一种高产顺式-冷杉醇的重组大肠杆菌、构建方法及其应用与流程

一种高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌、构建方法及其应用
技术领域
1.本发明属于基因工程技术领域，具体涉及到一种高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌、构建方法及其应用。


背景技术：

2.天然龙涎香是濒危物种抹香鲸产生的一种肠道排泄物，是最珍贵的香料之一，常被用作香味固定剂。目前，降龙涎香醚及其相关化合物被广泛用作龙涎香的替代品，主要由全化学合成获得，但其全化学合成步骤复杂，条件苛刻且选择性差。此外，降龙涎香醚还可由顺式
‑
冷杉醇等其他来源于植物的含氧二萜化合物(如香紫苏醇)为前体半化学合成获得。其中，顺式
‑
冷杉醇半化学合成法具有反应步骤少、选择性高、产率高等优点。
3.顺式
‑
冷杉醇，是一种双环劳丹烷型二萜化合物，常存在于植物冷杉和烟草中，是大多数烟草和部分雪茄的香味前体，在食草动物和病原体的化学防御上也发挥着关键作用。顺式
‑
冷杉醇的生产工艺主要有2种：植物提取法和代谢工程改造。顺式
‑
冷杉醇在植物中含量极低，提取分离困难，植物提取法无法满足半化学法合成的需求。因此，具有原料可再生、产物单一、品质优异等优势的代谢工程改造微生物合成顺式
‑
冷杉醇工艺，已经成为国际上的研究热点。
4.萜类的生物合成均来源于共同的前体—异戊二烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，ipp)和二甲基烯丙基二磷酸(dimethylallyl pyrophosphate，dmapp)。ipp和dmapp通过法尼基焦磷酸合成酶(farnesyl pyrophosphate synthase，fpps)的催化生成一分子的法尼基焦磷酸(fpp)。ipp和fpp通过牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase，ggpps)的催化生成一分子的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸(ggpp)。ggpp是二萜化合物的前体。然后以ggpp为底物，通过冷杉醇合酶生成顺式
‑
冷杉醇。现有的代谢工程菌的冷杉醇产量较低，可能的原因是合成途径冗长，代谢负担过重。近年来，新型整合途径(利用异戊二烯一磷酸激酶，ipks)逐渐应用于萜类的生产，其中iup(异戊烯醇利用途径)途径因步骤简洁、辅因子简单、调控独立于中心碳代谢而备受关注。异戊烯醇(3
‑
甲基
‑3‑
丁烯
‑1‑
醇)途径以异戊烯醇为底物，经过两步反应并消耗两分子atp即可获得萜类通用前体ipp。iup途径目前局限于两步反应有效酶的挖掘，在工程菌株体内的应用还未进一步优化，致使其未能满足商业应用的需求。


技术实现要素：

5.本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本技术的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
6.鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。
7.为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌，同时表达激酶基因scck、mtipk或sfphon、mtipk以及萜类前体合成基因idi、
erg20。
8.作为本发明高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌的一种优选方案，其中：所述scck基因的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述sfphon基因的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述mtipk基因的核苷酸序列如seq id no.5所示。
9.作为本发明高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌的一种优选方案，其中：所述重组大肠杆菌中敲除了磷酸酶基因apha和yqab。
10.作为本发明高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌的一种优选方案，其中：所述apha基因的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述yqab基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
11.作为本发明高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌的一种优选方案，其中：所述重组大肠杆菌以e.coli bl21(de3)为出发菌株。
12.本发明的另一个目的是提供一种如上述所述的高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌的构建方法，包括，
