthcare,cat.17-5080-01)的操作手册进行目标抗体的纯化，其后用透析法将目标抗体转入适合后续测试的pbs溶液(10mm磷酸钠，150mm氯化钠，ph 7.4)中。用sds-page法测定纯化得到的抗体的纯度，以elisa法(包被抗原为胞外区cd146蛋白(sino biological.，10115-h08h-20))鉴定抗体。
[0161]
实施例3生物膜干涉法检测抗体亲和力
[0162]
方法步骤如下：
[0163]
1、预先将8根anti-mouse fc capture传感器(pall faotebio)浸泡于添加了0.1％bsa和0.05％tween 20的pbs缓冲液(10mm磷酸钠，150mm氯化钠，ph 7.4)，10min。
[0164]
2、用添加了0.1％bsa和0.05％tween 20的pbs缓冲液将scd146蛋白(sino bio.，10115-h08h-20)稀释到：250nm、125nm、62.5nm、31.25nm、15.625nm、7.8125nm、3.91nm。
[0165]
3、将步骤2中所述梯度稀释的7种浓度的scd146和添加了0.1％bsa和0.05％tween 20的pbs缓冲液依次加入黑色96孔板(corning，655209)的第10纵列,200μl/孔。
[0166]
4、用添加了0.1％bsa和0.05％tween 20的pbs缓冲液将母本aa98抗体稀释到20μg/ml。
[0167]
5、将步骤4中所述抗体加入步骤2中所述黑色96孔板的第2纵列，200μl/孔。
[0168]
6、用添加了0.1％bsa和0.05％tween 20的pbs缓冲液将h13-112抗体稀释到20μg/ml。
[0169]
7、将步骤6中所述抗体加入步骤5中所述黑色96孔板的第4纵列，200μl/孔。
[0170]
8、向步骤7中所述黑色96孔板的第1、3、5、6、7、12纵列中加入0.1％bsa和0.05％tween 20的pbs缓冲液，200μl/孔。
[0171]
9、向步骤8中所述黑色96孔板的第11纵列中加入ph 1.5的gly-hcl再生溶液(50mm，ph 2.5)，200μl/孔。
[0172]
10、将步骤9中所述96孔板放入生物分子相互作用仪(pall faotebio，octet red96)中，设置检测程序，步骤1中所述传感器依次经过步骤9中所述96孔板：
[0173]
第1列(平衡，120s)-第1列(基线，60s)-第2列(装载，360s)-第6列(基线，60s)-第10列(结合，180s)-第6列(解离，600s)-第11列(再生，6s)-第12列(中和，6s)-第11列(再生，6s)-第12列(中和，6s)-第11列(再生，6s)-第12列(中和，6s)-第3列(平衡，120s)-第3列(平衡，120s)-第4列(装载，360s)-第7列(基线，60s)-第10列(结合，180s)-第7列(解离，600s)-第11列(再生，6s)-第12列(中和，6s)-第11列(再生，6s)-第12列(中和，6s)-第11列(再生，
6s)-第12列(中和，6s)。
[0174]
11、程序完成后，收集数据并分析，结果如图3的a和b以及表5所示，亲本aa98抗体亲和力为1.12
×
10-9
m，改造后的抗体h13-112的亲和力为1.44
×
10-10
m，改造后的抗体h13-112相对于aa98的亲和力提高了将近10倍。其它突变体的亲和力也有程度不一的提高。
[0175]
表5 aa98抗体系列突变体及其与cd146胞外区蛋白的k
d
值。
[0176][0177]
上述数据表明，所述抗原/抗体结合面的疏水性氨基酸残基对于抗体与其抗原的结合具有不利作用，将其突变为亲水性氨基酸残基后可以显著提高与其抗原以及细胞结合的活性。
[0178]
实施例4抗体特异性检测(facs)
[0179]
