基于LEAPER技术靶向编辑RNA的方法和药物与流程

基于leaper技术靶向编辑rna的方法和药物
技术领域
1.本技术属于基因编辑治疗领域，具体地，涉及一种基于leaper (leveraging endogenous adar for programmable editing on rna)技术靶向编辑rna的、修复致病突变的方法，其包括利用leaper技术进行rna上由a到i碱基的位点定向编辑，来预防或治疗由于g>a突变导致的疾病例如赫勒氏综合征。


背景技术：

2.赫勒氏综合征(hurler syndrome)，又称粘多糖贮积症ih型 (mucopolysaccharidoses ih，mps ih)，是mpsi型三种亚型ih、ih/s、is中最严重的一种，它是由于该病患者体内α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶(α
‑
l
‑
iduronidase， idua)缺乏而引起的一种致残、致死性的遗传性代谢病，为常染色体隐性遗传病(autosomal recessive，ar)。导致赫勒氏综合征的根本原因，是位于人4 号染色体上4p16.3编码idua蛋白的idua基因突变导致的，到目前为止它的致病突变有200多种，其中最为常见的一种类型是位于α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸苷酶cdna上1205位g到a的突变，该突变导致原本的色氨酸变为终止密码子，进而使最终翻译出来的蛋白上缺乏该位点之后的全部氨基酸 (nm_000203.4(idua)
‑
c.1205g>a(p.trp402ter))而丧失idua全部酶活性。该突变类型可占到总发病人群的63％(worldwide distribution of commonidua pathogenic variants，poletto,edina(2018).clinical genetics.94. 10.1111/cge.13224.)。idua是负责细胞溶酶体(lysosomes)内葡糖胺聚糖 (glycosaminoglycans，gags)降解的。赫勒氏综合征的病人个体间差异较大，出生时可为正常，3
‑
6个月时最早出现的征兆为面部轮廓粗糙，随后出现额骨突出、骨骼畸形、生长停滞、语言障碍等症状，病人通常活不过10岁。
3.目前赫勒氏综合征没有治愈方法，已知批准的两种治疗方法：酶替代疗法(ert)和造血干细胞移植(hsct)。ert在内脏表型方面取得了良好的效果，包括减少肝脏大小，呼吸功能改善，患者活动性全面改善。不利的是，它不能到达中枢神经系统，因此不能阻止认知障碍。另一方面，成功的hsct可预防大多数临床症状，包括神经系统症状，但必须在出现临床症状前进行治疗(最好在8个月大之前)，但是由于这种治疗方法的死亡率高所以只适用于病情严重的患者(combination of enzyme replacement and hematopoietic stemcell transplantation as therapy for hurler syndrome.tolar,j(2008).bonemarrow transplantation.41.531
‑
5.10.1038/sj.bmt.1705934)。
4.目前，正在研究的赫勒氏综合征基因疗法的原理是利用锌指核糖核酸酶 (zinc finger nuclease，zfn)和腺相关病毒(adeno
‑
associated virus，aav)将编码正常idua蛋白的cdna序列定点插入到肝细胞的基因组中，但这种方法仍旧无法解决赫勒氏综合征中大脑骨骼等系统的症状。
5.另外通过dna编辑进行治疗是目前一种较为有前景的疗法开发思路，但其可能产生的脱靶(off
‑
target)是需要高度关注的问题。理论上，近年来正在飞速发展的基因组编辑技术crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)可以用
来治疗赫勒氏综合征。许多科研工作者和生物技术公司也在致力于将该技术推上临床。例如，2019年9月，首次报道了利用 crispr技术编辑干细胞并将其回输至患者，治疗艾滋病和白血病的临床实验结果，为crispr技术在基因治疗方向的转化做出了巨大的贡献。尽管 crispr技术存在极大的潜在应用前景，但也存在一系列缺陷，导致该技术从科研阶段向临床治疗应用中的转化步履维艰。问题之一便是crispr技术用到的核心作用酶：cas。基于crispr的dna编辑技术，必须通过外源表达cas9或拥有相似功能的其它核酸酶，从而造成了以下几个问题。首先，通常需要外源表达的核酸酶具有较大分子量，这使得通过病毒载体将其递送至体内的效率急剧下降。其次，由于核酸酶的外源表达，使得其存在潜在的核酸酶脱靶可能，这将使得其应用具有潜在的致癌风险。最后，外源表达的核酸酶是从细菌中发现的，而非人类或哺乳动物天然存在的，这使得其可能引起患者体内的免疫反应，这一方面可能会对患者自身造成损伤，另一方面也可能会使外源表达的核酸酶被中和，从而失去应有的活性，或者阻碍进一步的干预治疗。
6.2017年，张锋课题组曾报道一种名为repair(rna editing forprogrammable a to i replacement)的rna编辑技术(rna editing withcrispr
‑
cas13，cox et al.,2017)，该技术通过外源表达cas13
‑
adar融合蛋白及单独向导rna(single guide rna,sgrna)同样可以实现靶向目标rna 的a到i的编辑，但是该方法同crispr技术一样，仍需要外源蛋白的表达。无法解决外源蛋白表达造成的问题。
7.2017年，国际申请pct/ep2017/071912曾公开了一种更加适用于体内编辑的方法。该方法无需外源蛋白，仅依靠向细胞中引入一小段与目的位点所在序列互补配对的rna，即可招募adar蛋白对rna目的位点进行编辑。该方法所采用的互补rna长度短(不足54nt)，但需要复杂的化学修饰，且编辑效率不高。
8.2019年1月，thorsten stafforst课题组曾报道一种名为restore的核酸编辑技术(recruiting endogenous adar to specific trans foroligonucleotide
‑
mediated rna editing,merkle et al.,2019)。该技术也能够摆脱对外源蛋白的依赖。但restore技术需要在ifn
‑
γ存在的前提下才能有较高的编辑效率，而ifn
‑
γ是决定自体免疫发展和严重程度的关键因子 (interferon
‑
γand systemic autoimmunity.,pollard et al.,2013，这使得该技术在医学领域的应用大打折扣。
9.pct/cn2018/110105、pct/cn/2019/082713和pct/cn/2019/110782中记载了一种rna编辑方法，称为“leaper”(leveraging endogenous adarfor programmable editing on rna)技术，即一种依靠向细胞中引入一段与目的位点所在序列互补配对的rna，招募adar蛋白对rna目的位点进行编辑的技术。该技术所使用的与目的位点所在序列互补配对的rna可以在不经任何修饰的情况下，激发针对目的位点的较为高效的rna编辑。
10.尽管现有技术中有不同的基因或rna编辑方法，但是针对具体疾病，例如赫勒氏综合征，哪种方法能真正实现对致病突变的修复并能达到临床应用的水平是本领域一直探索的方向。


技术实现要素：

11.本技术针对由α
‑
l
‑
艾杜糖醛酸酶(α
‑
l
‑
iduronidase，idua)基因中的g> a突变导致的赫勒氏综合征提供了一种基于leaper技术靶向编辑细胞中包含所述突变的靶标rna的
方法。通过本技术的方法，可以实现较高的针对idua基因g>a突变的编辑效率，校正致病性的g>a突变，一定程度上恢复idua的水平和活性，从而为赫勒氏综合征的有效治疗开辟了一条崭新的途径。
12.具体地，本技术涉及以下各项：
13.1.一种基于leaper技术靶向编辑细胞中靶标rna的方法，其中所述靶标rna包含含有鸟苷(g)到腺苷(a)突变位点(靶标腺苷)的idua 基因转录本序列，该方法包括：
14.将arrna或包含所述arrna编码序列的构建体导入所述细胞中，其中所述arrna包含与所述靶标rna杂交的互补rna序列，并且其中所述arrna与所述靶标rna杂交后能够招募作用于rna的腺苷脱氨酶(adar) 以使靶标rna中的靶标腺苷脱氨基。
15.2.根据项1的方法，其中所述arrna上与靶标腺苷相对的核苷(称为：靶向核苷)为胞苷(c)、腺苷(a)或尿苷(u)。在一些实施方案中，所述与靶标腺苷相对的核苷为c。
16.3.根据项1或2的方法，其中所述靶标腺苷与其5’最近邻核苷和3’最近邻核苷组成靶标三联体，该靶标三联体为5
’‑
uag
‑3’
。
17.4.根据项1
‑
3任一项的方法，其中所述靶向腺苷的5’最近邻核苷为c、 g或u。
18.5.项1
‑
4任一项的方法，其中所述靶向腺苷的3’最近邻核苷为a。
19.6.根据项1
‑
5任一项的方法，其中所述靶向核苷与其5’最近邻核苷和3’最近邻核苷组成靶向三联体，该靶向三联体为5
’‑
cca
‑3’
。
20.7.根据项1
‑
6中任一项所述的方法，其中所述arrna长度大于61nt，例如所述arrna的长度为62
‑
121nt、62
‑
111nt、62
‑
101nt、62
‑
91nt、62
‑
81nt 或62
‑
76nt。在一些实施方案中所述arrna的长度选自62
‑
121nt中的任一整数个核苷酸的长度。在一些特定的实施方案中，所述arrna的长度例如为6 2nt、63nt、64t、65nt、66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、7 4nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、 86nt、87nt、88nt、89nt、90nt、92nt、95nt、98nt、100nt、103nt或106nt。
21.8.根据项1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的3’末端的距离小于所述靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离。在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的3’末端的距离等于所述靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离。在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的3’末端的距离大于所述靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离。
22.9.根据项1
‑
8中任一项的方法，其中所述arrna的靶向核苷距离其3' 末端大于8nt，例如9
‑
60nt，优选地为9
‑
45nt或9
‑
35nt；在一些实施方案中，为了尽可能避免超长的poly g结构，所述arrna的靶向核苷距离其3'末端的距离选自9
‑
25nt、9
‑
26nt、或9
‑
27nt；优选地，在一些实施方案中，所述a rrna的靶向核苷距离其3'末端的距离选自9
‑
20nt、9
‑
21nt、或9
‑
22nt；在一些特定的实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离其3'末端的距离选自9
‑
2 5nt中的任一整数个核苷酸，例如10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16n t、17nt、18nt、19nt、23nt或24nt。
23.10.根据项19中任一项的方法，其中所述arrna的靶向核苷距离其5’末端大于25nt，例如26
‑
60nt、35
‑
60nt或45
‑
60nt；在一些优选的实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离其5’末端的距离选自：45nt、45nt、46nt、47nt、 48nt、49nt、50nt、51nt、52nt、53nt、54nt、55nt、56nt、57nt、58nt或59nt。
24.11.根据项1
‑
7中任一项所述的方法，其中所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离小于所述靶向核苷距离所述arrna的3’末端的距离。
