一种MERS-CoVS-RBD线性B细胞表位及其特异性识别单克隆抗体和应用的制作方法

一种mers
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cov s
‑
rbd线性b细胞表位及其特异性识别单克隆抗体和应用
技术领域
1.本发明涉及一种mers
‑
cov s
‑
rbd线性b细胞表位及其特异性识别单克隆抗体和应用，属于分子生物学和免疫学领域。


背景技术：

2.中东呼吸综合征(middle east respiratory syndrome，mers)是由中东呼吸综合征冠状病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus，mers
‑
cov)引起的一种传染性和高致死性的呼吸系统疾病，主要表现为非典型性肺炎和急性呼吸综合征，严重者可引发肾衰竭而死亡。中东呼吸综合征冠状病毒s蛋白(棘突糖蛋白，spike glycoprotein)是三聚体状态的i型跨膜糖蛋白，位于病毒膜表面，介导病毒附着宿主细胞及病毒
‑
细胞膜的融合，是细胞靶向性和发病机制的主要决定因子。s蛋白包含s1亚基和s2亚基两个功能子单元，其中s1亚基包含n端结构域(n
‑
terminal domain，ntd)和独立折叠的受体结合域(receptor
‑
binding domain，rbd)，rbd与细胞受体二肽激肽酶4(dpp4)结合，介导病毒颗粒附着于细胞。研究发现，全长s蛋白、s1以及rbd均可作为开发mers
‑
cov疫苗和治疗抗体的靶点。因此s
‑
rbd目前成为许多科研工作者的主要研究对象。然而，对于mers
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cov s
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rbd抗原表位鉴定及其免疫识别等问题尚有待全面解决。


技术实现要素：

3.针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种mers
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cov s
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rbd线性b细胞表位及其特异性识别单克隆抗体和应用。
4.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
5.一种mers
‑
cov s
‑
rbd线性b细胞表位肽，所述表位肽的氨基酸序列为：ftcsqis。
6.一种单克隆抗体6e8，特异性识别含有所述的mers
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cov s
‑
rbd线性b细胞表位序列肽或蛋白。
7.所述单克隆抗体6e8是由保藏编号为cctcc no:c2021159的杂交瘤细胞株6e8分泌，该杂交瘤细胞株6e8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年7月6日。
8.所述的mers
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cov s
‑
rbd线性b细胞表位肽在制备mers诊断试剂或药物中的应用。
9.编码所述mers
‑
cov s
‑
rbd线性b细胞表位肽的核苷酸序列。
10.所述核苷酸序列为tttacatgtagccagatctct。
11.本发明有益效果：
12.本发明利用hek 293f细胞表达系统表达mers
‑
cov s1重组蛋白，经镍填料亲和层析和凝胶过滤层析两步纯化步骤，获得了高纯度、具有生物学活性和免疫原性的目的蛋白。随后免疫balb/c小鼠，获得单克隆抗体；利用酶联免疫吸附试验(elisa)鉴定其中一株单克隆抗体6e8可特异性识别rbd
‑
rfc蛋白；利用真核细胞hek
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293t重组表达mers
‑
cov s
‑
rbd重
组蛋白不同片段，通过dot
‑
blot鉴定获得的6e8单克隆抗体特异性识别mers
‑
cov s
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rbd n端区域，序列为tkllslfsvndftcsqispaai；利用酶联免疫吸附试验(enzyme
‑
linked immunosorbent assay，elisa)进一步鉴定mers
‑
cov s
‑
rbd n端区域合成多肽，鉴定获得的6e8单克隆抗体特异性识别序列为ftcsqis的线性b细胞表位。
13.本发明综合利用分子生物学和免疫学等技术，鉴定了一种mers
‑
cov s
‑
rbd的全新线性b细胞表位，利用本发明制备的6e8单克隆抗体对含有mers
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cov s