13.构建含有激酶基因scck、mtipk或sfphon、mtipk以及萜类前体合成基因idi、erg20的第一重组质粒；
14.将所述第一重组质粒和重组质粒pgsc转化入大肠杆菌菌株中，获得大肠杆菌基因工程菌。
15.作为本发明高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：还包括，
16.构建含有激酶基因scck或sfphon的第二重组质粒；
17.将第二重组质粒转化入所述大肠杆菌基因工程菌中。
18.作为本发明高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：还包括，
19.敲除大肠杆菌基因组中的磷酸酶基因apha和yqab，获得突变型大肠杆菌菌株；
20.将所述第一重组质粒、所述第二重组质粒以及重组质粒pgsc转化入所述突变型大肠杆菌菌株中。
21.作为本发明高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌的构建方法的一种优选方案，其中：所述第一重组质粒，以prsfduet
‑
1为载体，构建含有激酶基因scck、mtipk以及萜类前体合成基因idi、erg20的重组质粒prsfduet
‑
scck
‑
mtipk
‑
idi
‑
erg20；
22.所述第二重组质粒，以pcdfduet
‑
1为载体，构建含有激酶基因sfphon的重组质粒pcdfduet
‑
sfphon。
23.本发明的另一个目的是提供如上述所述的高产顺式
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冷杉醇的重组大肠杆菌在发酵生产顺式
‑
冷杉醇中的应用。
24.作为本发明高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌在发酵生产顺式
‑
冷杉醇中的应用的一种优选方案，其中：所述重组大肠杆菌利用非传统碳源戊烯醇为底物进行摇瓶发酵：
25.将菌种活化后制备种子液，按5％接种量接种到加入相应抗性的250ml三角瓶中，37℃，200r/min振荡培养至od
600
在2.5～3.0范围内，向培养基中加入0.5mm iptg进行诱导，同时加入10％(v/v)肉豆蔻酸异丙酯进行双层培养，在25℃、200r/min条件下诱导表达72h；
26.所述发酵培养基组成为：12g/l蛋白胨，24g/l酵母提取物，9.4g/l磷酸氢二钾，2.2g/l磷酸二氢钾，1％(v/v)甘油120℃高压蒸汽锅灭菌20min。
27.作为本发明高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌在发酵生产顺式
‑
冷杉醇中的应用的一种优选方案，其中：利用上述重组大肠杆菌进行1.3l发酵罐发酵：
28.将菌种活化后制备种子液，按照7％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制ph稳定在7.0左右，溶氧稳定在40％左右，od
600
达到30后发酵温度从37℃调至25℃，同时加入肉豆蔻酸异丙酯(10％，v/v)，加入iptg至终浓度为0.5mm；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加含有500g/l甘油的溶液，维持发酵培养基中的甘油浓度小于0.1g/l；在od
600
达到55时，加入底物戊烯醇至终浓度为2.5g/l，当其浓度低于0.5g/l时补加戊烯醇，发酵周期136h；
29.所述发酵培养基组成为：
30.4.2g/l kh2po4,15.7g/l k2hpo4·
h2o,2.0g/l(nh4)2so4,1.7g/l柠檬酸,8.4mg/l edta,20g/l甘油,1.2g/l of mgso4·
7h2o,4.5mg/l盐酸硫铵和10ml/l培养基微量元素溶液，120℃高压蒸汽锅灭菌20min。
31.所述补料培养基组成为：
32.500g/l甘油,mgso4·
7h2o 12g/l,(nh4)2so
4 10.7g/l,edta13mg/l,and10ml/l补料微量元素溶液，120℃高压蒸汽锅灭菌20min。
33.作为本发明高产顺式
‑
冷杉醇的重组大肠杆菌在发酵生产顺式
‑
冷杉醇中的应用的一种优选方案，其中：所述培养基微量元素混合液组分为：0.25g/lcocl2·
6h2o,1.5g/l mncl2·
h2o,0.15g/l cucl2·
2h2o,0.3g/l h3bo4,0.25g/lna2moo4·
2h2o,1.3g/l zn(ch3coo)2·
2h2o和10g/l柠檬酸铁(iii)水合物；
34.所述补料微量元素混合液组分为：0.4g/l cocl2·
6h2o,2.35g/l mncl2·
h2o,0.25g/l cucl2·
2h2o,0.5g/l h3bo4,0.4g/l na2moo4·
2h2o,1.6g/lzn(ch3coo)2·
2h2o和4g/l柠檬酸铁(iii)水合物。
35.与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
