甘油产生受到抑制的重组耐酸酵母和使用其生产乳酸的方法与流程

1.本发明涉及一种具有乳酸产生能力并且甘油产生受到抑制的重组耐酸酵母及使用其制备乳酸的方法。更具体地，本发明涉及其中引入了参与乳酸产生的基因并且缺失或减弱了参与甘油产生的基因的重组耐酸酵母，以及使用该重组耐酸酵母制备乳酸的方法。


背景技术：

2.聚乳酸(pla)是可生物降解的聚合物，其通过将乳酸转化成丙交酯并在使其进行开环聚合反应而制备。其原料乳酸通过发酵生产。pla广泛用于一次性食品容器中，其优点在于，它可以单独使用或以塑料中的组合物或共聚物的形式用于各种行业，包括汽车行业和纤维行业。另外，它是近年来已在3d打印中使用的代表性聚合物，并且是一种环保聚合物，当用于3d打印机时，它会产生较少量的有害气体和异味。
3.传统的乳酸生产过程是使用乳酸菌进行的，并且包括在使用各种形式的钙盐/ma盐或中和剂(例如氨)保持6至8的中性ph的同时进行发酵，以防止因乳酸菌产生并累积的乳酸而导致细菌死亡或其生长减慢。当发酵完成时，分离微生物，并添加硫酸以将乳酸盐(lactate)转化为乳酸，同时由于难以从水中分离盐并将其转化为丙交酯而将钙盐以caso4的形式除去。在该方法中，产生的副产物caso4的量大于乳酸的量，因此降低了工艺效率。
4.通常，pla通过发酵产生乳酸，然后通过纯化工艺将产生的乳酸转化为丙交酯。为了转化为丙交酯，需要将乳酸转化为氢化形式的工艺，而中性发酵的ph通常为6至7，因此使用大量的硫酸将中性ph改变为酸性ph。在该过程中，产生大量的中和盐，并且由于中和盐的价值低以及去除该中和盐的工艺的投资成本，经济可行性降低。
5.同时，乳酸具有l型光学异构体和d型光学异构体。存在各种各样的微生物种群。例如，主要产生l型光学异构体的乳酸菌通常也产生约5
‑
10％的d型光学异构体，主要产生d型光学异构体的菌株包括产生d型光学异构体和l型光学异构体的菌株，产生d型光学异构体和乙醇的菌株等(ellen i.garvie,microbiological reviews,106
‑
139,1980)。
6.同时，就天然产生乳酸的乳酸菌(lactobacillus)而言，为了商业化地生产乳酸，必须使用大量昂贵的营养物作为培养基。这些过多的营养成分极大地阻碍了下游聚合工艺或当丙交酯用作中间体时进行的丙交酯转化工艺，为了获得高收率和高纯度的聚合物或其前体，产生了诸如吸附、蒸馏和离子交换的纯化工艺的成本，从而进一步增加了生产成本。为了解决这些问题，已经提出了使用酵母的研究。众所周知，即使使用廉价的营养物，酵母也可以进行生长/发酵，并且还具有高的耐酸性。
7.当使用在酸中生长良好的酵母(以下称为“耐酸酵母”)生产乳酸时，在发酵过程中无需使用中和剂将培养基的ph维持在6至7，因此简化了发酵工艺，并且不需要用于去除中和剂的下游纯化工艺。此外，酵母本身会产生代谢所需的许多成分，因此与细菌(尤其是乳酸菌)相比，可以在营养水平相对较低的培养基中进行培养，从而避免了下游的纯化工艺，并明显降低了生产成本。
8.然而，使用酵母生产乳酸的技术是有要求的。要求是，作为菌株发酵性能指标的乳
酸的产量(yield)、产率(productivity)和浓度必须保持在与乳酸菌的性能相似的高水平，才能使该技术能够被商业化应用。
9.尽管已开发出使用耐酸酵母生产乳酸的技术，但在实践中，由于该技术在很多情况下在发酵中伴有中和反应，只有当在ph值保持在至少为3.7(不低于乳酸的pka值)的情况下进行发酵，才能表现出较高的发酵性能，因此将该技术确定为实现耐酸性的实用方法是不合理的，并且很难预期降低工艺中的生产成本的效果(michael sauer et al.,biotechnology and genetic engineering reviews,27:229
‑
256,2010)。
10.因此，能够降低工艺成本的耐酸酵母只有在其能够在发酵溶液的ph值不超过pka值的情况下完成发酵而不使用中和剂或以最小量使用中和剂，并且三个主要发酵指标达到了与乳酸菌相似的水平时，才能被商业应用。
11.通常，酵母以乙醇为主要产物代谢，副产物为葡萄糖，几乎不产生乳酸。另外，由于从具有高耐酸性的微生物中选择产生乳酸的菌株的可能性非常低，因此，本发明人选择了具有优异的耐酸性的酵母菌株，并试图通过基因工程方法构建一种具有乳酸产生能力并具有乙醇和甘油产生能力受到抑制的菌株。