‑
rbd线性b细胞表位的多肽、蛋白进行识别，表明该mers
‑
cov s
‑
rbd线性b细胞表位可被特异性识别。
14.本发明鉴定的mers
‑
cov s
‑
rbd线性b细胞表位丰富了mers
‑
cov s
‑
rbd免疫学功能，为后续研究s蛋白抗原漂移提供参考，可应用于抗病毒药物研发。
附图说明
15.图1是mers
‑
cov s1重组蛋白纯化结果。
16.图中，m：蛋白marker，1：mers
‑
cov s1蛋白。
17.图2是mers
‑
cov s
‑
rbd重组蛋白纯化结果。
18.图中，m：蛋白marker，1：mers
‑
cov s
‑
rbd蛋白。
19.图3是elisa鉴定制备的mers
‑
cov s
‑
rbd单克隆抗体的结果。
20.图4是dot
‑
blot鉴定制备的mers
‑
cov s
‑
rbd单克隆抗体识别的mers
‑
cov s
‑
rbd片段。
21.图中，a:mers
‑
cov s
‑
rbd截短片段示意图，b:dot
‑
blot鉴定制备的mers
‑
cov s
‑
rbd单克隆抗体识别的截短体片段，c：dot
‑
blot鉴定制备的mers
‑
cov s
‑
rbd单克隆抗体识别的n1截短体片段。
22.图5是elisa鉴定制备的mers
‑
cov s
‑
rbd单克隆抗体识别的mers
‑
cov s
‑
rbd线性b细胞表位的结果。
具体实施方式
23.以下结合实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
24.实施例1.mers
‑
cov s1、s
‑
rbd重组蛋白的制备与纯化
25.1.1mers
‑
cov s1蛋白克隆构建及重组蛋白在hek
‑
293f细胞中的表达及纯化
26.将mers
‑
cov s1基因序列(genbank accessionafs88936.1)交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，氨基端引入cd5信号肽，羧基端引入6
×
his标签，序列插入pcdna3.1载体，得到重组质粒s1
‑
his。
27.将重组质粒s1
‑
his转染人胚肾上皮细胞293f(hek
‑
293f)，扩大培养转染细胞。将上清通过经裂解液平衡的镍离子亲和柱(ge healthcare)，经buffera(20mm tris
‑
hcl ph 7.5，150mm nacl，20mm咪唑)进行漂洗，随后用buffer b(20mm tris
‑
hcl ph 7.5，150mm nacl，200mm咪唑)进行洗脱，收集洗脱液即为蛋白粗纯溶液。
28.将蛋白粗纯溶液通过分子筛superdex 200increase 10/300gl(ge healthcare)进一步纯化，使用buffer c(20mm tris
‑
hcl ph 7.5，150mm nacl)，收集蛋白峰组分并经sds
‑
page检测蛋白样品的纯度，通过图1可得，经过分子筛纯化后得到纯度较高的重组s1
‑
his蛋白，分子量约为120kd。s1
‑
his重组蛋白将用于后续抗体制备。
29.1.2mers
‑
cov s
‑
rbd蛋白克隆构建及重组蛋白在昆虫细胞中的表达及纯化
30.s
‑
rbd编码基因(genbank accessionafs88936.1,367
‑
606aa)交由生工生物工程(上海)股份有限公司进行合成，同时羧基端引入兔源fc(rabbit igg fc)序列、6
×
his标签，随后将rbd
‑
rfc基因经pcr扩增，上游引入bamhⅰ酶切位点，下游引入xhoⅰ酶切位点，得到pcr产物。将gp67信号肽基因通过同源重组方法插入pfastbac1载体，得到重组载体pfastbac1
‑
gp67。将pcr产物及pfastbac1
‑
gp67载体经bamhⅰ、xhoⅰ双酶切后回收，经dna连接酶连接，转化大肠杆菌top10，经过基因测序鉴定，成功构建重组质粒pfastbac1
‑
gp67
‑
rbd
‑
rfc。
31.将重组质粒pfastbac1
‑
gp67
‑
rbd
‑
rfc转化至dh10bac感受态细胞，经蓝白斑筛选，挑选白色菌落于lb液体培养基，振荡培养过夜，随后使用qiagen试剂盒提取重组黏粒。以0.8
×
105～1
×
106/孔的细胞数将处于对数生长期的sf21细胞加入六孔板，静置15min以上使细胞充分贴壁。在cellfectinⅱ介导下，将重组黏粒转染至上述贴壁sf21昆虫细胞，观察细胞病变情况。细胞发生典型病变后，收取细胞培养上清作为第一代重组杆状病毒p1。在10cm无菌培养皿中加入无血清培养基10ml，随后加入sf21细胞，使细胞总数在6
×
106个左右，轻晃培养皿使细胞均匀分布，静置10min，待细胞贴壁后，向其中加入800μl左右的p1病毒，将培养皿放入28℃培养箱，避光静置培养3～4d，收获细胞培养上清，即为2代病毒p2。使用同样方法扩增，收集p3代杆状病毒。以5个感染复数的p3代杆状病毒接种至对数生长期的sf21细胞，细胞振荡培养72h，4℃条件下3000rpm离心30min，收集细胞培养上清。