36.本发明提供的优选表达元件组合可以有效转化非传统碳源戊烯醇，并积累萜类前体物质dmapp。将优选表达元件与顺式
‑
冷杉醇合成质粒共同转化入大肠杆菌，可以将顺式
‑
冷杉醇的产量提高6倍(bd101相比于bd003)。本发明提供的突变型大肠杆菌菌株bday，不仅可以增加顺式
‑
冷杉醇的积累，还可以增加檀香烯的积累。本发明提供的基因工程菌株bday001在摇瓶和1.3l发酵罐中可分别积累311.8mg/l和1375.7mg/l顺式
‑
冷杉醇，为目前报道的最高值，分别较传统途径提高了1.0和1.2倍，且可以有效转化14.6％和38.5％的戊烯醇。
附图说明
37.为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
38.图1为本发明的优选表达元件组合及冷杉醇合成途径在缺陷型菌株中的表达示意图；
39.图2为重组菌bd001～bd004在72h时的顺式
‑
冷杉醇产量；
40.图3为重组菌bd101～bd104在72h时的顺式
‑
冷杉醇产量；
41.图4为重组菌bd101和bday001在72h时的顺式
‑
冷杉醇产量；
42.图5为重组菌bday001于不同甘油含量的tb培养基中在72h时的顺式
‑
冷杉醇产量；
43.图6为重组菌bday001在1.3l发酵罐中顺式
‑
冷杉醇产量；
44.图7为重组菌bd103和bday104在72h时的檀香烯产量。
具体实施方式
45.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
46.在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
47.其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。
48.如图1所示的途径，本发明通过在大肠杆菌bday中转化入优选的表达元件组合，成功构建了基因工程菌株bday001，并优化其培养策略，实现了顺式
‑
冷杉醇的高效生产；在1.3l发酵罐中进一步提高了顺式
‑
冷杉醇的获得。
49.(1)激酶基因的合成及表达设计
50.用密码子优化软件将来源于达尔甲烷叶菌(methanolobus tindarius)、甲藻酸囊藻(methanococcoides burtoni)、热自养甲烷热杆菌(methanothermobacter thermautotrophicus)的异戊二烯一磷酸激酶基因(mtipk、mbipk、mthipk)的密码子进行优化，人工合成优化设计后的序列；通过网站https://www.denovodna.com中设计rbs序列(rbs(mtipk)序列如seq id no.30所示，rbs(mbipk)序列如seq id no.31所示，rbs(mthipk)序列如seq id no.32所示)，并优化来源，调控异戊二烯一磷酸激酶表达强度一致，合成该融合基因。
51.用密码子优化软件将来源于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)的胆碱激酶基因(scck)和弗氏志贺菌(shigela flexneri)的非特异性酸性磷酸酶基因(sfphon)进行密码子优化后，人工合成优化后的序列。
52.scck、sfphon、mtipk、mthipk、mbipk基因的核苷酸序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5，seq id no.6，seq id no.7所示。
53.(2)构建大肠杆菌顺式
‑
冷杉醇工程菌株bd001～bd004
54.1.构建重组质粒prsfduet
‑
scck
‑
mtipk
‑
idi
‑
erg20、prsfduet
‑
sfphon
‑
mtipk
‑
idi
‑
erg20、prsfduet
‑
scck
‑
mbipk
‑
idi
‑
erg20和prsfduet
‑
scck
‑
mthipk
‑
idi
‑
erg20。
55.以重组质粒pmlie(来源于文献combinatorial engineering of mevalonate pathway and diterpenoid synthases in escherichia coli for cis
‑
abienol production,2019)为模板，以含有20bp同源序列的引物prsidi
‑
hf(序列如seq id no.13所示)和prsferg
‑
hr(序列如seq id no.14所示)pcr获得目的片段idi
‑
erg20；以合成的表达质粒prsfduet
‑
scck
‑
mtipk、prsfduet
‑
scck
‑
mbipk、prsfduet
‑
scck
‑
mthipk(购自上海捷瑞
生物工程有限公司)为模板，通过引物rprsfd
‑
f(序列如seq id no.15所示)、rprsfd
‑
r(序列如seq id no.16所示)pcr获得线性化载体；pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用割胶回收清洁试剂盒回收(axygen,上海)。将线性化的表达载体和idi