25.12.根据项11的方法，其中所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离大于35nt，例如36
‑
60nt或36
‑
55nt；优选地，所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离选自选自54nt、53nt、52nt、51nt、 50nt、49nt、48nt、47nt、46nt、45nt、44nt、43nt、42nt、41nt、40nt、39nt、 38nt或36nt。
26.13.根据项1
‑
12中任一项的方法，其中所述arrna选自下述任一长度特征的arrna：
27.55nt
‑
c
‑
35nt、55nt
‑
c
‑
25nt、55nt
‑
c
‑
24nt、55nt
‑
c
‑
21nt、55nt
‑
c
‑
20nt、55nt
‑
c
ꢀ‑
19nt、55nt
‑
c
‑
18nt、55nt
‑
c
‑
17nt、55nt
‑
c
‑
16nt、55nt
‑
c
‑
15nt、55nt
‑
c
‑
14nt、55n t
‑
c
‑
13nt、55nt
‑
c
‑
12nt、55nt
‑
c
‑
11nt、55nt
‑
c
‑
10nt、55nt
‑
c
‑
9nt、50nt
‑
c
‑
20nt、50 nt
‑
c
‑
15nt、45nt
‑
c
‑
55nt、45nt
‑
c
‑
20nt。
28.14.根据项1
‑
13中任一项的方法，其中所述arrna选自下述任一长度特征的arrna：55nt
‑
c
‑
20nt、55nt
‑
c
‑
15nt、55nt
‑
c
‑
14nt。
29.15.根据项1
‑
14中任一项的方法，其中所述arrna包含一种或多种化学修饰。
30.16.根据项15的方法，其中所述化学修饰选自如下的一种或多种：
[0031]2’‑
o
‑
甲基化修饰、硫代磷酸酯修饰、脱氧核糖核苷替代修饰、lna修饰、2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰。
[0032]
17.根据项15或16的方法，其中所述化学修饰选自如下的一种或多种：
[0033]
1)前2、3、4或5个核苷酸的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0034]
2)后2、3、4、或5个核苷酸的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0035]
3)除靶向三联体以外全部胞苷的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0036]
4)前2、3或4个核苷酸的2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰；
[0037]
5)后2、3或4个核苷酸的2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰；
[0038]
6)前2、3或4个核苷酸的脱氧核糖核苷替代修饰；
[0039]
7)后2、3或4个核苷酸的脱氧核糖核苷替代修饰；
[0040]
8)前1、2、3、4或5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；
[0041]
9)后1、2、3、4、或5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；
[0042]
10)除靶向三联体各核苷酸5’或3’最近邻核苷酸间连接中的一个或多个不做硫代磷酸酯修饰以外，所有核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；和
[0043]
11)除靶向三联体各核苷酸5’或3’最近邻核苷酸间连接中的一个或多个不做硫代磷酸酯修饰以外，每间隔1个、2个、3个、或4个核苷酸的核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰。
[0044]
18.根据权利要求17的方法，其中所述化学修饰选自如下的一种或多种：
[0045]
1)前2、3、4或5个核苷酸和后2、3、4、或5个核苷酸的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0046]
2)除靶向三联体以外全部胞苷的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0047]
3)前2、3或4个核苷酸和后2、3、或4个核苷酸的2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基) 修饰。
[0048]
4)前2、3或4个核苷酸和后2、3、或4个核苷酸的脱氧核糖核苷替代修饰。
[0049]
5)前1、2、3、4或5个核苷酸间连接和后1、2、3、4、或5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰。
[0050]
6)除靶向三联体各核苷酸5’或3’最近邻核苷酸间连接中的一个或多个不做硫代
磷酸酯修饰以外，所有核苷酸间连接或最多间隔一个核苷酸间连接经硫代磷酸酯修饰。
[0051]
19.根据项15
‑
18中任一项的方法，所述arrna包含选自下组任一种的化学修饰：
[0052]
cm0：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，并且前3 个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；
[0053]
cm1：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；并且序列中全部u均经2
’‑
o
‑ꢀ
甲基化修饰；
[0054]
cm2：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；并且靶向核苷的3’最近邻核苷经2
’‑
o
‑
甲基化修饰；
[0055]
cm3：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；并且靶向核苷的5’最近邻核苷经2
’‑
o
‑
甲基化修饰；
[0056]
cm4：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；并且靶向三联体中的三个碱基与各自的3’最近邻核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；
[0057]
cm6：序列前5个和后5个核苷酸分别被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，并且前5 个和后5个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；
[0058]
cm148：序列前4个和后4个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰，前 3个和后4个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有u均经2
’‑
o
‑
me 修饰；
[0059]
cm149：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰，前 2个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有u均经2
’‑
o
‑
me 修饰；
[0060]
cm150：序列前2个和后2个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰，第 1个和后2个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有u均经2
’‑
o
‑
me 修饰；
[0061]
cm151：序列前4个和后4个核苷酸分别经lna修饰，前3个和后4 个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有尿苷均经2
’‑
o
‑
me修饰；
[0062]
cm152：序列前3个和后3个核苷酸分别经lna修饰，前2个和后3 个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有尿苷均经2
’‑
o
‑
me修饰；
[0063]
cm153：序列前2个和后2个核苷酸分别经lna修饰，前2个和后3 个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有尿苷均经2
’‑
o
‑
me修饰；
[0064]
cm94：序列前3个和后3个核苷酸、序列中的全部u和除靶向三联体以外的全部c均被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前4个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰，且从5’末端第4个核苷酸间连接至3’末端第3个核苷酸间连接中除靶向三联体中各核苷酸5’最近邻核苷酸间连接不做硫代磷酸酯修饰以外，每隔一个核苷酸间连接经硫代磷酸酯修饰；
[0065]
cm119：序列前3个和后3个核苷酸、序列中的全部u和除靶向三联体以外的全部c均被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前4个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰；从5’末端第4个核苷酸间连接至靶向核苷的3’最近邻核苷酸间连接以及从3’末端第3个核苷酸间连接至靶向核苷的3’最近邻核苷酸，每隔一个核苷酸间连接经硫代磷酸酯修饰；并且靶标核苷经脱氧核糖核苷替代；
[0066]
cm120：序列前3个和后3个核苷酸、序列中的全部u和除靶向三联体以外的全部c均被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前4个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰；从5’末端第4个核苷酸间连接至靶向核苷的5’最近邻核苷酸间连接以及从3’末端第3个核苷酸间连接至靶向
155nm。
[0078]
24.根据项1
‑
23中任一项的方法，其中所述arrna经多次导入所述细胞，且两次导入间隔≥21天，例如≥17天、≥14天、≥12天、≥11天或≥10天；在一些实施方案中，所述两次导入间隔为9
‑
20天、9
‑
16天、9
‑
14天、 12
‑
19天、12
‑
15天、或12
‑
13天；在一些实施方案中，所述两次导入间隔为 7天、8天、11天、15天、18天、19天、20天。
[0079]
25.一种预防或治疗赫勒氏综合征的方法，包括使用根据项1
‑
24中任一项所述的方法校正赫勒氏综合征的致病性g>a突变。
[0080]
26.一种工程化arrna，该arrna用于基于leaper技术靶向编辑细胞中靶标rna，其中所述靶标rna包含含有g>a突变位点(靶标腺苷) 的idua基因转录本序列，所述arrna包含与所述靶标rna杂交的互补r na序列，所述arrna与所述靶标rna杂交后能够招募作用于rna的腺苷脱氨酶(adar)以使靶标rna中的靶标腺苷脱氨基，所述arrna靶向的g到a的突变位点是赫勒氏综合征患者基因组中nm_000203.4(idua)
‑
c. 1205g>a(p.trp402ter)的突变位点，或其相应的突变位点。
[0081]
27.项26中的arrna，其中所述与靶标腺苷相对的核苷(靶向核苷) 为胞苷(c)、腺苷(a)或尿苷(u)。
[0082]
28.项27中的arrna，其中所述靶向腺苷与其5’最近邻核苷和3’最近邻核苷组成靶向三联体，该靶向三联体为5
’‑
cca
‑3’
。
[0083]
29.项26
‑
28中任一项的arrna，其中所述arrna选自下述任一长度特征的arrna：
[0084]
55nt
‑
c
‑
35nt、55nt
‑
c
‑
25nt、55nt
‑
c
‑
24nt、55nt
‑
c
‑
21nt、55nt
‑
c
‑
20nt、55nt
‑
c
ꢀ‑
19nt、55nt
‑
c
‑
18nt、55nt
‑
c
‑
17nt、55nt
‑
c
‑
16nt、55nt
‑
c
‑