32.将上清通过经裂解液平衡的镍离子亲和柱(ge healthcare)，经buffera(20mm tris
‑
hcl ph 7.5，150mm nacl，20mm咪唑)进行漂洗，随后用buffer b(20mm tris
‑
hcl ph 7.5，150mm nacl，200mm咪唑)进行洗脱，收集洗脱液即为蛋白粗纯溶液。将蛋白粗纯溶液通过分子筛superdex 200increase 10/300gl(ge healthcare)进一步纯化，使用buffer c(20mm tris
‑
hcl ph 7.5，150mm nacl)，收集蛋白峰组分并经sds
‑
page检测蛋白样品的纯度，通过图2可得，经过分子筛纯化后得到纯度较高的重组rbd
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rfc蛋白，分子量约为50kd。rbd
‑
rfc蛋白将用于后续抗体筛选。
33.实施例2.mers
‑
cov s
‑
rbd重组蛋白单克隆抗体制备与鉴定
34.2.1mers
‑
cov s
‑
rbd重组蛋白单克隆抗体制备
35.用实施例1中纯化所得重组s1
‑
his蛋白作为抗原免疫3只8周龄的spf级balb/c雌性小鼠，抗原与等体积完全弗氏佐剂(首免)或不完全弗氏佐剂(加强免疫)混合并进行乳化，充分混合至油包水状态进行颈背部皮下多点注射，3次加强免疫，每次免疫间隔周期2周，之后进行效价检测，高于>1:10000后1周内进行腹腔冲击，直接将免疫剂量的抗原溶于250μl的pbs中，具体免疫次数及免疫剂量如表1所示：
36.表1.免疫次数及免疫剂量
37.免疫次数免疫原制备免疫途径免疫剂量一免抗原 完全弗氏佐剂 pbs皮下1μg/只二免抗原 不完全弗氏佐剂 pbs皮下1μg/只三免抗原 不完全弗氏佐剂 pbs皮下1μg/只四免抗原 不完全弗氏佐剂 pbs皮下1μg/只冲击加强抗原 pbs腹腔2μg/只
38.免疫示例：一免中，将1μg的抗原溶于250μlpbs，然后与佐剂按体积1:1混合。
39.腹腔冲击3天后，无菌取小鼠脾脏，制备成单细胞悬液；处于对数期的sp2/0细胞处理后，与脾细胞以体积比1:5比例混合，50％(wt)peg1500作用1min，以基础培养基dmem稀释终止，低速离心后，再用含20％(wt)胎牛血清的hat培养基轻轻悬浮并混匀，按照2
×
107/板铺至预先准备好的饲养层细胞板里，置于5％co2，37℃下培养。细胞融合10天后，融合的杂交瘤细胞形成克隆并且占据一定面积的细胞培养孔。经酶联免疫吸附试验(elisa)初步鉴定后，将阳性杂交瘤细胞克隆转移到24孔细胞培养板中，通过有限稀释法进行单克隆化，确保获得稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，并将有效的阳性单克隆(单克隆抗体6e8)进行小鼠腹水制备，备用。
40.该单克隆抗体6e8由保藏编号为cctcc no:c2021159的杂交瘤细胞株6e8分泌，该杂交瘤细胞株6e8保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为武汉大学，保藏时间为2021年7月6日。
41.2.2酶联免疫吸附试验(elisa)鉴定mers
‑
cov s
‑
rbd单克隆抗体
42.将实施例1中纯化所得rbd
‑
rfc蛋白溶于碳酸盐
‑
碳酸氢盐缓冲液(cbs,ph 9.6)，随后以rbd
‑
rfc蛋白(2.5μg/ml,100μl/孔)包被96孔板，37℃孵育2h，pbst漂洗五次后加入5％(w/v)脱脂奶粉，37℃孵育2h，弃掉，将杂交瘤细胞(单克隆抗体6e8)上清液按50μl/孔加至96孔板，以阴性杂交瘤细胞上清液作对照，37℃孵育1h，pbst漂洗五次后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg抗体作为二抗，37℃孵育1h，pbst漂洗五次后加入3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(tmb，美国sigma公司)，室温避光反应5min，随后用2m h2so4终止反应，使用酶标仪读取每孔在450nm的吸光度值。如图3所示，经elisa鉴定，单克隆抗体6e8的od
450
读值大于3，远远大于阴性对照，表明单克隆抗体6e8可以识别rbd
‑
rfc蛋白。
43.实施例3.dot
‑
blot鉴定单克隆抗体识别mers
‑
cov s
‑
rbd区域
44.3.1mers
‑
cov s
‑
rbd片段重组表达载体构建
45.表2.mers
‑
cov s
‑
rbd截短片段引物序列
[0046][0047]
注：下划线表示引入的限制性内切酶切割位点。
[0048]
以mers
‑
cov s
‑
rbd cdna作为pcr模板，以表2中引物进行pcr扩增s
‑
rbd不同片段基因(具体蛋白区域序列见表2)，在pcr产物两端分别引入ecor i和nco i酶切位点。pcr目的产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收，经双酶切获得的目的片段插入表达载体pfuse