12.因此，作为努力产生具有乳酸产生能力和甘油产生能力受到抑制的耐酸菌株的结果，本发明人通过从耐酸酵母中去除参与甘油产生的基因并进一步将编码乳酸脱氢酶的基因引入该酵母中而构建了一种重组菌株，并且发现当使用该重组菌株生产乳酸时，作为使用该重组酵母的乳酸生产中的杂质的甘油的量减少。基于这一发现，完成了本发明。


技术实现要素：

13.因此，鉴于上述问题提出了本发明，本发明的一个目的是提供一种具有乳酸产生能力和甘油产生能力受到抑制的重组耐酸酵母菌株。
14.本发明的另一个目的是提供一种使用重组耐酸酵母菌株制备乳酸的方法。
15.本发明的另一个目的是提供一种源自耐酸酵母的编码酶的基因，该酶将磷酸二羟丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸(glycerol
‑3‑
phosphate)。
16.根据本发明的一个方面，上述和其他目的可以通过提供一种具有乳酸产生能力的重组菌株来实现，其中从耐酸酵母ybc菌株(kctc13508bp)中缺失或减弱编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶的基因，并将编码乳酸脱氢酶的基因引入到该耐酸酵母ybc菌株。
17.根据本发明的另一个方面，提供了一种具有乳酸产生能力的重组菌株，其中从耐酸酵母ybc菌株(kctc13508bp)中缺失编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶的gpd1基因、编码将乳酸盐(lactate)转化为丙酮酸盐(pyruvate)的酶的cyb2基因、编码乙醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase)的adh基因，以及编码丙酮酸脱羧酶的pdc基因；并且
18.其中将编码乳酸脱氢酶的基因引入耐酸酵母ybc菌株。
19.根据本发明的另一方面，提供了一种生产乳酸的方法，该方法包括：(a)培养重组菌株以产生乳酸；和(b)收集产生的乳酸。
20.根据本发明的另一方面，提供了一种具有将磷酸羟基丙酮(hydroxyacetone phosphate)转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶活性的基因，该基因编码与包含seq id no：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上的同源性的蛋白。
21.根据本发明的另一方面，提供了一种具有将磷酸二羟丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶活性的蛋白，该蛋白与包含seq id no：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上的同源性。
22.根据本发明的另一方面，提供了一种gpd1基因的启动子，其包含seq id no：4或seq id no：5的核苷酸序列。
23.本发明的效果
24.当使用根据本发明的重组耐酸酵母生产乳酸时，维持乳酸的产生的同时减少甘油的产生，从而在转化为丙交酯的低聚反应中可以抑制甘油造成的交联，因此可以提高乳酸转化为丙交酯的转化率(conversion yield)。
附图说明
25.从以下结合附图的详细描述中，将更清楚地理解本发明的上述和其他目的、特征和其他优点，其中：
26.图1示出了用于从本发明的ybc4菌株的基因组中缺失gpd1(g1544)/gpd2(g5617)基因或缺失所述基因并插入代替其的ldh基因的缺失盒(deletion cassette)的实例。
27.图2示出了根据本发明的重组酵母菌株ybc5菌株的发酵图曲线。
具体实施方式
28.除非另有定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的相同的含义。通常，本文使用的术语在本领域中是众所周知的并且是通常使用的。
29.耐酸酵母的特征在于即使在酸性ph下也以高速率消耗糖，表现出高生长速率，并且在发酵条件下将消耗的糖转化为所需的产物。在本发明人的先前研究中，在几个酵母文库中从具有这些特征的酵母中选择了耐酸酵母菌株(kctc13508bp)，并且该耐酸酵母菌株(kctc13508bp)即使在乳酸浓度为40g/l至80g/l的情况下也具有高生长速率和高糖消耗率。通过控制代谢回路(metabolic circuit)以提高耐酸酵母ybc菌株的乳酸产生能力并抑制乙醇产生能力，通过从菌株(其通过从ybc菌株中缺失编码乙醇脱氢酶的基因和编码丙酮酸脱羧酶的基因并将乳酸脱氢酶基因引入ybc菌株而获得)中缺失编码将乳酸盐转化为丙酮酸盐的细胞色素b2酶的基因来生产重组菌株。另外，为了抑制所构建的菌株中甘油的产生，通过缺失编码将磷酸羟基丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的甘油