15nt、55nt
‑
c
‑
14nt、55n t
‑
c
‑
13nt、55nt
‑
c
‑
12nt、55nt
‑
c
‑
11nt、55nt
‑
c
‑
10nt、55nt
‑
c
‑
9nt、50nt
‑
c
‑
20nt、50 nt
‑
c
‑
15nt、45nt
‑
c
‑
55nt、45nt
‑
c
‑
20nt，其中c为arrna中与靶标腺苷相对的靶向核苷，arrna的方向为5’至3’的方向。
[0085]
30.根据项26
‑
29中任一项的arrna，其中所述arrna包含一种或多种化学修饰。
[0086]
31.根据项26
‑
30中任一项的arrna，其中所述化学修饰选自如下的一种或多种：
[0087]2’‑
o
‑
甲基化修饰、硫代磷酸酯修饰、脱氧核糖核苷替代修饰、lna修饰、2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰。
[0088]
32.根据项26
‑
31中任一项的arrna，其中所述化学修饰选自如下的一种或多种：
[0089]
1)前2、3、4或5个核苷酸的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0090]
2)后2、3、4、或5个核苷酸的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0091]
3)除靶向三联体以外全部胞苷的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0092]
4)前2、3或4个核苷酸的2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰；
[0093]
5)后2、3、或4个核苷酸的2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰；
[0094]
6)前2、3或4个核苷酸的脱氧核糖核苷替代修饰；
[0095]
7)后2、3或4个核苷酸的脱氧核糖核苷替代修饰；
[0096]
8)前1、2、3、4或5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；
[0097]
9)后1、2、3、4、或5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；
[0098]
10)除靶向三联体各核苷酸5’或3’最近邻核苷酸间连接中的一个或多个不做硫代磷酸酯修饰以外，所有核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；和
[0099]
11)除靶向三联体各核苷酸5’或3’最近邻核苷酸间连接中的一个或多个不做硫代磷酸酯修饰以外，每间隔一个、二个、或三个、或四个核苷酸的核苷酸间连接做硫代磷酸酯修饰。
[0100]
33.根据项26
‑
32中任一项的arrna，所述arrna包含选自下组任一种的化学修饰：
[0101]
cm0：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，并且前3 个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；
[0102]
cm1：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；并且序列中全部u均经2
’‑
o
‑ꢀ
甲基化修饰；
[0103]
cm2：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；并且靶向核苷的3’最近邻核苷经2
’‑
o
‑
甲基化修饰；
[0104]
cm3：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；并且靶向核苷的5’最近邻核苷经2
’‑
o
‑
甲基化修饰；
[0105]
cm4：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；并且靶向三联体中的三个碱基与各自的3’最近邻核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；
[0106]
cm6：序列前5个和后5个核苷酸分别被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，并且前5 个和后5个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；
[0107]
cm148：序列前4个和后4个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰，前3个和后4个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有u均经2
’‑
o
‑
me 修饰；
[0108]
cm149：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰，前 2个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有u均经2
’‑
o
‑
me 修饰；
[0109]
cm150：序列前2个和后2个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰，第 1个和后2个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有u均经2
’‑
o
‑
me 修饰；
[0110]
cm151：序列前4个和后4个核苷酸分别经lna修饰，前3个和后4 个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有尿苷均经2
’‑
o
‑
me修饰；
[0111]
cm152：序列前3个和后3个核苷酸分别经lna修饰，前2个和后3 个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有尿苷均经2
’‑
o
‑
me修饰；
[0112]
cm153：序列前2个和后2个核苷酸分别经lna修饰，前2个和后3 个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有尿苷均经2
’‑
o
‑
me修饰；
[0113]
cm94：序列前3个和后3个核苷酸、序列中的全部u和除靶向三联体以外的全部c均被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前4个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰，且从5’末端第4个核苷酸间连接至3’末端第3个核苷酸间连接中除靶向三联体中各核苷酸5’最近邻核苷酸间连接不做硫代磷酸酯修饰以外，每隔一个核苷酸间连接经硫代磷酸酯修饰；
[0114]
cm119：序列前3个和后3个核苷酸、序列中的全部u和除靶向三联体以外的全部c均被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前4个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰；从5’末端第4个核苷酸间连接至靶向核苷的3’最近邻核苷酸间连接以及从3’末端第3个核苷酸间连接至靶向核苷的3’最近邻核苷酸，每隔一个核苷酸间连接经硫代磷酸酯修饰；并且靶标核苷经脱氧核糖核苷替代；
[0115]
cm120：序列前3个和后3个核苷酸、序列中的全部u和除靶向三联体以外的全部c均
被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前4个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰；从5’末端第4个核苷酸间连接至靶向核苷的5’最近邻核苷酸间连接以及从3’末端第3个核苷酸间连接至靶向核苷的3’最近邻核苷酸间连接，每隔一个核苷酸间连接经硫代磷酸酯修饰；并且靶标核苷经脱氧核糖核苷替代；
[0116]
cm123：序列前3个和后3个核苷酸、序列中的全部u和除靶向三联体以外的全部c均被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前4个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰；从5’末端第4个核苷酸间连接至靶向核苷的3’最近邻核苷酸间连接以及从3’末端第3个核苷酸间连接至靶向核苷的3’最近邻核苷酸，每隔一个核苷酸间连接经硫代磷酸酯修饰；并且靶向三联体中的各核苷均经脱氧核糖核苷替代；
[0117]
cm125：序列前3个和后3个核苷酸、序列中的全部u和除靶向三联体以外的全部c均被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前4个和后3个核苷酸间连接及靶标核苷的3’最近邻核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰；从5’末端第4个核苷酸间连接至靶向核苷的5’最近邻核苷酸的5’最近邻核苷酸以及从3’末端第3 个核苷酸间连接至靶向核苷的3’最近邻核苷酸，每隔一个核苷酸间连接经硫代磷酸酯修饰；并且靶向三联体中的各核苷均经脱氧核糖核苷替代。
[0118]
34.根据项26
‑
33中任一项的arrna，其中所述arrna包含选自以下的任一序列：
[0119]
1)
[0120]
gm*am*cm*g*cm
‑
cm*cm
‑
a*cm
‑
cm*g
‑
um*g
‑
um*g
‑
g*um
‑
um*g
ꢀ‑
cm*um
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
a*g
‑
g*a
‑
cm*g
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
cm*g
‑
g*cm
‑
cm *um
‑
g*cm
‑
g*a
‑
cm*a
‑
cm*um
‑
um*cm
‑
g*g
‑
cm
‑
c
‑
c
‑
a*g
‑
a*g
‑
cm*um
‑ꢀ
g*cm
‑
um*cm
‑
cm*um*cm*am(seq id no:31)
[0121]
2)
[0122]
gm*am*cm*g*cm
‑
cm*cm
‑
a*
‑
cm
‑
cm*g
‑
um*g
‑
um*g
‑
g*um
‑
um* g
‑
cm*um
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
a*g
‑
g*a
‑
cm*g
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
cm*g
‑
g*cm
‑
c m*um
‑
g*cm
‑
g*
‑
a
‑
cm*a
‑
cm*um
‑
um*cm
‑
g*g
‑
cm*cd
‑
cd*ad*
‑
g
‑
a*g
‑
c m*um
‑
g*cm
‑
um*cm
‑
cm*um*cm*am(seq id no:31)；
[0123]
3)
[0124]
gm*am*cm*g*cm
‑
cm*cm
‑
a*cm
‑
cm*g
‑
um*g
‑
um*g
‑
g*um
‑
um*g
ꢀ‑
cm*um
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
a*g
‑
g*a
‑
cm*
‑
g
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
cm*g
‑
g*cm
‑
c m*um
‑
g*
‑
cm
‑
g*a
‑
cm*a
‑
cm*um
‑
um*cm
‑
g*g
‑
cm
‑
cd
‑
cd*ad*g
‑
a*g
‑
c m*um
‑
g*cm
‑
um*cm
‑
cm*um*cm*am(seq id no:31)；
[0125]
4)
[0126]
gmoe*amoe*cmoe*gmoe
‑
c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
c
‑
c
‑
g
‑
um
‑
g
‑
um
‑
g
‑
g
‑
um
‑
um
‑
g
‑ꢀ
c
‑
um
‑
g
‑
um
‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
g
‑
a
‑
c
‑
g
‑
g
‑
um
‑
c
‑
c
‑
c