人静脉内皮细胞系huvec、黑色素瘤细胞系a375、肝癌细胞系hepg2、结肠癌细胞系ht-29、三阴性乳腺癌细胞系mda-mb-231为cd146阳性表达株而乳腺癌细胞系mcf-7为cd146阴性/低表达株，均购自atcc。
[0180]
实验步骤：
[0181]
1.将上述细胞接种至6孔板，培养48小时后胰酶消化贴壁细胞，收集细胞并离心(4℃，1000rpm，5min)，用预冷pbs洗一次(1000rpm，5min)，并用预冷的pbs(含0.1％bsa)重悬，调整细胞浓度至1
×
106个/ml，
[0182]
2.取100μl细胞悬液转移至新管，每管加入h13-112一抗或同型对照migg，轻轻混匀，4℃避光孵育40min，
[0183]
3.用预冷pbs(含0.1％bsa)洗一遍，离心弃上清后，加入100μl pbs(含0.1％bsa)重悬细胞，其后加入荧光素标记二抗alexa fluor 555山羊抗小鼠igg(invitrogen，a11001)，4℃避光孵育30min，
[0184]
4.细胞用预冷pbs洗一次，1小时内使用流式细胞仪进行分析检测，使用flowjo软件分析数据。结果见图4的a～f。
[0185]
上述结果表明，突变后的h13-112抗体保持了aa98抗体对cd146阳性细胞的亲和作
用。
[0186]
实施例5抗体抑制人静脉内皮huvec细胞的细胞迁移实验
[0187]
利用transwell系统研究抗体作用下huvec细胞的迁移能力。使用的抗体分别为作为阴性对照的migg，原有的aa98抗体，h13-112、h14-114、106-112以及106-114等基于aa98的突变体抗体。
[0188]
实验步骤如下：
[0189]
1、用无血清rpmi1640培养基(gibco，c11875500bt)将人脐静脉内皮细胞huvec(atcc，pcs-100-010)重悬为单细胞悬液，调整细胞密度为8
×
104个细胞/ml。
[0190]
2、向corning hts transwell-96cell migration培养皿(corning,3385)下室中加入含有10％胎牛血清(gibco，10091148)的rpmi1640培养基，200μl/孔。上室中加入步骤1中所述细胞悬液100μl/孔。
[0191]
3、向步骤2中所述培养皿上室中分别加入抗体migg(abcam，ab37355)、aa98、h13-112并混匀，抗体终浓度为100μg/ml，每种抗体3组平行复孔。
[0192]
4、将步骤3中所述培养皿置于37℃、5％co2细胞培养箱中孵育12h。
[0193]
5、去除步骤4中培养皿上室和下室中培养基，用蘸有75％乙醇的棉签擦去transwell膜上层细胞。
[0194]
6、将步骤5中所述transwell膜从培养皿上揭下，平铺于载玻片(25.4
×
76.2mm)上，贴附有细胞的下层膜朝上。
[0195]
7、用含4％多聚甲醛的磷酸缓冲液(10mm磷酸钠，150mm氯化钠，ph 7.4)固定步骤6中所述transwell膜上的细胞，15min。
[0196]
8、去除步骤7中所述4％多聚甲醛，pbs洗三次。
[0197]
9、用1％结晶紫染色步骤7中所述transwell膜下层细胞，10min。
[0198]
10、ddh2o洗五次至无紫色以去除结晶紫染液。
[0199]
11、将步骤10中所述transwell膜置于olympus正置显微镜下观察并对每个视野进行拍照。
[0200]
12、利用软件imagej(nih)统计每个transwell膜上细胞总数并进行student's t-test统计学分析。
[0201]
13、结果如图5的a图所示，b图为基于a图的统计结果。与对照组migg相比，抗体aa98和抗体aa98突变体都能有效抑制内皮细胞的迁移。与aa98相比，h13-112突变体具有更强的抑制作用，抑制率为86％，而aa98抗体的抑制率仅为49％。
[0202]
实施例6抗体抑制三阴性乳腺癌mda-mb-231细胞迁移的实验