‑3‑
磷酸脱氢酶的基因来构建重组菌株，并且发现该重组菌株具有提高的乳酸产生能力和被抑制的乙醇产生能力和甘油产生能力。
30.另外，由于甘油减少而造成的过量碳可分配给其他副产物。然而，当转化为乳酸时，有可能进一步提高乳酸产生的产率(例如，增强乳酸脱氢酶)。
31.因此，一方面，本发明涉及一种具有乳酸产生能力的重组菌株，其中从耐酸酵母ybc菌株(kctc13508bp)中缺失或减弱了编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶的基因，并将编码乳酸脱氢酶的基因引入所述耐酸酵母ybc菌株。
32.通常，甘油是酵母的主要副产物，其功能是平衡细胞中的氧化还原反应(redox)，特别是调节乙醇或乳酸盐生产过程中发生的细胞内nad/nadh的平衡，其在抑制由渗透压导致的细胞内水流失中起重要作用，所述渗透压因细胞外水活性的降低而产生，并且甘油还
充当甘油
‑3‑
磷酸的前体，甘油
‑3‑
磷酸是主要的能量储存物(major energy storage)甘油三酯的前体(roeland costenoble et al.,yeast 16:1483
‑
1495,2000；elke nevoigt and ulf stahl,fems microbiology reviews 21:231,1997)。
33.抑制酵母中甘油产生反应的已知方法包括去除或减弱与甘油产生直接相关的基因，以及修饰与调节机制(如渗透压)有关的基因。对于诸如渗透压之类的调节机制，存在一个hog(高渗透压甘油)信号传导途径(joseph p dexter et al.,bmc systems biology,9:17,2015)，并且通过去除或修饰相关的主要因子ssk1(细胞质磷脂接力转移中间渗透感应器和调节器，cytoplasmic phosphorelay intermediate osmosensor and regulator)等抑制甘油产生(hubmann et al.,biotechnology for biofuels,6:87,2013；hubmann et al.,metabolic engineering,17:68,2013)。
34.然而，通过突变调节这些信号传导途径需要大量的研究，并且对于某些菌株，例如耐酸酵母ybc菌株(kctc13508bp)，需要对每个步骤进行验证。因此，使用了更通用的方法，即，去除与gpd(nad依赖性甘油
‑3‑
磷酸甘油脱氢酶)和gpp(dl
‑
甘油
‑3‑
磷酸磷酸酶)直接相关的基因的方法。gpd1主要起调节酵母的抗渗透性(osmotic resistance)的作用，gpd2是gpd1的同种型，在酿酒酵母(s.cerevisiae)中表达以调节厌氧条件下的细胞活性。另外，在酿酒酵母中用于将甘油
‑3‑
磷酸转化为甘油的两个gpp基因是众所周知的。gpp1在厌氧条件下表达，而gpp2在渗透压胁迫下表达。去除gpd和gpp的每种异构体后，每种情况对甘油生成的影响会因培养条件和相应菌株而异(roeland costenoble et al.,yeast 16:1483,2000；jacobus albertyn et al.,molecular and cellular biology,4135,1994)。因此，认为最好的方法是使用实验来检测每种情况的效果。
35.根据本发明，编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶的基因可以是gpd1或gpd2基因，并且优选地，编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶的基因是gpd1(g1544)基因，其中该基因可以包含seq id no：1或seq id no：2的核苷酸序列。
36.在本发明的一个实施方案中，从ybc菌株中去除了作为主要adh基因的g4423基因，将源自植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)的、seq id no：12的ldh基因引入到g4423基因的位置处，从中去除作为cyb2基因的g3002基因(以下称为“g3002
‑