‑
higg1
‑
fc2载体(美国invivogen公司)相应酶切位点，将重组表达质粒转化大肠杆菌克隆菌株jm109感受态细胞(takara公司)，挑取单克隆菌落经pcr鉴定阳性后交由生工生物工程(上海)股份有限公司鉴定，根据鉴定结果提取鉴定正确的重组表达质粒。
[0049]
3.2mers
‑
cov s
‑
rbd片段重组表达
[0050]
将上步鉴定正确的重组表达质粒转染人胚肾上皮细胞293t(hek
‑
293t)。扩大培养转染细胞，转染48h后离心收取细胞上清液。上清液经proteina亲和层析纯化后，在硝酸纤维素膜(美国millipore公司)上点印重组表达的不同mers
‑
cov s
‑
rbd片段，以人源igg1型抗体的fc区段为对照，依次加入兔抗人源igg fc抗体和辣根过氧化物酶标记的羊抗兔igg抗体进行孵育，使用ecl试剂显色检测目的蛋白。如图4b结果显示，同人源igg1型抗体的fc区段(hfc)阳性对照一样，mers
‑
cov s
‑
rbd不同片段均有表达(呈现黑色颜色反应阳性点)。
[0051]
3.3dot
‑
blot鉴定mers
‑
cov s
‑
rbd单克隆抗体识别区域
[0052]
确认目的蛋白表达后，在硝酸纤维素膜上点印重组表达的不同mers
‑
cov s
‑
rbd片段。自然干燥后，将印迹膜37℃封闭1h。随后依次加入制备的mers
‑
cov s
‑
rbd单克隆抗体6e8、辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg抗体进行孵育。使用ecl试剂显色判定，以阳性点呈现黑色颜色反应，阴性点不出现颜色反应进行判定。如图4b结果显示，n
‑
n1区域可被制备的单克隆抗体6e8特异性识别。
[0053]
根据n1区域序列，合成表3中多肽，合成多肽经鉴定序列正确，纯度均可达到95％以上。使用dmso溶解合成多肽，加入0.01m盐酸将ph值调至4
‑
5；加入含1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺(edc，购自美国thermo公司)反应液，室温反应15min；稀释牛血清白蛋白(bsa)，逐滴加入到合成多肽反应液中，混匀后室温反应2h，形成bsa
‑
多肽备用。在硝酸纤维素膜上点印bsa
‑
多肽，自然干燥后，重复上述dot
‑
blot步骤，如图4c结果显示，序列为tkllslfsvndftcsqispaai的n1
‑
4区域可被制备的单克隆抗体6e8特异性识别，我们将这一区域重命名为p1。
[0054]
表3.n1区域多肽序列合成
[0055]
多肽名称多肽氨基酸序列n1
‑
1eakpsgsvveqaegvecdfsn1
‑
2ecdfspllsgtppqvynfkrn1
‑
3ynfkrlvftncnynltkllsn1
‑
4(p1)tkllslfsvndftcsqispaai
[0056]
实施例4.酶联免疫吸附试验(elisa)鉴定mers
‑
cov s
‑
rbd单克隆抗体识别的线性b细胞表位
[0057]
根据实施例3鉴定的区域p1，分别通过n端截短和c端截短合成表4中多肽。合成多肽与bsa偶联得到bsa
‑
多肽备用。以5mg/ml浓度将bsa
‑
多肽按100μl/孔包被96孔酶标板，4℃孵育过夜后，加入含5％(w/v)脱脂奶粉封闭液封闭。加入制备的mers
‑
cov s
‑
rbd单克隆抗体6e8的杂交瘤细胞上清液(体积比1:100稀释，每孔加100μl)，37℃孵育1h，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠igg抗体和3,3',5,5'
‑
四甲基联苯胺(tmb，美国sigma公司)，室温避光反应5min，使用2m浓硫酸终止反应，并读取450nm的吸光度值，检测mers
‑
cov s
‑
rbd单克隆抗体6e8与酶标板上bsa
‑
多肽的结合，同时以不结合小鼠igg的bsa为阴性对照。样品od
450
值与阴性对照od
450
值的比值大于或等于2.2时可判定为阳性，其它则为阴性。
[0058]
表4.截短多肽序列
[0059][0060]
*n端引入cysteine以增加与bsa的偶联反应效率。
[0061]
经elisa鉴定，单克隆抗体6e8能与n端截短片段p1
‑
n1至p1
‑
n11结合，od
450
值与阴性对照od
450
值的比值均大于2.2，表明单克隆抗体6e8可以和n端截短至p1
‑
n11(ftcsqispaai)的片段结合；而单克隆抗体6e8仅与c端截短片段中p1
‑
c1至p1
‑
c4结合，od
450
值与阴性对照od
450
值的比值大于2.2，表明这株单克隆抗体结合的位点位于p1
‑
c4的c端(图5)。综上所述，制备的这株单克隆抗体6e8识别的b细胞表位序列为ftcsqis(seq id no.13)，为线性表位，其编码序列为tttacatgtagccagatctct(seq id no.14)。
[0062]
以上所述仅为本发明较佳的实施例，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。