‑
erg20片段按适当比例混合，按clonexpressⅱ一步克隆试剂盒方法于37℃孵育30min，热激转化至e.coli top10(大肠杆菌e.coli top10为申请人实验室保存)感受态细胞中。在含有卡那抗生素终浓度为50μg/ml的slb平板中挑选单菌落，扩增培养，提取质粒，pcr鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测和测序鉴定进而构建出重组表达质粒，并分别命名为prsfduet
‑
scck
‑
mtipk
‑
idi
‑
erg20、prsfduet
‑
scck
‑
mbipk
‑
idi
‑
erg20、prsfduet
‑
scck
‑
mthipk
‑
idi
‑
erg20。
56.以重组表达质粒prsfduet
‑
scck
‑
mtipk
‑
idi
‑
erg20为模板，通过引物rp42
‑
f(序列如seq id no.17所示)、rp42
‑
r(序列如seq id no.18所示)pcr获得线性化载体；以重组质粒pcdfduet
‑
sfphon(购自上海捷瑞生物工程有限公司)为模板，以含有20bp同源序列的引物phon
‑
hf(序列如seq id no.19所示)、phon
‑
hr(序列如seq id no.20所示)pcr获得目的片段phon；pcr产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用割胶回收清洁试剂盒回收(axygen,上海)。将线性化的表达载体和phon片段按适当比例混合，按clonexpressⅱ一步克隆试剂盒方法于37℃孵育30min，热激转化至e.coli top10感受态细胞中。在含有卡那抗生素终浓度为50μg/ml的slb平板中挑选单菌落，扩增培养，提取质粒，pcr鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测和测序鉴定进而构建出重组表达质粒，并命名为prsfduet
‑
sfphon
‑
mtipk
‑
idi
‑
erg20。
57.2.将上述重组质粒prsfduet
‑
scck
‑
mtipk
‑
idi
‑
erg20、prsfduet
‑
sfphon
‑
mtipk
‑
idi
‑
erg20、prsfduet
‑
scck
‑
mbipk
‑
idi
‑
erg20、prsfduet
‑
scck
‑
mthipk
‑
idi
‑
erg20和重组质粒pgsc(来源于文献combinatorial engineering of mevalonate pathway and diterpenoid synthases in escherichia coli for cis
‑
abienol production,2019)分别热激转化入e.coli bl21(de3)(大肠杆菌e.coli bl21(de3)为申请人实验室保存)感受态细胞中，在含有卡那抗生素、氨苄抗生素终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml的slb平板中挑选单菌落，扩增培养获得工程菌株bd001～bd004。
58.3.挑取bd001～bd004的单菌落到含有100μg/ml氨苄、50μg/ml卡那的llb培养基中，在摇床(37℃、200r/min)内培养至od
600
在2.5～3.0范围内，向培养基中加入0.5mm iptg进行诱导，同时加入10％(v/v)肉豆蔻酸异丙酯进行双层培养，在25℃、200r/min条件下诱导表达；od
600
在8.0～9.0范围内，加入终浓度为2.5g/l的戊烯醇培养72h。检测顺式
‑
冷杉醇产量，结果见图2，可以看出，获得优化表达元件后的高效基因工程菌株bd002，72h发酵后顺式
‑
冷杉醇的产量可达106.0mg/l。
59.(3)构建大肠杆菌顺式
‑
冷杉醇工程菌株bd101、bd102、bd201、bd202
60.1.构建重组质粒pcdfduet
‑
scck。以合成质粒prsfduet
‑
scck
‑
mtipk(购自上海捷瑞生物工程有限公司)为模板，利用ncoi和bamhi于37℃分别酶切prsfduet
‑
scck
‑
mtipk、pcdfduet
‑
1(购自上海捷瑞生物工程有限公司)，获得目的片段scck和酶切后的表达载体，1％琼脂糖凝胶电泳检测并回收，于16℃过夜连接，并将连接液转化至e.coli top10感受态细胞中。在含有链霉素抗生素终浓度为25μg/ml的slb平板中挑选单菌落，扩增培养，提取质粒，pcr鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测和测序鉴定进而构建出重组表达质粒，命名为pcdfduet
‑
scck。
61.2.将重组质粒pcdfduet
‑
scck分别转化至bd001、bd002的感受态细胞中，获得基因工程菌株bd102、bd202；将重组质粒pcdfduet
‑
sfphon分别转化至bd001、bd002的感受态细胞中，获得基因工程菌株bd101、bd201。