1基因”)，并在g3002
‑
1基因的位置处引入ldh基因，以构建重组菌株ybc2。从重组菌株ybc2中除去g2947基因，并将ldh基因导入其中，以构建重组菌株ybc4。从重组菌株ybc4中除去作为gpd1基因的g1544基因，以构建重组菌株ybc5。培养重组菌株，并证实检测到了菌株的乳酸产生能力提高，乙醇产生能力和甘油产生能力受到抑制。
37.根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步缺失编码乙醇脱氢酶的基因(adh基因)，该编码乙醇脱氢酶的基因是g4423基因，并且该g4423基因包含seq id no：6或seq id no：7的序列。
38.根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步引入ldh基因代替adh基因。
39.根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步缺失编码丙酮酸脱羧酶的基因(pdc基因)，该编码丙酮酸脱羧酶的基因是g3002基因，并且该g3002基因包含seq id no：8或seq id no：9的序列。
40.根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步引入ldh基因代替pdc基因。
41.根据本发明，该重组菌株的特征在于，可以进一步缺失将乳酸盐转化为丙酮酸盐
的细胞色素b2基因(cyb2基因)，该细胞色素b2基因是g2947基因，并且该g2947基因包含seq id no：10或seq id no：11的序列。
42.根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步引入ldh基因代替cyb2基因。
43.根据本发明，重组菌株的特征在于，可以进一步引入ldh基因代替gpd1基因。
44.根据本发明，与亲本菌株，即ybc菌株(kctc13508bp)，以及突变菌株ybc1/ybc2/ybc4菌株相比，通过g1544基因的缺失或减弱衍生自亲本菌株的ybc5菌株具有降低的或被抑制的甘油产生能力。
45.根据本发明，引入的编码乳酸脱氢酶的基因优选为源自瑞士乳杆菌(l.helveticus)的ldh基因，源自米根霉(r.oryzae)的ldh基因或源自植物乳杆菌(l.plantarum)的ldh基因，更优选为源自植物乳杆菌的ldh基因。
46.在另一方面，本发明是具有乳酸产生能力的重组菌株，其中，从耐酸酵母ybc菌株(kctc13508bp)中缺失编码将磷酸二羟丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶gpd1基因、编码将乳酸盐转化为丙酮酸盐的酶的cyb2基因、编码乙醇脱氢酶的adh基因以及编码丙酮酸脱羧酶的pdc基因，并且其中将编码乳酸脱氢酶的基因引入该耐酸酵母ybc菌株中。
47.根据本发明，编码乳酸脱氢酶的基因在缺失的cyb2基因、adh基因、pdc基因和gpd1基因中的至少一个的位置处引入，并由被缺失和替换的基因的启动子调节。
48.在本发明的一个实施方案中，与ybc4菌株(δg4423：：ldh/δg3002
‑
1：：ldh/δg2947：：ldh)相比，ybc5菌株(δg4423：：ldh/δg3002
‑
1：：ldh/δg2947：：ldh/δg1544)表现出大大降低的甘油产生能力。尽管甘油没有被完全除去，但是就菌株的环境适应性而言，这是相当有利的。换句话说，完全丧失甘油产生能力的菌株丧失了作为其原始功能的对诸如外部渗透压的胁迫环境(stress environment)的适应能力，并且变得很弱。这些菌株不能承受诸如一般商业规模的压力、盐浓度和产物抑制之类的胁迫(stress)，因此不能正常进行发酵。因此，本发明的菌株表现出非常优异的性能，以实现所需的甘油减少(glycerol reduction)而不会引起不利影响。
49.因此，另一方面，本发明涉及一种生产乳酸的方法，其包括(a)培养重组菌株以产生乳酸，和(b)收集产生的乳酸。
50.根据本发明，可以预期具有大幅度增加的乳酸盐产生(lactate production)、大幅度减少的乙醇产生和大幅度减少的甘油副产物的优异的耐酸菌株。
51.另一方面，本发明涉及一种具有将磷酸羟基丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶活性的基因，该基因编码与包含seq id no：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上的同源性的蛋白。