‑
g
‑
g
‑
c
‑
c
‑
um
‑
gc
‑
g
‑
a
‑
c
‑
a
‑
c
‑ꢀ
um
‑
um
‑
c
‑
g
‑
g
‑
c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
a
‑
g
‑
c
‑
um
‑
g
‑
c
‑
um
‑
c*cmoe*umoe*cmoe*amo e(seq id no:31)；或
[0127]
5)
[0128]
g *a *c *g c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
c
‑
c
‑
g
‑
um
‑
g
‑
um
‑
g
‑
g
‑
um
‑
um
‑
g
‑
c
‑
um
‑
g
‑
um
ꢀ‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
g
‑
a
‑
c
‑
g
‑
g
‑
um
‑
c
‑
c
‑
c
‑
g
‑
g
‑
c
‑
c
‑
um
‑
gc
‑
g
‑
a
‑
c
‑
a
‑
c
‑
um
‑
um
‑
c
‑
g
ꢀ‑
g
‑
c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
a
‑
g
‑
c
‑
um
‑
g
‑
c
‑
um
‑
c*c *u *c *a (seq id no:31)。
[0129]
35.包含项26
‑
29中任一项的arrna编码序列的构建体。
[0130]
36.包含项26
‑
34中任一项的arrna或项35的构建体的组合物、脂质体、外泌体、脂质
‑
纳米颗粒、细胞、文库、制品或试剂盒。
[0131]
37.项26
‑
34中任一项的arrna、项35的构建体、项36的组合物、脂质体、外泌体、脂
质
‑
纳米颗粒、细胞、文库或试剂盒在制备预防或治疗赫勒氏综合征的药物、制品、试剂盒中的用途。
[0132]
在一些实施方案中，所述arrna包含与idua编码rna序列互补的序列，并包含一个或多个错配、摆动配对(wobble)和/或单侧突起(bulge)。
[0133]
在本技术中，arrna可以表示为xnt
‑
c
‑
ynt的格式(方向为5’至3’端)，其中x表示所述靶向核苷(不包含)至所述arrna 5'端最后一个核苷酸(包含)的核苷酸个数，y表示靶向苷酸(不包含)至所述arrna 3'端最后一个核苷酸(包含)的核苷酸个数。例如，当所述arrna为55nt
‑
c
‑
35nt时，则表示所述靶向核苷距离所述arrna 5’末端55个核苷酸，距离所述arrna3’末端为35个核苷酸，且整条arrna长度为55nt 35nt 1nt＝91nt。
[0134]
在一些实施方案中，所述arrna不包含能够形成用于招募adar酶的分子内茎环结构的区域。在一些实施方案中，所述基于leaper技术靶向编辑细胞中靶标rna的方法不包括向细胞中引入外源的adar酶蛋白。在一些实施方案中，所述基于leaper技术靶向编辑细胞中靶标rna的方法包括向细胞中引入外源的adar酶蛋白。
[0135]
使用本发明所述的arrna，从细胞水平上进行验证可以发现，其靶向的 idua基因编码rna上c.1205g>a突变位点的恢复率(a>g编辑效率)为至少约30％，例如至少约30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％， 65％，70％，75％，80％，85％，90％或更高。
[0136]
本发明所述的用于治疗或预防赫勒氏综合征的方法，其中所述arrna 不会引起机体强烈的免疫应答。
[0137]
综上，本技术提供了可用于赫勒氏综合征治疗的arrna，包含该arrna 的构建体、组合物、细胞、文库或试剂盒，以及使用所述arrna、构建体、组合物、细胞、文库或试剂盒预防和治疗赫勒氏综合征的方法。本技术的技术方案至少具有以下优点：
[0138]
1.不依赖于外源蛋白的表达。因此，不会由于引入外源蛋白而导致细胞损伤；不会由于过表达外源蛋白而引起的脱靶效应；不会导致由外源蛋白引起的机体免疫反应；也不会由于机体内的预存抗体使有效外源蛋白被中和从而导致基因编辑失败；不会因为需引入的蛋白分子量过大而限制递送载体的选择。
[0139]
2.本技术提供的是一种rna编辑方法，其与dna编辑不同，是可逆和可调控的，不会破坏基因组dna造成不可逆损害，因此更为安全。
[0140]
3.相较于其他适用于体内基因编辑治疗方案，本技术提供的技术方案编辑效率更高。
附图说明
[0141]
图1显示了在gm06214细胞上检测idua基因型(c1205 g>a)。
[0142]
图2a
‑
2b针对iduapre
‑
mrna和mrna设计arrna。对经这些arrna 编辑(arrna通过电转染进入细胞)的细胞进行功能检测；并对编辑位点 a>g的编辑效率进行检测。
[0143]
图3a
‑
3b显示了idua
‑
报告子细胞系的设计(3a)和在293t
‑
idua
‑ꢀ
报告子上检测不同长度arrna(对称截短)的编辑效率(arrna通过电转染进入细胞)(3b)。
[0144]
图4a
‑
4b显示了在gm06214细胞上电转染不同长度(对称截短)arrna 后，不同时间点的酶活和编辑效率。
[0145]
图5显示了在gm06214细胞用lipofectaminernaimax转染arrna(对称截短、3`截短
和5`截短)后，idua酶活性和编辑效率检测。
[0146]
图6a
‑
6b显示了优选的55nt
‑
c
‑
25nt到55nt
‑
c
‑
5nt的arrna(3`端碱基逐个减少)，经lipofectaminernaimax转染进入gm06214细胞，通过酶活性检测选出其中的优选的3端长度范围。图6a为55nt
‑
c
‑
25nt到55nt
‑
c
‑
10nt 的arrna检测结果。图6b使用的是另一批次合成的55nt
‑
c
‑
16nt到55nt
‑
c
‑
5nt 的arrna。
[0147]
图7显示3'端长度相同(固定在两种优选长度)，5'端长短不一(从55nt 逐渐减少)的arrna经lipofectaminernaimax转染进入gm06214细胞，经酶活性检测，筛选出优选的5'端长度范围。该图同时也显示了，当arrna 低于60nt时，其编辑效率显著降低。
[0148]
图8对3条优选长度的arrna的编辑位点进行有限的移动，产生3组 arrna。各组的arrna长度相同，编辑位点不同。用lipofectaminernaimax 转染将这些arrna分别转染进gm06214细胞，通过酶活性检测，筛选出长度和编辑位置的最佳组合。
[0149]
图9a
‑
9c在3个arrna长度下比较了cm1与cm0修饰对arrna编辑效率的影响(图9a)，并将含有不同化学修饰的71nt和76nt的arrna通过lipofectaminernaimax转染进gm06214细胞，通过酶活性检测(图9b) 及目的位点a>g突变率检测(图9c)筛选优选化学修饰。
[0150]
图10a
‑
10b cm1修饰的55nt
‑
c
‑
16nt,55nt
‑
c
‑
14nt,55nt
‑
c
‑
11nt的浓度梯度实验。分别从酶活(图10a)和目的位点突变率(图10b)的角度观察arrna 的作用情况。
[0151]
图11a
‑
11b用lipofectaminernaimax将arrna转染入gm06214细胞，通过酶活性检测，进一步验证cm1修饰的效果。
[0152]
图12显示了在人肝脏原代细胞中编辑对野生型idua基因进行a>g 突变的编辑效率。
[0153]
图13比较了本技术中的方法与现有技术中的优选方法在gm06214细胞中对c.1239g>a(p.trp402ter)突变位点转录本的编辑效率，通过idua酶活性进行呈现。
[0154]
图14a
‑
14b显示了不同种类及数量的末端修饰对arrna的g>a基因编辑结果的影响，以含报告子系统的细胞在第二天(图14a)和第七天(图 14b)的荧光表达量进行呈现。
[0155]
图15a
‑
15c显示了不同数量和不同碱基位置的硫代磷酸酯修饰、 2
’‑
o
‑
me修饰和脱氧核糖核苷替代的组合对arrna的g>a基因编辑结果的影响，以含报告子系统的细胞在第三天(图15a)、第5天(图15b)、和第七天(图15c)的荧光表达量进行呈现。
具体实施方式
[0156]
定义
[0157]
本文将以实施例并参考附图来描述本发明，但是本发明不限于此，而是仅由权利要求书进行限定。权利要求中的任何附图标记不应被解释为限制范围。在本说明书和权利要求书中使用术语“包括”或“包含”时，其不排除其他组成部分、元素或步骤。当本文某个核苷酸的数字范围时，则包括该范围内的二个端点的数值和二个端点之间所有居间整数。例如，对于60
‑
200 个核苷酸的范围，除了40个核苷酸和260个核苷酸的数目之外，还涵盖60 至200个核苷酸之间的任何整数的核苷酸。
[0158]
提供以下术语或定义仅仅是为了帮助理解本发明。除非本文具体定义，否则本文所用的所有术语与本发明领域的技术人员所使用的具有相同的含义。从业者可依据《分子克隆：实验室手册(第四版)》，(2017年3月，科学出版社有限责任公司出版，作者j.萨姆布鲁
克、m.r.格林，译者，贺福初) 等书籍理解本领域的定义和术语。本文提供的定义不应被解释为具有小于本领域普通技术人员所理解的范围。
[0159]
如本文所用，“靶标位点”是指rna序列中待被编辑的核苷酸位点。
[0160]
术语“drna”(deaminase recruiting rna)指能够募集腺苷脱氨酶 (adar)等脱氨基酶，以使靶腺苷脱氨基的工程化rna。该drna因其募集腺苷脱氨酶的作用，也可称为“arrna”(adenosine deaminase recruitingrna)。在本技术中drna和arrna可互换使用，表示相同含义。例如在本技术的上下文中，arrna通过碱基互补配对与细胞中的一段rna结合，招募脱氨基酶，例如adar，使位于该rna序列靶标位点的靶标核苷，例如腺苷(a)，脱氨基转化为，例如肌酐，从而实现编辑。其中，当靶标核苷为腺苷时，靶标核苷又称为“靶标腺苷”或“靶标a”。该包含所述靶标核苷的rna称为“靶标rna”或“目的rna”，其所包含的具有靶标核苷的序列被称为“靶标序列”或“目的序列”。
[0161]
在本发明中，所使用的arrna在与靶标rna杂交结合时，arrna序列中有一个核苷与靶标rna中待编辑的靶腺苷直接相对。arrna序列中的这个核苷可以是胞苷(c)，腺苷(a)或尿苷(u)。与目标腺苷直接相对的这个胞苷(c)，腺苷(a)和尿苷(u)统称为“靶向核苷”，或分别称为“靶向胞苷(c)”，“靶向腺苷(a)”和“靶向尿苷(u)”。
[0162]
在本技术中，所有核酸序列的书写顺序均为从5’到3’端。因此在本文中当使用“前”和“后”来修饰某序列时，则分别表示所述序列的“5’末端”及“3’末端”。其中，任一核苷酸5’端方向与其最邻近的核苷酸被称为所述核苷酸的“5’最近邻核苷酸”或“5’最近邻核苷”；任一核苷酸3’端方向与其最邻近的核苷酸被称为所述核苷酸的“3’最近邻核苷酸”或“3’最近邻核苷”。所述任一核苷酸与其5’最近邻核苷酸间连接称为“5’最近邻核苷酸间连接”；所述任一核苷酸与其3’最近邻核苷酸间连接称为“3’最近邻核苷酸间连接”。例如靶标rna中靶标核苷5’端和3’端方向与其最邻近的核苷酸分别被称为“靶标核苷的5’最近邻核苷”和“靶标核苷的3’最近邻核苷”。而靶标核苷与其5’最近邻核苷和3’最近邻核苷相连形成的核苷三联体称为“靶标三联体”。同理，靶向核苷5’端和3’端方向与其最邻近的核苷酸分别被称为“靶向核苷的5’最近邻核苷”和“靶向核苷的3’最近邻核苷”，而arrna中靶向核苷与其5’最近邻核苷和3’最近邻核苷相连形成的核苷三联体称为“靶向三联体”。
[0163]
术语“多核苷酸”，“核苷酸序列”和“核酸”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，即脱氧核糖核苷酸(dna)或核糖核苷酸(rna) 或其类似物。所述脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸均可以“核苷酸”或“核苷”代称。在本技术中，除非特别指出，“核苷酸”与“核苷”可互换使用。核苷酸之间以磷酸二酯键相连。多个核苷酸之间以磷酸二酯键相连形成多核苷酸或核酸。核苷酸之间的磷酸二酯键可以被硫代修饰，将磷酸二酯键中的一个双键氧替换为双键硫，形成“硫代磷酸酯键”，而这一过程则称为“硫代磷酸酯修饰”。
[0164]
在本技术中，“2
’‑
o
‑
me”或“2
’‑
ome”即2
‑
o
’‑
甲基，是指核苷酸核糖上第二位羟基上的氢原子被甲基替代后形成的基团，而这个甲基取代的过程被称为“2