62.3.挑取bd101、bd102、bd201、bd202的单菌落到含有100μg/ml氨苄、50μg/ml卡那、25μg/ml链霉素抗生素的llb培养基中，在摇床(37℃、200r/min)内培养至od600在2.5～3.0范围内，向培养基中加入0.5mm iptg进行诱导，同时加入10％(v/v)肉豆蔻酸异丙酯进行双层培养，在25℃、200r/min条件下诱导表达；od
600
在8.0～9.0范围内，加入终浓度为2.5g/l的戊烯醇培养72h。检测顺式
‑
冷杉醇产量，结果见图3，可以看出，获得优化表达元件后的高效基因工程菌株bd101，72h发酵后顺式
‑
冷杉醇的产量可达164.8mg/l。
63.(4)构建大肠杆菌顺式
‑
冷杉醇工程菌株bday001
64.1.构建突变型大肠杆菌菌株e.coli bl21(de3)δapha
65.利用crispr
‑
cas9技术敲除apha基因：
66.1.1构建质粒ptarget
‑
napha
67.构建质粒ptarget
‑
napha的目的是为了转录相应的grna，从而与cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和pam识别目的基因靶位点，实现目的dna双链断裂。采用包含靶序列的dna片段与线性化的载体片段重组的方法构建ptarget
‑
napha质粒。
68.1.1.1靶序列设计
69.使用crispr grna design tool设计靶序列(pam:5
‑
ngg
‑3’
)
70.1.1.2构建含有靶序列的ptarget
‑
napha
71.以质粒ptarget
‑
f(来源于文献multigene editing in the escherichia coli genome via the crispr
‑
cas9 system,2015)为模板，用引物apha
‑
nf(序列如seq id no.21所示)和nr(序列如seq id no.22所示)对其pcr反应并割胶回收后获得含有20bp靶序列an20(序列如seq id no.23所示)的线性化载体；将线性化载体于37℃磷酸化3h后，于16℃过夜连接，并将连接液转化至e.coli top10感受态细胞中涂布于含有链霉素抗生素终浓度为25μg/ml的slb平板过夜生长。在slb平板中挑选单菌落，扩增培养，提取质粒，pcr鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测和测序鉴定进而构建出重组表达质粒，命名为ptarget
‑
napha。
72.1.1.3构建含有欲敲除目标区域的同源序列的重组质粒ptarget
‑
napha
‑
x12
73.在大肠杆菌基因组中基因apha的上游和下游各选择300bp的序列为ax1(序列如seq id no.9所示)、ax2(序列如seq id no.10所示)，并使用重叠延伸pcr将ax1、ax2克隆至ptarget
‑
napha，获得重组质粒命名为ptarget
‑
napha
‑
x12。apha基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
74.1.2敲除基因apha
75.1.2.1ptarget
‑
napha
‑
x12质粒的转化
76.将质粒ptarget
‑
napha
‑
x12电转化入含有pcas质粒的e.coli bl21(de3)的感受态细胞中，涂布于含有卡那抗生素、氨苄抗生素终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml的slb平板中，挑选单菌落，用引物yza
‑
f(序列如seq id no.24所示)和yza
‑
r(序列如seq id no.25所示)进行pcr并测序验证。
77.1.2.2ptarget
‑
napha
‑
x12质粒的消除
78.将阳性重组子置于含有0.2％阿拉伯糖的lb培养基中过夜培养，适量稀释后涂布
于含有链霉素抗性的lb平板上，37℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和链霉素抗性的lb平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，链霉素抗性平板生长的单菌落保菌。
79.1.2.3pcas质粒的消除
80.将阳性重组子转接到无抗性的lb液体培养基中，37℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的lb平板上，37℃过夜培养。对点含有链霉素抗性和无抗性的lb平板，挑选链霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。
81.2.构建突变型大肠杆菌菌株e.coli bl21(de3)δaphaδyqab(bday)
82.利用crispr
‑
cas9技术敲除yqab基因：
83.2.1构建质粒ptarget
‑
nyqab
84.构建质粒ptarget
‑
nyqab的目的是为了转录相应的grna，从而与cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和pam识别目的基因靶位点，实现目的dna双链断裂。采用包含靶序列的dna片段与线性化的载体片段重组的方法构建ptarget