[0203]
利用transwell系统研究抗体作用下mda-mb-231细胞的迁移能力。使用的抗体分别为作为阴性对照的migg，原有的aa98抗体以及h13-112突变体抗体。
[0204]
实验步骤如下：
[0205]
1、接种细胞至6孔板(每孔5х105细胞/孔),培养基为含2％fbs的h-dmem。每孔分别加入migg、aa98、h13-112抗体预处理48小时，终浓度100μg/ml；
[0206]
2、48小时后接种至transwell板，其中上室细胞数为1х104细胞/孔,培养基为50μl无血清h-dmem；同时加入抗体阻断，终浓度100μg/ml；下室为200μl含10％fbs的h-dmem。
[0207]
3、孵育24h后以75％酒精擦拭掉膜上层细胞，用4％pfa固定膜下层细胞，室温15分
钟后用pbs洗2次，结晶紫染色15分钟,水洗掉多余染色液后置于zeiss axio scope a1显微镜下拍照，imagej软件统计迁移细胞数目
[0208]
4、结果如图6的a图所示，b图为基于a图的统计结果。与对照组migg相比，抗体aa98和抗体aa98突变体都能有效抑制乳腺癌细胞mda-mb-231细胞的迁移。与aa98相比，h13-112突变体具有更强的抑制作用，抑制率为83％，而aa98抗体的抑制率仅为57％。
[0209]
实施例7成管腔实验
[0210]
实验步骤如下：
[0211]
1、96孔板(corning，3599)中包被60μl/孔冰浴的matrigel(corning，354248)，37℃细胞培养箱中放置30min使其凝固。
[0212]
2、用无血清rpmi培养基将人脐静脉内皮细胞huvec重悬为单细胞悬液，调整细胞密度为8
×
104个细胞/ml。
[0213]
3、将步骤2中所述细胞悬液加入步骤1中所述96孔板，100μl/孔。
[0214]
4、向步骤3中所述细胞悬液中分别加入抗体migg、aa98、h13-112混匀，抗体终浓度为100μg/ml，每种抗体3组平行复孔。
[0215]
5、将步骤4中所述96孔板置于37℃，5％co2细胞培养箱中孵育3-4h。
[0216]
6、将步骤5中所述96孔板置于olympus倒置显微镜(ix71)下观察并对每个视野进行拍照。
[0217]
7、利用软件(image-pro plus 7.0)统计每孔管状细胞总长度并进行student’s t-test统计学分析。
[0218]
8、结果如图7的a和b图所示，与对照组migg相比，抗体aa98和aa98系列突变体都能有效抑制内皮细胞的成管腔，尤其是h13-112抗体，抑制率为93％，远超aa98抗体的25％的抑制率，具有显著更强的抑制作用。
[0219]
实施例8三阴性乳腺癌肿瘤抑制实验
[0220]
三阴性乳腺癌是指雌激素受体(er)、孕激素受体(pr)、表皮生长因子受体(egfr)均阴性的恶性肿瘤，约占所有乳腺癌的17～25％；易复发及转移，预后差，目前尚无有效治疗方法。根据505例的乳腺癌组织芯片结果，cd146在该类肿瘤中的阳性率为66.9％，且cd146 的肿瘤患者5年生存率明显低于cd146-的肿瘤患者。本发明人前期的实验证据表明cd146可能是三阴性乳腺癌的有效治疗靶标。
[0221]
实验方法及结果：我们首先构建了免疫缺陷小鼠的人源三阴性乳腺癌肿瘤模型，方法如下：mda-mb-231乳腺癌细胞系107接种于balb/c裸鼠右侧胁部皮下，待肿瘤生长到5mm直径大小进行抗体治疗实验。小鼠随机分为以下三组：migg组，aa98组以及h13-112组，每组15只。抗体注射方式为腹腔注射，剂量为200μg/只，每周两次。每次注射前用游标卡尺测量肿瘤长和宽，肿瘤体积按照以下公式计算：体积＝长*宽*宽/2。结果显示，aa98抗体治疗第二次开始，肿瘤生长即表现出生长延缓，说明aa98处理能较好抑制肿瘤的生长；而相对于aa98来说，优化后的抗体h13-112对肿瘤的抑制效果更明显。结果见图8。