52.根据本发明，该基因具有将磷酸羟基丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶活性，并且编码与包含seq id no：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上，优选95％以上，甚至更优选98％以上，并且还更优选99％以上的同源性的蛋白。
53.在本发明中，该基因可以包含seq id no：1或seq id no：2的核苷酸序列。
54.在另一方面，本发明涉及一种具有将磷酸二羟丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶活性的蛋白，该蛋白与包含seq id no：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上的同源性。
55.在本发明中，该蛋白具有将磷酸二羟丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶活性，并且与包含seq id no：3的氨基酸序列的蛋白具有90％以上，优选95％以上，甚至更优选98％以上，并且还更优选99％以上的同源性。
56.在另一方面，本发明涉及一种gpd1基因的启动子，其包含seq id no：4或seq id no：5的核苷酸序列。
57.如本文所用，术语“耐酸酵母”定义为当培养基含有浓度为至少1m的有机酸(特别是乳酸)时，与培养基不含有机酸时相比，能够在小于有机酸的pka值的ph下保持至少10％的生物质消耗率(例如糖消耗率)或至少10％的比生长速率的酵母。更具体地，术语“耐酸酵母”定义为与5以上的ph相比，在2至4的ph下能够保持至少10％的生物质消耗率(例如糖消耗率)或至少10％的比生长速率的酵母。
58.根据本发明的重组酵母可以通过按照常规方法将基因插入宿主酵母的染色体中或通过将包括该基因的载体引入宿主酵母中来产生。
59.作为宿主酵母，通常使用具有高的dna引入效率和被引入的dna的表达效率高的宿主细胞。在本发明的一个实施方案中，使用耐酸酵母，但是本发明不限于此，并且可以使用任何类型的酵母，只要其能够充分表达靶dna即可。
60.重组酵母可以根据任何转化方法来制备。术语“转化”是指将dna引入宿主以使dna以染色体的系数复制或通过染色体整合引入dna的现象，并且是指通过将外部dna引入细胞来人工诱导遗传变化的现象。一般的转化方法包括电穿孔、乙酸锂
‑
peg等。
61.另外，在本发明中，可以使用任何通常已知的基因工程方法作为将基因插入宿主微生物的染色体中的方法。例如，存在使用逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、单纯疱疹病毒载体、痘病毒载体、慢病毒载体、非病毒载体等的方法。“载体”是指dna产物，其包含与可在合适的宿主中表达dna的合适调控序列可操作地连接的dna序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒或仅仅是潜在的基因组插入物。当转化到合适的宿主中时，载体可以独立于宿主基因组复制或执行功能，或者其中一些可以与基因组整合。质粒是目前最常用的载体形式，但是线性dna也是酵母基因组整合的常用形式。
62.典型的质粒载体包括(a)有效地进行复制以便在每个宿主细胞中包括预定量的质粒载体的复制起点，(b)抗生素抗性基因或营养缺陷型标记基因，以筛选用质粒载体转化的宿主细胞，和(c)插入外源dna片段的限制酶切割位点。即使不存在适当的限制酶切割位点，也可以按照常规方法(吉布森组装)使用合成的寡核苷酸衔接子或接头容易地连接载体和外源dna。如果需要，也通常使用合成和使用整个所需序列的方法。
63.此外，当一核酸序列与另一核酸序列基于彼此之间的功能关系对齐(aligned)时，称为与之“可操作地连接”。可以是以这样的方式连接的基因和控制序列，以便当合适的分子(例如转录激活蛋白)与控制序列连接时能够进行基因表达。例如，当作为参与多肽分泌的前蛋白表达时，前序列(pre
‑
sequence)或分泌前导序列(secretory leader)的dna可操作地连接至多肽的dna；当启动子或增强子影响序列的转录时，启动子或增强子可操作地与编码序列连接；当核糖体结合位点影响序列的转录时，核糖体结合位点可操作地与编码序列连接；或当放置核糖体结合位点以促进翻译时，核糖体结合位点可操作地与编码序列连接。