’‑
o
‑
甲基化”、“2
’‑
o
‑
甲基化修饰”、“2
’‑
ome修饰”或“2
’‑
o
‑
me 修饰”。如本文所用，所述“lna”或“锁核酸”是指一种特殊的双环状核苷酸衍生物，其核糖2’与4’通过缩水作用形成氧亚甲基桥，成环型结构。因此，本技术所述“锁核酸修饰”或“lna修饰”即是指被修饰的核苷酸为锁核酸。
[0165]
如本文所用，所述“脱氧核糖核苷替代”修饰是指rna中的核糖核苷酸被置换为其对应的脱氧核糖核苷酸。
[0166]
所述“2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)”是指被修饰的核苷酸核糖上第二位羟基上的氢原子被2
‑
甲氧乙基取代形成的基团，而这个被2
‑
甲氧乙基取代的过程被称为2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰”。
[0167]
在本文中，当标注于核酸序列中时，“*”表示硫代磷酸酯修饰的核苷酸间连接，“m”表示其左侧紧邻的核苷经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，“moe”表示其左侧紧邻的核苷经2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰，“ ”表示其左侧紧邻的核苷经lna 修饰，“d”表示其左侧紧邻的核苷经脱氧核糖核苷替代。如本文所用，当“>”用于两个代表核苷酸、核苷或碱基的字母之间时，则表示其左侧字母所代表的核苷经修饰转化为其右侧字母所代表的核苷的突变。例如“g>a”则表示鸟苷至腺苷的突变。
[0168]
在本文中，“互补”是指核酸通过传统的沃森
‑
克里克碱基配对原则与另一核酸形成氢键。本文所述的互补可以指两条核酸的多数核苷酸互补，无需所有核苷酸均形成互补。
[0169]“rna编辑”是指存在于真核细胞中的一种天然过程，rna编辑是在 dna转录之后，蛋白质翻译之前在rna水平上发生的由碱基a(腺苷)到i(肌酐)的编辑，肌酐在翻译的过程中被识别为g(鸟苷)，从而达到a>g的转化。这种编辑可由adar(adenosine deaminase acting on rna)蛋白酶催化a 脱氨基形成i而发生，最终产生单核苷酸的定点编辑。编辑可以发生的编码区包括内含子和外显子序列，也可以发生在非编码区序列，编码区的编辑可以重新定义蛋白质编码序列。
[0170]
如本文所用，“构建体”是指包含rna编码序列或氨基酸编码序列的核酸，其中所述编码序列可通过转录或翻译表达所述rna或氨基酸。所述构建体可以是环状或线状，可以为双链也可以为单链，可以为dna也可以为 rna或dna与rna的杂交分子，并且可以经由化学合成或生物合成。在一些特定的实施方案中，所述构建体为质粒。在一些特定的实施方案中，所述构建体是寡核苷酸。
[0171]
如本文所用，向细胞中“引入”或“导入”是指通过转染、感染、内吞作用等方式使蛋白或编码所述蛋白的核酸、rna或编码所述rna的构建体、质粒或其它线性或环状dna等穿过细胞膜进入细胞的过程。
[0172]
为了解决目前赫勒氏综合征缺乏可靠疗法的现状，本发明针对赫勒氏综合征的个性化特征，选取其中idua致病基因中占比最高的突变型 (nm_000203.4(idua)
‑
c.1205g>a(p.trp402ter))，以leaper技术为基础，优化arrna长度及靶向核苷酸位置，同时引入适当化学修饰，开发了本发明中的功能rna，即arrna，及其使用方法，用于赫勒氏综合征的治疗。所述arrna可通过碱基序列互补配对靶向结合含有g>a突变位点的α
‑
l
‑ꢀ
艾杜糖醛酸酶(α
‑
l
‑
iduronidase，idua)编码rna序列，招募脱氨基酶，使所述突变位点的腺苷(a)(靶标腺苷)脱氨基形成肌酐(i)，而i在翻译的过程中将被识别为g(鸟苷)，从而达到a>g的转化。使用本发明中的arrna 及方法可使idua基因转录的pre
‑
mrna或mrna中因ugg>uag突变而提前出现的终止密码子恢复为编码色氨酸的密码子ugg，使得idua酶的合成继续，恢复idua酶的功能。
[0173]
通过构建带有idua致病突变(c.1205g>a)的报告子系统，同时使用购自coriell institute的gm06214细胞(hurler综合征患者来源的成纤维细胞 (9号外显子idua基因1293位为tgg>tag[trp402ter(w402x)]纯和突变)，并以gm01323细胞(沙伊氏综合征患者来源成纤维细胞,6号外显子的
‑
7位内，即5号内含子上含有一个g>a转换(ivs5as
‑
7g>a))为对
照，对本技术中arrna的功能和特征进行了验证。所述验证包括将arrna转染至包含上述报告子系统的细胞，或gm06214细胞，通过比较repoter系统的荧光强度， idua酶的功能，或通过ngs(二代测序技术)等方法检测a>g编辑效率或突变率，来测试arrna编辑功效。
[0174]
rna编辑方法
[0175]
一方面，本技术提供了一种基于leaper技术靶向编辑细胞中靶标 rna的方法，其中所述靶标rna包含含有鸟苷(g)到腺苷(a)突变位点(靶标腺苷)的idua基因转录本序列，该方法包括：将arrna或包含所述arrna编码序列的构建体导入所述细胞中，其中所述arrna包含与所述靶标rna杂交的互补rna序列，并且其中所述arrna与所述靶标rna 杂交后能够招募作用于rna的腺苷脱氨酶(adar)以使靶标rna中的靶标腺苷脱氨基。
[0176]
在一些实施方案中，所述靶标rna中所述靶标腺苷的5'最近邻核苷是选自u，c，a和g的核苷酸，优选的程度为u>c≈a>g，而所述靶标rna 中所述靶标腺苷的3'最近邻核苷是选自g，c，a和u的核苷，优选的程度为g>c>a≈u。在一些实施方案中，所述靶标rna中的所述靶标腺苷位于选自：由uag，uac，uaa，uau，cag，cac，caa，cau，aag， aac，aaa，aau，gag，gac，gaa和gau构成的组的靶标三联体中。在一些实施方案中，所述靶标腺苷与其5’最近邻核苷和3’最近邻核苷组成的靶标三联体为5
’‑
uag
‑3’
。在一些实施方案中，所述靶标rna选自：idua 基因转录的pre
‑
mrna或mrna。在一些实施方案中，所述靶标rna为idua 基因转录的pre
‑
mrna。
[0177]
在一些实施方案中，所述arrna包含与互补idua编码rna序列的一个或多个错配、摆动配对(wobble)和/或单侧突起(bulge)。在一些实施方案中，所述arrna不包含能够形成用于招募adar酶的分子内茎环结构的区域。
[0178]
在一些实施方案中，所述arrna上与靶标腺苷相对的核苷(靶向核苷) 为胞苷(c)、腺苷(a)或尿苷(u)，优选地为c。在一些实施方案中，所述靶向腺苷的5’最近邻核苷为c、g或u。在一些实施方案中，所述靶向腺苷的3’最近邻核苷为a。在一些实施方案中，所述靶向核苷与其5’最近邻核苷和3’最近邻核苷组成靶向三联体，该靶向三联体为5
’‑
cca
‑3’
。
[0179]
在一些实施方案中，所述arrna长度大于61nt，例如所述arrna的长度为62
‑
121nt、62
‑
111nt、62
‑
101nt、62
‑
100nt、62
‑
91nt、62
‑
76nt或62
‑
70nt；在一些实施方案中所述arrna的长度选自62
‑
121nt中的任一整数个核苷酸的长度；在一些特定的实施方案中，所述arrna的长度为62nt、63nt、64t、 65nt、66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、86nt、87nt、88nt、 89nt、90nt、92nt、95nt、98nt、100nt、103nt或106nt。
[0180]
在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的3’末端的距离小于所述靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离。在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离其3'末端大于8nt，例如9
‑
60nt，优选地为9
‑
45nt或9
‑
35nt；在一些实施方案中，为了尽可能避免超长的poly g结构，所述arrna的靶向核苷距离其3'末端的距离选自9
‑
25nt、9
‑
26nt、或9
‑
27nt；优选地，在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离其3'末端的距离选自9
‑
20nt、9
‑
21nt、或9
‑
22nt；在一些特定的实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离其3'末端的距离选自9
‑
25nt中的任一整数个核苷酸，例如10nt、 11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、23nt或24nt。在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离其5’末端大于25nt，例如26
‑
60nt、 35
‑
60nt或45
‑
60nt；在一些优选的实施方案中，所述arrna的靶
向核苷距离其5’末端的距离选自：45nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt、50nt、51nt、 52nt、53nt、54nt、55nt、56nt、57nt、58nt或59nt。
[0181]
在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离小于所述靶向核苷距离所述arrna的3’末端的距离。在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离大于35nt，例如36
‑
60nt或36
‑
55nt；优选地，所述arrna的靶向核苷距离所述arrna 的5’末端的距离选自选自54nt、53nt、52nt、51nt、50nt、49nt、48nt、47nt、 46nt、45nt、44nt、43nt、42nt、41nt、40nt、39nt、38nt或36nt。
[0182]
在一些实施方案中，所述arrna选自下述任一长度特征的arrna： 55nt
‑
c
‑
35nt、55nt
‑
c
‑
25nt、55nt
‑
c
‑
24nt、55nt
‑
c
‑
21nt、55nt
‑
c
‑
20nt、55nt
‑
c
‑
19nt、 55nt
‑
c
‑
18nt、55nt
‑
c
‑
17nt、55nt
‑
c
‑
16nt、55nt
‑
c
‑
15nt、55nt
‑
c
‑
14nt、55nt
‑
c
‑
13nt、 55nt
‑
c
‑
12nt、55nt
‑
c
‑
11nt、55nt
‑
c
‑
10nt、55nt
‑
c
‑
9nt、50nt
‑
c
‑
20nt、50nt
‑
c
‑
15nt、 45nt
‑
c
‑
55nt、45nt
‑
c
‑
20nt。优选地，所述arrna选自下述任一长度特征的 arrna：55nt
‑
c
‑
20nt、55nt
‑
c
‑
15nt、55nt
‑
c
‑
14nt。
[0183]
在一些实施方案中所述arrna是寡核苷酸。在一些实施方案中，所述 arrna包含一种或多种化学修饰。本领域技术人员应当知晓，一些适当的化学修饰可以在保证编辑效率的同时，提高rna在细胞或体内的稳定性，从而提高arrna的编辑效率。例如在rna两端的核苷上添加2
’‑
o
‑
甲基化修饰或使核苷酸间连接经过硫代磷酸酯修饰。通过本技术的实施方案，可以看出，本技术中的arrna序列可以经由选自如下的一种或多种化学修饰来提升arrna稳定性和编辑效率：2
’‑
o
‑
甲基化修饰、硫代磷酸酯修饰、脱氧核糖核苷替代修饰、lna修饰、2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰。具体地，在一些实施方案中，所述化学修饰选自如下的一种或多种：
[0184]
1)前2、3、4或5个核苷酸的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0185]
2)后2、3、4、或5个核苷酸的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0186]
3)除靶向三联体以外全部胞苷的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0187]