‑
nyqab质粒。
85.2.1.1靶序列设计
86.使用crispr grna design tool设计靶序列(pam:5
‑
ngg
‑3’
)
87.2.1.2构建含有靶序列的ptarget
‑
nyqab
88.以质粒ptarget
‑
f为模板，用引物yqab
‑
nf(序列如seq id no.26所示)和nr(序列如seq id no.22所示)对其pcr反应并割胶回收后获得含有20bp靶序列yn20(序列如seq id no.27所示)的线性化载体；将线性化载体于37℃磷酸化3h后，于16℃过夜连接，并将连接液转化至e.coli top10感受态细胞中涂布于含有链霉素抗生素终浓度为25μg/ml的slb平板过夜生长。在slb平板中挑选单菌落，扩增培养，提取质粒，pcr鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测和测序鉴定进而构建出重组表达质粒，命名为ptarget
‑
nyqab。
89.2.1.3构建含有欲敲除目标区域的同源序列的重组质粒ptarget
‑
nyqab
‑
x12
90.在大肠杆菌基因组中基因yqab的上游和下游各选择300bp的序列为yx1(序列如seq id no.11所示)、yx2(序列如seq id no.12所示)，并使用重叠延伸pcr将yx1、yx2克隆至ptarget
‑
nyqab，获得重组质粒命名为ptarget
‑
nyqab
‑
x12。yqab基因的核苷酸序列如seq id no.2所示。
91.2.2敲除基因yqab
92.2.2.1ptarget
‑
nyqab
‑
x12质粒的转化
93.将质粒ptarget
‑
nyqab
‑
x12电转化入含有pcas质粒的e.coli bl21(de3)的感受态细胞中，涂布于含有卡那抗生素、氨苄抗生素终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml的slb平板中，挑选单菌落，采用引物yzy
‑
f(序列如seq id no.28所示)和yzy
‑
r(序列如seq id no.29所示)进行pcr和测序验证。
94.2.2.2ptarget
‑
nyqab
‑
x12质粒的消除
95.将阳性重组子置于含有0.2％阿拉伯糖的lb培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有链霉素抗性的lb平板上，37℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和链霉素抗性的lb平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，链霉素抗性平板生长的单菌落保菌。
96.2.2.3pcas质粒的消除
97.将阳性重组子转接到无抗性的lb液体培养基中，37℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的lb平板上，37℃过夜培养。对点含有链霉素抗性和无抗性的lb平板，挑选链霉素
抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。
98.3.构建基因工程菌bday 001
99.把构建的重组质粒prsfduet
‑
scck
‑
mtipk
‑
idi
‑
erg20、pcdfduet
‑
sfphon和pgsc热激至bday感受态细胞中，涂布于含有卡那抗生素、氨苄抗生素、链霉素终浓度分别为50μg/ml、100μg/ml、25μg/ml的slb平板中，挑取单菌落获得重组菌bday 001。
100.4.挑取bday001的单菌落到含有100μg/ml氨苄、50μg/ml卡那、25μg/ml链霉素抗生素的llb培养基中，在摇床(37℃、200r/min)内培养至od
600
在2.5～3.0范围内，向培养基中加入0.5mm iptg进行诱导，同时加入10％(v/v)肉豆蔻酸异丙酯进行双层培养，在25℃、200r/min条件下诱导表达；od
600
在8.0～9.0范围内，加入终浓度为2.5g/l的戊烯醇培养72h。检测两种重组大肠杆菌的顺式
‑
冷杉醇产量，结果见图4，敲除磷酸酶基因相比于野生型，顺式
‑
冷杉醇产量提高40％。
101.5.挑取bday001的单菌落到含有100μg/ml氨苄、50μg/ml卡那、25μg/ml链霉素抗生素的llb培养基中，在摇床(37℃、200r/min)内培养至od
600
在2.5～3.0范围内，向培养基中加入0.5mm iptg进行诱导，同时加入10％(v/v)肉豆蔻酸异丙酯进行双层培养，在25℃、200r/min条件下诱导表达；在不同甘油含量培养基(1％、1.5％、2％、3％、4％)，将终浓度为2.5g/l的戊烯醇分两次加入，结果见图5，顺式
‑
冷杉醇产量提高35％，可达311.8mg/l。
102.(5)利用大肠杆菌基因工程菌于1.3l发酵罐中发酵生产顺式
‑
冷杉醇
103.1.种子培养：于
‑