64.通常，术语“可操作地连接”是指连接的dna序列与其接触，或分泌前导序列与其接触并存在于阅读框中。但是，增强子不必与其接触。这些序列的连接是通过在方便的限制性酶切位点处进行连接(结合)来进行的。当不存在这样的位点时，使用根据常规方法的合成寡核苷酸衔接子或接头。
no：20)及其蛋白(seq id no：18和seq id no：21)的缺失盒。
78.本文中使用的缺失盒如图1所示，选择相应的限制酶位点(restriction enzyme site)或抗生素抗性基因并去除抗生素抗性基因的方法在相关技术中是众所周知的，并且可以进行各种修改来使用。
79.通常，当同时去除产生甘油的基因中的gpd1和gpd2或gpp1和gpp2时，菌株的生长和适应外部环境的能力被完全阻断，因此菌株对渗透压等非常敏感并且不适用于发酵，这在本领域中是众所周知的。因此，当在去除gpd1或gpd2后发现甘油减少不够充分时，从每个gpd1/2被去除的菌株中进一步去除gpp1 v1或gpp1 v2作为增强甘油减少的策略。
80.实施例2：gpd基因表达水平的测定
81.为了确认该ybc菌株的gpd1(g1544)和gpd2(g5617)的表达水平，使用以下引物和作为管家基因的alg9基因进行rt
‑
qpcr。本实施例中使用的rt
‑
qpcr方法将描述如下。将对数生长期间的ybc菌株提取rna，并使用rna为模板生成cdna。合成了针对靶基因(gpd1和gpd2)和管家基因(用作ref基因)中的每一个的特异性引物，并将其用于qpcr。实验中使用的ref基因为alg9，用所用引物扩增的片段大小为147
±
3bp。
82.alg9正向引物：ctttgagtgcaagtatcgcc(seq id no：22)
83.alg9反向引物：tgtgtaattgttcaccaaagcc(seq id no：23)
84.gpd1(g1544)正向引物：gtcgattctcatgttcgtgc(seq id no：24)
85.gpd1反向引物：cttagcgacttcagtagcga(seq id no：25)
86.gpd2(g5617)正向引物：catgtatcgaatcaagttcgtg(seq id no：26)
87.gpd2反向引物：caacttctggtgctaaatttgc(seq id no：27)
88.关于该基因在该ybc菌株中的表达水平，在培养14小时后，该ybc菌株表现出的gpd1表达率是alg9的表达率的约20倍，在培养23小时后，该ybc菌株表现出的gpd1表达率是alg9的表达率的约70倍，并且该ybc菌株表现出非常低的gpd2表达率，与alg9的表达率相似。
89.上述结果初步表明，gpd1在该ybc菌株中作为将磷酸二羟丙酮转化为甘油
‑3‑
磷酸的酶起着主要作用。为了验证其实际作用，构建了已去除每个基因的菌株。
90.实施例3：去除了gpd基因的重组耐酸酵母菌株的构建
91.从该ybc菌株的基因组中去除分别用gpd1基因、gpd2基因、gpp1v1基因和gpp1 v2基因注释的g1544基因、g5617基因、g5443基因和g4356基因以构建菌株。
92.用于去除基因的耐酸酵母菌株是ybc1菌株，ybc1菌株通过将ldh基因引入该常规ybc菌株(而不是ybc野生型菌株)并从中缺失adh(乙醇脱氢酶)而构建，由此，通过从ybc1菌株中去除g3002
‑
1基因(pdc基因)并将ldh引入其中而构建能够高效产生乳酸并且抑制乙醇产生的ybc2菌株，乳酸消耗能力被去除的ybc4菌株通过将ldh基因引入该菌株并去除消耗乳酸盐的基因g2947而构建。
93.通过从ybc4菌株中去除gpd1(g1544)基因(作为二倍体菌株，去除等位基因1和等位基因2,)来构建ybc5，制备下表1中的引物以鉴定该菌株的基因型，根据该菌株的基因组dna确定该菌株的基因型。另外，同时，通过从ybc5菌株中去除gpd2(g5617)基因来构建菌株，并且比较了制备的菌株之间在发酵期间的甘油产生能力。
94.菌株的构建方法如下：