4)前2、3或4个核苷酸的2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰；
[0188]
5)后2、3或4个核苷酸的2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰；
[0189]
6)前2、3或4个核苷酸的脱氧核糖核苷替代修饰；
[0190]
7)后2、3或4个核苷酸的脱氧核糖核苷替代修饰；
[0191]
8)前1、2、3、4或5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；
[0192]
9)后1、2、3、4、或5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；
[0193]
10)除靶向三联体各核苷酸5’或3’最近邻核苷酸间连接中的一个或多个不做硫代磷酸酯修饰以外，所有核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；和
[0194]
11)除靶向三联体各核苷酸5’或3’最近邻核苷酸间连接中的一个或多个不做硫代磷酸酯修饰以外，每间隔1个、2个、3个、或4个核苷酸的核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰。
[0195]
优选地，在一些特定的实施方案中所述化学修饰选自如下的一种或多种：
[0196]
1)前2、3、4或5个核苷酸和后2、3、4、或5个核苷酸的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0197]
2)除靶向三联体以外全部胞苷的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0198]
3)前2、3或4个核苷酸和后2、3、或4个核苷酸的2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基) 修饰。
[0199]
4)前2、3或4个核苷酸和后2、3、或4个核苷酸的脱氧核糖核苷替代修饰。
[0200]
5)前1、2、3、4或5个核苷酸间连接和后1、2、3、4、或5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰。
[0201]
6)除靶向三联体各核苷酸5’或3’最近邻核苷酸间连接中的一个或多个不做硫代磷酸酯修饰以外，所有核苷酸间连接或最多间隔一个核苷酸间连接做硫代磷酸酯修饰。
[0202]
在一些实施方案中，所述arrna包含选自下组任一种的化学修饰：
[0203]
cm0、cm1、cm2、cm3、cm4、cm6、cm148、cm149、cm150、 cm151、cm152、cm153、cm94、cm119、cm120、cm123、cm125。
[0204]
在一些实施方案中，所述arrna靶向的g到a的突变位点是赫勒氏综合征患者基因组中nm_000203.4(idua)
‑
c.1205g>a(p.trp402ter)的突变位点，或其相应的突变位点。在一些实施方案中，所述arrna包含选自以下的任一序列：
[0205]
1)gm*am*cm
‑
g*cm
‑
cm*cm
‑
a*cm
‑
cm*g
‑
um*g
‑
um*g
‑
g*um
‑
um *g
‑
cm*um
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
a*g
‑
g*a
‑
cm*g
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
cm*g
‑
g*cm
‑ꢀ
cm*um
‑
g*cm
‑
g*a
‑
cm*a
‑
cm*um
‑
um*cm
‑
g*g
‑
cm
‑
c
‑
c
‑
a*g
‑
a*g
‑
cm* um
‑
g*cm
‑
um*cm
‑
cm*um*cm*am(seq id no:31)
[0206]
2)gm*am*cm
‑
g*cm
‑
cm*cm
‑
a*
‑
cm
‑
cm*g
‑
um*g
‑
um*g
‑
g*um
‑
u m*g
‑
cm*um
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
a*g
‑
g*a
‑
cm*g
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
cm*g
‑
g*c m
‑
cm*um
‑
g*cm
‑
g*
‑
a
‑
cm*a
‑
cm*um
‑
um*cm
‑
g*g
‑
cm*cd
‑
cd*ad*
‑
g
‑
a* g
‑
cm*um
‑
g*cm
‑
um*cm
‑
cm*um*cm*am(seq id no:31)；
[0207]
3)gm*am*cm
‑
g*cm
‑
cm*cm
‑
a*cm
‑
cm*g
‑
um*g
‑
um*g
‑
g*um
‑
um *g
‑
cm*um
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
a*g
‑
g*a
‑
cm*
‑
g
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
cm*g
‑
g*cm
‑ꢀ
cm*um
‑
g*
‑
cm
‑
g*a
‑
cm*a
‑
cm*um
‑
um*cm
‑
g*g
‑
cm
‑
cd
‑
cd*ad*g
‑
a*g
‑ꢀ
cm*um
‑
g*cm
‑
um*cm
‑
cm*um*cm*am(seq id no:31)；
[0208]
4)gmoe*amoe*cmoe*gmoe
‑
c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
c
‑
c
‑
g
‑
um
‑
g
‑
um
‑
g
‑
g
‑
um
‑
um
‑ꢀ
g
‑
c
‑
um
‑
g
‑
um
‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
g
‑
a
‑
c
‑
g
‑
g
‑
um
‑
c
‑
c
‑
c
‑
g
‑
g
‑
c
‑
c
‑
um
‑
gc
‑
g
‑
a
‑
c
‑
a
‑ꢀ
c
‑
um
‑
um
‑
c
‑
g
‑
g
‑
c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
a
‑
g
‑
c
‑
um
‑
g
‑
c
‑
um
‑
c*cmoe*umoe*cmoe*a moe(seq id no:31)；或
[0209]
5)g *a *c *g c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
c
‑
c
‑
g
‑
um
‑
g
‑
um
‑
g
‑
g
‑
um
‑
um
‑
g
‑
c
‑
um
‑
g
‑ꢀ
um
‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
g
‑
a
‑
c
‑
g
‑
g
‑
um
‑
c
‑
c
‑
c
‑
g
‑
g
‑
c
‑
c
‑
um
‑
gc
‑
g
‑
a
‑
c
‑
a
‑
c
‑
um
‑
um
‑ꢀ
c
‑
g
‑
g
‑
c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
a
‑
g
‑
c
‑
um
‑
g
‑
c
‑
um
‑
c*c *u *c *a (seq id no:3 1)。
[0210]
在一些实施方案中，所述arrna通过选自如下的方法导入所述细胞：电转染、脂质体转染、外泌体递送、或脂质
‑
纳米颗粒递送(lnp)。优选地，所述arrna通过脂质体转染导入所述细胞。在一些实施方案中，所述细胞为人类细胞。在一些实施方案中，所述细胞选自干细胞、软骨细胞、骨膜细胞、间叶细胞、心肌细胞、神经细胞或肝脏细胞。在一些实施方案中，所述细胞优选为肝脏细胞。
[0211]
在一些实施方案中，所述基于leaper技术靶向编辑细胞中靶标rna 的方法包括向所述细胞中引入多种，例如2种、3种、4种或更多种序列不同和/或具有不同化学修饰的arrna。
[0212]
在一些实施方案中，所述细胞被多次导入arrna，例如2次、3次、4 次或更多次。在一些实施方案中，各次导入arrna所使用的方法相同，例如均为脂质体转染，或均为脂质
‑
纳米颗粒递送。在一些实施方案中，各次导入arrna根据细胞状态，所使用的方法不同。
[0213]
在一些实施方案中，所述细胞仅单次导入arrna。在一些实施方案中，所述arrna单次导入细胞的量≥5nm，优选地≥10nm，进一步优选地≥ 20nm；在一些特定的实施方案中，所述arrna单次导入细胞的量为 5
‑
160nm，例如10
‑
160nm、20
‑
160nm、40
‑
160nm、20
‑
80nm、
40
‑
80nm或 20
‑
40nm；在一些特定的实施方案中，所述arrna单次导入细胞的量为 15nm、17nm、19nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、 28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、 38nm、39nm、41nm、43nm、45nm、55nm、65nm、75nm、85nm、95nm、 105nm、115nm、125nm、135nm、145nm或155nm。在一些实施方案中，所述arrna经多次导入所述细胞，且两次导入间隔≥21天，例如≥17天、≥14天、≥12天、≥11天或≥10天；在一些实施方案中，所述两次导入间隔为9
‑
20天、9
‑
16天、9
‑
14天、12
‑
19天、12
‑
15天、或12
‑
13天；在一些实施方案中，所述两次导入间隔为7天、8天、11天、15天、18天、19天、 20天。
[0214]
在一些实施方案中，所述基于leaper技术靶向编辑细胞中靶标rna 的方法不包括向所述细胞中引入任何外源蛋白或所述外源蛋白的编码序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括将外源adar引入所述患者细胞。在一些特定的实施方案中，所外源adar是包含e1008突变的adar1。在一些实施方案中，所述方法也可以包括将adar3的抑制剂引入所述宿主细胞。在一些实施方案中，所述方法还进一步包括将干扰素的刺激剂引入所述宿主细胞。
[0215]
从本技术的实施例数据结果可以看出，使用本技术所述的方法，所述靶标腺苷(g>a)突变位点的恢复率(a>g编辑效率)为至少约20％，例如至少约25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、 80％、85％、90％或更高。
[0216]
arrna
[0217]
一方面，本技术还提供了一种arrna，所述arrna包含与靶标rna杂交的互补rna序列，并且其中所述arrna与所述靶标rna杂交后能够招募作用于rna的腺苷脱氨酶(adar)以使靶标rna中的靶标腺苷脱氨基。其中所述靶标rna包含含有鸟苷(g)到腺苷(a)的突变位点(靶标腺苷)。在一些实施方案中，所述靶标腺苷与其5’最近邻核苷和3’最近邻核苷组成靶标三联体，该靶标三联体为5
’‑
uag
‑3’
。
[0218]
在一些实施方案中，所述arrna包含与互补idua编码rna序列的一个或多个错配、摆动配对(wobble)和/或单侧突起(bulge)。在一些实施方案中，所述arrna不包含能够形成用于招募adar酶的分子内茎环结构的区域。在一些实施方案中，所述arrna上与靶标腺苷相对的核苷(靶向核苷)为胞苷(c)、腺苷(a)或尿苷(u)，优选地为c。在一些实施方案中，所述靶向腺苷的5’最近邻核苷为c、g或u。在一些实施方案中，所述靶向腺苷的3’最近邻核苷为a。在一些实施方案中，所述靶向核苷与其5’最近邻核苷和3’最近邻核苷组成的靶向三联体为5
’‑
cca
‑3’
。在一些实施方案中，所述arrna还包含一个或多个鸟苷，其各自与所述靶标rna中靶标腺苷以外的某一其它腺苷(非靶标腺苷)相对。在一些实施方案中，所述arrna 包含与所述靶标rna中的非靶标腺苷相对的两个或更多个连续错配核苷酸。
[0219]
在一些实施方案中，所述arrna长度大于61nt，例如所述arrna的长度为62
‑
121nt、62
‑
111nt、62
‑
101nt、62
‑
100nt、62
‑
91nt、62
‑
76nt或62
‑
70nt；在一些实施方案中所述arrna的长度选自62
‑