20℃冰箱保菌管中取5μl菌液，接入5ml lb中，在37℃、230rpm培养10～12h；
104.2.扩繁培养：取种子液按1％(v/v)接种量接种于含有200ml tb培养基的1000ml摇瓶中，于37℃、230rpm培养10～12h；
105.3.发酵培养：按照7％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制ph稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在40％左右；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加含有500g/l甘油的补料溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度小于0.1g/l；发酵周期136h。
106.4.发酵培养基组分为：4.2g/l kh2po4,15.7g/l k2hpo4·
h2o,2.0g/l(nh4)2so4,1.7g/l柠檬酸,8.4mg/l edta,20g/l甘油,1.2g/l of mgso4·
7h2o,4.5mg/l盐酸硫铵和10ml/l培养基微量元素溶液，120℃高压蒸汽锅灭菌20min。
107.5.补料培养基组分为：500g/l甘油,mgso4·
7h2o 12g/l,(nh4)2so
4 10.7g/l,edta 13mg/l,and 10ml/l补料微量元素溶液，120℃高压蒸汽锅灭菌20min。
108.6.培养基微量元素混合液组分为：0.25g/l cocl2·
6h2o,1.5g/l mncl2·
h2o,0.15g/l cucl2·
2h2o,0.3g/l h3bo4,0.25g/l na2moo4·
2h2o,1.3g/lzn(ch3coo)2·
2h2o和10g/l柠檬酸铁(iii)水合物；
109.7.补料微量元素混合液组分为：0.4g/l cocl2·
6h2o,2.35g/l mncl2·
h2o,0.25g/l cucl2·
2h2o,0.5g/l h3bo4,0.4g/l na2moo4·
2h2o,1.6g/lzn(ch3coo)2·
2h2o和4g/l柠檬酸铁(iii)水合物。
110.利用摇瓶发酵结果最好的顺式
‑
冷杉醇工程菌株bday001进行1.3l发酵罐发酵，其实验结果如图6所示。检测发酵液中顺式
‑
冷杉醇，bday001发酵136h可转化戊烯醇积累顺式
‑
冷杉醇达1375.7mg/l，可达最大理论产率的38.5％，为目前报道的最高值。
111.(6)应用突变型大肠杆菌基因工程菌提高倍半萜的积累
112.为了进一步考察新型的突变型大肠杆菌菌株对倍半萜产量的影响，以檀香烯为目标产物，在突变型大肠杆菌菌株中表达檀香烯合成途径。
113.1.构建重组质粒petduet
‑
tps
114.将经密码子优化后合成的檀香烯合成酶tps(序列如seq id no.8所示)和表达载体petduet
‑
1(申请人实验室保存)分别经ncoi和bamhi双酶切后割胶回收，将载体和目的片段于16℃过夜连接后，热激转化入e.coli top10感受态细胞中，涂布于含有氨苄抗生素终浓度为100μg/ml的slb平板中37℃培养。挑选单菌落，扩增培养，提取质粒，pcr鉴定，1％琼脂糖凝胶电泳检测和测序鉴定进而构建出重组表达质粒petduet
‑
tps。
115.2.构建基因工程菌bd103、bday104
116.把构建的质粒prsfduet
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sfphon
‑
mtipk
‑
idi
‑
erg20和petduet
‑
tps分别热激转化至e.coli bl21(de3)和e.coli bl21(de3)δaphaδyqab感受态细胞中，制备大肠杆菌bd103、bday104。挑取单菌落接种到含有100μg/ml amp、50μg/ml kan抗生素的llb培养基中，在摇床(37℃、230r/min)内培养至od
600
在2.5～3.0范围内，向培养基中加入终浓度为0.5mm iptg进行诱导，同时加入10％(v/v)肉豆蔻酸异丙酯进行双层培养，在25℃、200r/min条件下诱导表达72h。检测两种重组大肠杆菌的檀香烯产量，结果见图7，突变型大肠杆菌菌株e.coli bl21(de3)δaphaδyqab，令重组大肠杆菌的檀香烯产量提高45％。
117.本发明提供的优选表达元件组合可以有效转化非传统碳源戊烯醇，并积累萜类前体物质dmapp。将优选表达元件与顺式
‑
冷杉醇合成质粒共同转化入大肠杆菌，可以将顺式
‑
冷杉醇的产量提高6倍(bd101相比于bd003)。本发明提供的突变型大肠杆菌菌株bday，不仅可以增加顺式
‑
冷杉醇的积累，还可以增加檀香烯的积累。本发明提供的基因工程菌株bday001在摇瓶和1.3l发酵罐中可分别积累311.8mg/l和1375.7mg/l顺式
‑
冷杉醇，为目前报道的最高值，分别较传统途径提高了1.0和1.2倍，且可以有效转化14.6％和38.5％的戊烯醇。
118.应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。