95.ybc1菌株是通过从该ybc菌株中除去作为ybc菌株的主要adh基因的g4423基因并将源自植物乳杆菌(lactobacillus plantarum)的seq id no：12的ldh基因引入g4423的位置而获得的菌株。基于g4423及其utr的信息，构建去除了每个基因的orf并包含5'utr和3'utr的基因盒，并将其用作供体dna。对于g4423的每个等位基因，相应的5'utr包含seq id no：28和seq id no：29的序列，而3'utr包含seq id no：30和seq id no：31的序列。采用如上所述的使用限制性酶的克隆方法、吉布森组装和使用基因合成的方法制备供体dna。合成seq id no：12的ldh，然后将其引入g4423的orf位点以制备供体dna，并且将供体dna引入ybc以构建重组菌株ybc1。
96.另外，在ybc菌株的基因组测序中g3002
‑
1基因是位于骨架72处的基因，并作为pdc基因。从ybc1菌株中去除g3002
‑
1基因(位于骨架(scaffold)72处的基因)，并将seq id no：12的ldh基因引入其中，以构建重组菌株ybc2。
97.使用相应的utr作为重组位点构建用于替换g3002基因的盒。与上述将ldh引入ybc1的g4423基因(adh)的位点的方法类似，使用g3002
‑
1的utr构建盒。然而，为了简化基因替换过程，在不考虑等位基因变异的情况下制备了针对一个等位基因的供体盒，但是也可以为每个等位基因制备一个供体盒。另外，对于用于基因替换的引物，除了用于制备缺失菌株(deletion strain)的引物之外，分别使用如下能够检测ldh和g3002
‑
1的utr的一对引物，以提高基因替换的准确性。
98.g3002
‑
1 utr
‑
ldh
‑
正向：gcaggatatcagttgtttg(seq id no：32)
99.g3002
‑
1 utr
‑
ldh
‑
反向：aataccttgttgagccatag(seq id no：33)
100.另外，ybc4菌株是通过从ybc菌株中缺失作为ybc2菌株的主要cyb2基因的g2947基因，并在g2947的位置处引入源自植物乳杆菌的seq id no：13的ldh基因而构建的菌株。在ybc菌株的基因组测序中g2947基因是位于骨架41处的基因。基于g2947及其utr的信息，构建去除了每个基因的orf并包含5'utr和3'utr的基因盒，并将其用作供体dna。对于g2947的每个等位基因，相应的5'utr包含seq id no：34和seq id no：35的序列，而3'utr包含seq id no：36和seq id no：37的序列。采用如上所述的使用限制性酶的克隆方法、吉布森组装和使用基因合成的方法制备供体dna。
101.然而，为了简化基因替换过程，在不考虑等位基因变异的情况下制备针对一个等位基因的供体盒，但是也可以为每个等位基因制备一个供体盒。
102.菌株的构建方法如下：
103.ybc5菌株是通过从ybc4菌株中缺失作为ybc4菌株的gpd1基因的g1544基因而构建的菌株。在ybc菌株的基因组测序中g1544基因是位于骨架19处的基因。基于g1544及其utr的信息，构建去除了每个基因的orf并包含5'utr和3'utr的基因盒，并将其用作供体dna。对于g1544的每个等位基因，相应的5'utr包含seq id no：38和seq id no：39的序列，而3'utr包含seq id no：40和seq id no：41的序列。采用如上所述的使用限制性酶的克隆方法、吉布森组装和使用基因合成的方法制备供体dna。
104.为了简化基因替换过程，在不考虑等位基因变异的情况下制备了针对一个等位基因的供体盒，但是也可以为每个等位基因制备一个供体盒。另外，当使用目前商业化的基因工程技术(crispr)时，可以在不使用抗生素标记的情况下制备和应用供体盒。
105.另外，对于基因替换后用于基因分型的引物，如下表2所示，可用于鉴定g1544和
g5617的基因型以增加基因替换鉴定的准确性的引物对将在后面详细描述，如表2所示。
106.[表2]
[0107]
用于鉴定g1544和g5617的引入的引物组
[0108][0109]
制备的重组菌株的基因型如下：
[0110]
ybc2：δg4423：：ldh/δg3002
‑
1：：ldh，
[0111]
ybc4：δg4423：：ldh/δg3002
‑
1：：ldh/δg2947：：ldh，
[0112]
ybc5：δg4423：：ldh/δg3002
‑
1：：ldh/δg2947：：ldh/δg1544，
[0113]
ybc5a：δg4423：：ldh/δg3002
‑
1：：ldh/δg2947：：ldh/δg5617。
[0114]
实施例4：在通过从ybc4菌株中缺失gpd1基因而构建的重组ybc菌株中确认乳酸产生作用和甘油产生抑制作用
[0115]
对于实施例3中构建的重组菌株ybc5和重组菌株ybc5a，接种od为0.5，此处使用的培养基为补充有10％葡萄糖的m
‑
yp培养基(5g/l蛋白胨，4g/l酵母提取物，5g/l kh2po4，2g/l mgso4·
7h2o，0.15g/l尿嘧啶)，在500ml烧瓶中于30℃和150rpm下培养64小时。
[0116]
[表3]
[0117]
ybc4、ybc5和ybc5a的培养结果
[0118][0119]
结果，从表3可以看出，与ybc4菌株相比，ybc5菌株表现出80％的甘油产生抑制
(glycerol
‑
producing inhibition)，但是产生了少量的甘油。如上所述，甘油在微生物对环境的适应中，特别是对渗透压的适应中起关键作用，通过同时去除gpd1和gpd2或同时去除gpp1和gpp2来完全抑制甘油产生会使菌株对渗透压极为敏感，并使菌株无法正常生长和发酵。因此，认为ybc5当前的甘油减少率(glycerol reduction rate)是合适的。然而，在该菌株中，甘油的减少并没有直接极大地影响乳酸产生的增加，但是甘油分布在各种其他副产物中。因此，需要使用一种方法来提高未来乳酸发酵的产率。
[0120]
甘油还可能影响环保聚合物pla的产生过程中的聚合反应，据报道，在甘油的存在下，由于甘油的结构，pla的结构从线性形式变为支链形式(wen shen et al.,r.soc.open sci.5:180134,2018)。pla结构的这种变化可能会在许多后续过程中起到杂质的作用，例如，可能会通过l型pla和d型pla(两者之间互为光学异构体)之间的范德华力影响立体复合pla的物理性质和形成，以及用于转化为丙交酯的乳酸低聚物的形成。当然，可能存在通过用于去除甘油的纯化过程来减少甘油的方法，但是通过本发明中的基因工程来减少甘油是减少后续工艺中此类问题发生率的有效策略。
[0121]
与去除了gpd1的ybc5菌株相比，去除了gpd2的ybc5a菌株表现出有些难以理解的结果，包括几乎没有减少甘油的作用，减少乳酸生成和增加乙醇生成。已确定从中去除了gpd2的ybc5a菌株不适合用作乳酸产生菌株，因为它抑制了整体的乳酸发酵。
[0122]
在用于构建ybc5菌株的ybc1菌株至ybc4菌株的制备中，当去除主基因时引入了ldh基因，以提高菌株的乳酸产生能力。然而，在ybc5菌株的制备中，当去除gpd1基因时没有引入ldh基因。其原因是，在三个位置处引入了源自植物乳杆菌的seq id no：12的两个ldh基因(总共6个基因)，因此可以预测，考虑到内部反馈调节，引入上述相同的基因对额外增加活性的影响可以忽略不计，并且如实施例2所述，gpd1/2在一般条件下的表达率高于ref基因alg9的表达率，但低于adh或pdc的表达率，并且当基因组中存在彼此类型相同的多个基因时，基因组可能不稳定。
[0123]
实施例5：ybc5菌株的发酵性能的评估
[0124]
在该实施例中，在生物反应器中而不是在烧瓶培养物中培养ybc5菌株，以确认其乳酸发酵性能。
[0125]
将ybc5菌株在myp培养基(5g/l蛋白胨、4g/l酵母提取物、5g/lkh2po4、2g/l mgso4·
7h2o和0.15g/l尿嘧啶)中培养，在2天内，在40ml myp培养基中进行第一次种子培养(seed culture)，并在220ml myp培养基中进行第二次种子培养，然后收获所有细胞并接种在2l myp培养基中。接种od为0.85，在补充有12％葡萄糖的myp培养基中开始培养，并将caco3溶液间歇地注入培养基中以保持ph为3。在30℃和500rpm，空气流量为0.25vvm的条件下进行培养。
[0126]
结果，从图2可以看出，ybc5菌株在短时间内在生物反应器中消耗了所有葡萄糖并产生乳酸，并且在最终ph为3.3时，乳酸产率为0.81(g/g)，生产率为1.6g/l/小时，所产生的乳酸的浓度为88.2g/l，甘油的产率为0.01(g/g)。这表明在生物反应器中获得了与实施例3相同的结果。另外，基于未来的初始od和培养条件的改善，期望该性能的进一步改善是可能的。
[0127]
尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但是本领域技术人员将理解，提供该描述出于说明性目的提出了优选的实施方案，并不应解释为限制本发明的范围。因此，本发明
的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。