121nt中的任一整数个核苷酸的长度；在一些特定的实施方案中，所述arrna的长度为62nt、63nt、64t、 65nt、66nt、67nt、68nt、69nt、70nt、71nt、72nt、73nt、74nt、75nt、76nt、 77nt、78nt、79nt、80nt、81nt、82nt、83nt、84nt、85nt、86nt、87nt、88nt、 89nt、90nt、92nt、95nt、98nt、100nt、103nt或106nt。
[0220]
在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的3’末端的距离小于所述靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离。在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距
离其3'末端大于8nt，例如9
‑
60nt，优选地为9
‑
45nt或9
‑
35nt；在一些实施方案中，为了尽可能避免超长的poly g结构，所述arrna的靶向核苷距离其3'末端的距离选自9
‑
25nt、9
‑
26nt、或9
‑
27nt；优选地，在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离其3'末端的距离选自9
‑
20nt、9
‑
21nt、或9
‑
22nt；在一些特定的实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离其3'末端的距离选自9
‑
25nt中的任一整数个核苷酸，例如10nt、 11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、23nt或24nt。在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离其5’末端大于25nt，例如26
‑
60nt、 35
‑
60nt或45
‑
60nt；在一些优选的实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离其5’末端的距离选自：45nt、45nt、46nt、47nt、48nt、49nt、50nt、51nt、 52nt、53nt、54nt、55nt、56nt、57nt、58nt或59nt。
[0221]
在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离小于所述靶向核苷距离所述arrna的3’末端的距离。在一些实施方案中，所述arrna的靶向核苷距离所述arrna的5’末端的距离大于35nt，例如36
‑
60nt或36
‑
55nt；优选地，所述arrna的靶向核苷距离所述arrna 的5’末端的距离选自选自54nt、53nt、52nt、51nt、50nt、49nt、48nt、47nt、 46nt、45nt、44nt、43nt、42nt、41nt、40nt、39nt、38nt或36nt。
[0222]
在一些实施方案中，所述arrna选自下述任一长度特征的arrna： 55nt
‑
c
‑
35nt、55nt
‑
c
‑
25nt、55nt
‑
c
‑
24nt、55nt
‑
c
‑
21nt、55nt
‑
c
‑
20nt、55nt
‑
c
‑
19nt、 55nt
‑
c
‑
18nt、55nt
‑
c
‑
17nt、55nt
‑
c
‑
16nt、55nt
‑
c
‑
15nt、55nt
‑
c
‑
14nt、55nt
‑
c
‑
13nt、 55nt
‑
c
‑
12nt、55nt
‑
c
‑
11nt、55nt
‑
c
‑
10nt、55nt
‑
c
‑
9nt、50nt
‑
c
‑
20nt、50nt
‑
c
‑
15nt、 45nt
‑
c
‑
55nt、45nt
‑
c
‑
20nt。优选地，所述arrna选自下述任一长度特征的 arrna：55nt
‑
c
‑
20nt、55nt
‑
c
‑
15nt、55nt
‑
c
‑
14nt。
[0223]
在一些实施方案中所述arrna是寡核苷酸。在一些实施方案中，所述 arrna包含一种或多种化学修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰选自如下的一种或多种：2
’‑
o
‑
甲基化修饰、硫代磷酸酯修饰、脱氧核糖核苷替代修饰、lna修饰、2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰。在一些实施方案中，所述化学修饰选自如下的一种或多种：
[0224]
1)前2、3、4或5个核苷酸的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0225]
2)后2、3、4、或5个核苷酸的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0226]
3)除靶向三联体以外全部胞苷的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0227]
4)前2、3或4个核苷酸的2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰；
[0228]
5)后2、3或4个核苷酸的2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰；
[0229]
6)前2、3或4个核苷酸的脱氧核糖核苷替代修饰；
[0230]
7)后2、3或4个核苷酸的脱氧核糖核苷替代修饰；
[0231]
8)前1、2、3、4或5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；
[0232]
9)后1、2、3、4、或5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；
[0233]
10)除靶向三联体各核苷酸5’或3’最近邻核苷酸间连接中的一个或多个不做硫代磷酸酯修饰以外，所有核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰；和
[0234]
11)除靶向三联体各核苷酸5’或3’最近邻核苷酸间连接中的一个或多个不做硫代磷酸酯修饰以外，每间隔1个、2个、3个、或4个核苷酸的核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰。
[0235]
优选地，在一些特定的实施方案中所述化学修饰选自如下的一种或多种：
[0236]
1)前2、3、4或5个核苷酸和后2、3、4、或5个核苷酸的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0237]
2)除靶向三联体以外全部胞苷的2'
‑
o
‑
甲基化修饰；
[0238]
3)前2、3或4个核苷酸和后2、3、或4个核苷酸的2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基) 修饰。
[0239]
4)前2、3或4个核苷酸和后2、3、或4个核苷酸的脱氧核糖核苷替代修饰。
[0240]
5)前1、2、3、4或5个核苷酸间连接和后1、2、3、4、或5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯修饰。
[0241]
6)除靶向三联体各核苷酸5’或3’最近邻核苷酸间连接中的一个或多个不做硫代磷酸酯修饰以外，所有核苷酸间连接或最多间隔一个核苷酸间连接做硫代磷酸酯修饰。
[0242]
在一些实施方案中，所述arrna包含选自下组任一种的化学修饰：
[0243]
cm0、cm1、cm2、cm3、cm4、cm6、cm148、cm149、cm150、 cm151、cm152、cm153、cm94、cm119、cm120、cm123、cm125。
[0244]
在一些实施方案中，所述arrna靶向的靶标rna选自：pre
‑
mrna、成熟mrna、核糖体rna、转运rna，长链非编码rna或小rna。在一些实施方案中，所述靶标rna是前信使rna。在一些实施方案中，所述靶标rna为idua基因的转录本序列。在一些实施方案中，所述靶标rna为 idua基因转录的pre
‑
mrna或成熟mrna。在一些实施方案中，所述靶标 rna为idua基因转录的pre
‑
mrna。在一些实施方案中，所述靶标rna 包含相当于赫勒氏综合征患者基因组中nm_000203.4(idua)
‑
c.1205g>a (p.trp402ter)的突变位点，且当所述arrna与所述靶标rna杂交时，所述 arrna的靶向核苷与所述靶标rna中的所述突变位点相对。此时，所述突变位点即为所述arrna的靶标核苷。在一些实施方案中，所述arrna可用于前述的rna编辑方法。
[0245]
在一些实施方案中，所述arrna包含选自以下的任一序列：
[0246]
1)gm*am*cm
‑
g*cm
‑
cm*cm
‑
a*cm
‑
cm*g
‑
um*g
‑
um*g
‑
g*um
‑
um *g
‑
cm*um
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
a*g
‑
g*a
‑
cm*g
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
cm*g
‑
g*cm
‑ꢀ
cm*um
‑
g*cm
‑
g*a
‑
cm*a
‑
cm*um
‑
um*cm
‑
g*g
‑
cm
‑
c
‑
c
‑
a*g
‑
a*g
‑
cm* um
‑
g*cm
‑
um*cm
‑
cm*um*cm*am(seq id no:31)
[0247]
2)gm*am*cm
‑
g*cm
‑
cm*cm
‑
a*
‑
cm
‑
cm*g
‑
um*g
‑
um*g
‑
g*um
‑
u m*g
‑
cm*um
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
a*g
‑
g*a
‑
cm*g
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
cm*g
‑
g*c m
‑
cm*um
‑
g*cm
‑
g*
‑
a
‑
cm*a
‑
cm*um
‑
um*cm
‑
g*g
‑
cm*cd
‑
cd*ad*
‑
g
‑
a* g
‑
cm*um
‑
g*cm
‑
um*cm
‑
cm*um*cm*am(seq id no:31)；
[0248]
3)gm*am*cm
‑
g*cm
‑
cm*cm
‑
a*cm
‑
cm*g
‑
um*g
‑
um*g
‑
g*um
‑
um *g
‑
cm*um
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
a*g
‑
g*a
‑
cm*
‑
g
‑
g*um
‑
cm*cm
‑
cm*g
‑
g*cm
‑ꢀ
cm*um
‑
g*
‑
cm
‑
g*a
‑
cm*a
‑
cm*um
‑
um*cm
‑
g*g
‑
cm
‑
cd
‑
cd*ad*g
‑
a*g
‑ꢀ
cm*um
‑
g*cm
‑
um*cm
‑
cm*um*cm*am(seq id no:31)；
[0249]
4)gmoe*amoe*cmoe*gmoe
‑
c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
c
‑
c
‑
g
‑
um
‑
g
‑
um
‑
g
‑
g
‑
um
‑
um
‑ꢀ
g
‑
c
‑
um
‑
g
‑
um
‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
g
‑
a
‑
c
‑
g
‑
g
‑
um
‑
c
‑
c
‑
c
‑
g
‑
g
‑
c
‑
c
‑
um
‑
gc
‑
g
‑
a
‑
c
‑
a
‑ꢀ
c
‑
um
‑
um
‑
c
‑
g
‑
g
‑
c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
a
‑
g
‑
c
‑
um
‑
g
‑
c
‑
um
‑
c*cmoe*umoe*cmoe*a moe(seq id no:31)；或
[0250]
5)g *a *c *g c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
c
‑
c
‑
g
‑
um
‑
g
‑
um
‑
g
‑
g
‑
um
‑
um
‑
g
‑
c
‑
um
‑
g
‑ꢀ
um
‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
g
‑
a
‑
c
‑
g
‑
g
‑
um
‑
c
‑
c
‑
c
‑
g
‑
g
‑
c
‑
c
‑
um
‑
gc
‑
g
‑
a
‑
c
‑
a
‑
c
‑
um
‑
um
‑ꢀ
c
‑
g
‑
g
‑
c
‑
c
‑
c
‑
a
‑
g
‑
a
‑
g
‑
c
‑
um
‑
g
‑
c
‑
um
‑
c*c *u *c *a (seq id no:3 1)。
[0251]
构建体、组合物、颗粒、细胞、文库或试剂盒
[0252]
本发明一方面还提供了一种包含前述所述arrna编码序列的构建体。在一些实施方案中，所述构建体是单链dna。在一些实施方案中，所述构建体是双链dna。在一些实施方案中，所述构建体是rna与dna的杂交分子。在一些实施方案中，所述构建体是双链rna。在一些实施方案中，所述构建体包含所述arrna的反义核酸序列。
[0253]
在一些实施方案中，所述构建体为环状。在一些实施方案中，所述构建体为线状。
[0254]
在一些实施方案中，所述构建体为质粒。在一些实施方案中，所述构建体包含病毒的全部或部分基因组。在一些实施方案中，所述病毒选自aav、慢病毒、噬菌体或杆状病毒。因此，本技术还提供了包含所述构建体的病毒。本技术一方面还提供了包含前述arrna或前述构建体的组合物、脂质体、外泌体、脂质
‑
纳米颗粒、细胞、文库或试剂盒。在一些实施方案中，所述组合物、脂质体、外泌体、脂质
‑
纳米颗粒、细胞、文库或试剂盒仅包含唯一一种前述arrna或包含所述arrna编码序列的构建体。在一些实施方案中，所述组合物、脂质体、外泌体、脂质
‑
纳米颗粒、细胞、文库或试剂盒包含两种或两种以上的前述arrna或包含所述arrna编码序列的构建体。
[0255]
在一些实施方案中，所述组合物为药物组合物，因此所述组合物还进一步包含一种或多种药学上可用的赋形剂。
[0256]
在一些实施方案中，所述细胞包含所述构建体，并且所述构建体位于细胞质中。在一些实施方案中，所述细胞包含所述构建体，并且所述构建体是基因组dna的一部分。
[0257]
预防或治疗赫勒氏综合征的方法
[0258]
本发明一方面还提供了一种用于治疗或预防赫勒氏综合征的方法，其包括向具有相当于nm_000203.4(idua)
‑
c.1205g>a(p.trp402ter)突变位点的赫勒氏综合征患者施用如前所述的arrna，或如前所述的构建体、脂质体、外泌体、脂质
‑
纳米颗粒或细胞，或通过如前所述的rna编辑方法对患者进行赫勒氏综合征相关症状的预防或者治疗。
[0259]
在一些实施方案中，所述施用选自静脉注射、皮下注射、动脉灌注、肌肉注射、单器官局部注射或颅内注射。在一些实施方案中，所述施用为单次施用，例如使包含所述arrna编码序列的细胞经单次输注进入患者体内，并使所述细胞在特定组织中定植。
[0260]
在一些实施方案中，所述施用为2次、3次或更多次施用。在一些实施方案中，每2次施用的间隔长于21天。在一些实施方案中，每两次施用的时间≥17天、≥14天、≥12天、≥11天或≥10天。在一些实施方案中，所述两次导入间隔为9
‑
20天、9
‑
16天、9
‑
14天、12
‑
19天、12
‑
15天、或12
‑
13 天。在一些实施方案中，所述两次导入间隔为7天、8天、11天、15天、18 天、19天、20天。
[0261]
在一些实施方案中，所述施用可使靶标组织中的arrna浓度维持在≥ 5nm，优选地≥10nm，进一步优选地≥20nm；在一些特定的实施方案中，所述施用可使靶标组织中的arrna浓度维持在5
‑
160nm，例如10
‑
160nm、 20
‑
160nm、40
‑
160nm、20
‑
80nm、40
‑
80nm或20
‑
40nm；在一些特定的实施方案中，所述施用可使靶标组织中的arrna浓度维持在15nm、17nm、19nm、 21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、28nm、29nm、30nm、 31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、41nm、 43nm、45nm、55nm、65nm、75nm、85nm、95nm、105nm、115nm、125nm、 135nm、145nm或155nm。
[0262]
下面结合具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的详述，但本发明并不限于以下实施例。如未特别指出，以下所涉及的试剂均可通过商业途径购得。为简便起见，部分操作未详述操作的参数、步骤及所使用的仪器，应当理解，这些都是本领域技术人员所熟知并可重复再现的。
[0263]
实施例
[0264]
本文中所使用的细胞gm06214和gm01323均购买于美国coriell公司。其中gm06214
是一株来源于赫勒氏综合征病人的成纤维细胞，其idua基因9号外显子1293位核苷酸由g突变为a，其所在密码子由tgg突变为 tag，([trp402ter(w402x)])(以上对细胞的说明来自产品说明书，其中所述突变相当于nm_000203.4(idua)
‑
c.1205g>a(p.trp402ter)突变)。而 gm01323是沙伊氏综合征(scheie syndrome)患者来源的纤维母细胞，其与健康人来源的纤维母细胞相比，idua活性在0.3％。相较于赫勒氏综合征，沙伊氏综合征症状相对较轻。因此，在以下实施例中将gm01323作为idua 酶活性的阳性对照，而将gm06214作为疾病模型及测试细胞。
[0265]
实施例一：检测gm06214突变基因型
[0266]
将gm06214细胞放入含有15％血清的成纤维细胞培养液(sciencell，fm 培养基，货号：2301)中，添加1％成纤维细胞生长添加物(sciencell，gfs，货号：2301)，在37℃、5％co2培养箱里培养2
‑
3天。待细胞融合度达到 90％时，用0.25％的胰酶消化，其后使用含有15％血清的成纤维细胞培养液终止消化。用(tiangen biotech(beijing)co.,ltd.)细胞dna提取试剂盒(货号：dp304
‑
03)根据操作说明进行dna提取。
[0267]
利用ncbi
‑
primer blast(网址： https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer
‑
blast/)进行idua靶标位点上下游序列的引物设计。seq id no 1：cgcttccaggtcaacaacac(正向引物hidua
‑
f1)；seq id no 2：ctcgcgtagatcagcaccg(反向引物 hidua
‑
r1)。进行pcr反应，pcr产物进行sanger测序。如图1所示，经验证，确定上述gm06214细胞的突变型是idua基因组上第15704位点g 变为a的致病型突变，即：c.1205g>a(p.trp402ter)突变。
[0268]
实施例二：gm06214细胞电转染arrna后idua酶活性和编辑效率检测
[0269]
针对idua基因转录后mrna前体(pre
‑
mrna)和成熟mrna靶标位点的上下游序列，设计合成以下arrna序列：
[0270]
针对pre
‑
mrna的靶向arrna：
[0271]
gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgac acuucggcccagagcugcuccucauccagcagcgccagcagccccau ggccgugagcaccggcuu(seq id no：3，pre
‑
55nt
‑
c
‑
55nt)；
[0272]
针对成熟mrna的靶向arrna：
[0273]
gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgac acuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccg ucgccgcguggggucguug(seq id no：4，m
‑
55nt
‑
c
‑
55nt)；
[0274]
随机设计的非靶向arrna：
[0275]
uaccgcuacagccacgcugauuucagcuauaccugcccgguauaaa gggacguucacaccgcgauguucucugcuggggaauugcgcgauau ucaggauuaaaagaagugc(seq id no：5，random
‑
111nt)
[0276]
其中，arrna中针对mrna前体(pre
‑
mrna)和成熟mrna的突变位点(靶标序列的靶标腺苷)的碱基为c，从而靶标腺苷和arrna中与靶标腺苷对应的碱基之间形成一个a
‑
c错配。合成的arrna长度选在111nt。合成的arrna以cm0(序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，并且前3个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰)方式进行化学修饰。使用下述步骤对细胞进行电转染：
[0277]
待gm06214细胞生长至约90％汇合度时消化细胞。终止消化后计数。电转染时，用400μl预混合电转溶液(lonza，货号：v4xp
‑
3024)重悬600 万个细胞，再加20μg的arrna，混匀后，取每20μl为一个电转染体系，用lonza nucleofector电转染仪预设电转染条件进行
[0286][0287]
表3.pcr条件
[0288][0289][0290]
酶活性检测：
[0291]
将gm06214细胞消化后离心，用28μl含0.1％triton x
‑
100的1
×
pbs 重新悬浮，在冰上裂解30分钟。然后将25μl的细胞裂解液添加到25μl含 190μm 4
‑
甲基伞形酮
‑
α
‑
l
‑
异丁烯酸酶 (4
‑
methylumbelliferyl
‑
α
‑
l
‑
iduronidase)的底物中(cayman,2a
‑
19543
‑
500，溶解于0.4m甲酸钠缓冲液中，含有0.2％triton x
‑
100，ph3.5)。在暗处， 37℃孵育90分钟。加入200μl ph＝10.3的0.5m naoh/甘氨酸溶液(北京化工，naoh，货号：ar500g；索莱宝，glycine货号:g8200)灭活催化反应。在4℃离心2分钟。将上清液转移到96孔板上，用365nm和450nm激发波长在infinite m200仪器(tecan)上测量荧光值。
[0292]
本实施例的结果如图2所示，当arrna靶向pre
‑
mrna时能够表现出较高的酶活性和编辑效率，而靶向成熟mrna的arrna表现出明显低的酶活性和编辑效率。因此在后面的实施例中所涉及到的arrna均为靶向pre
‑
mrna的arrna。
[0293]
实施例三：在idua
‑
报告子细胞系上电转染arrna后idua靶位点编辑效率的检测
[0294]
如图3a所示，在慢病毒质粒上表达mcherry和gfp蛋白的序列之间插入了一段包含人(nm_000203.4(idua)
‑
c.1205g>a (p.trp402ter))(idua)_c.1239g>a(p.trp402ter)突变位点及上下游各100bp 左右的idua基因转录本序列，构建质粒。将上述构建后的质粒包装成病毒，感染293t细胞，待其整合进基因组后，筛选出idua
‑
报告子单克隆细胞。这个单克隆细胞因为受到插入序列中idua靶标腺苷所在的tag终止密码子的影响，只表达mcherry蛋
白，而当细胞被arrna编辑后由tag转变为 tgg，于是其后的gfp蛋白便能够正常表达。gfp蛋白的阳性细胞比率可以反映arrna编辑细胞的编辑效率。我们优选设计了从51nt
‑
111nt不同长度的4条(25nt
‑
c
‑
25nt、35nt
‑
c
‑
35nt、45nt
‑
c
‑
45nt、55nt
‑
c
‑
55nt)arrna，以及4 条非靶向随机对照arrna(111nt
‑
random、91nt
‑
random、71nt
‑
random和 51nt
‑
random)。每条arrna以cm0方式进行化学修饰。本实施例中使用的 arrna序列如下表4所示。
[0295]
细胞以实施例二中的电转染条件分别转染不同arrna后，分别在第1 至第7天检测gfp阳性细胞比率，对编辑效率进行初步比较。从图3b中可以看出，编辑的最高峰出现在第2天(48h)。编辑效率最高的序列是总长91nt 的45nt
‑
c
‑
45nt，总长51nt的arrna编辑效率非常低。由此可见，arrna的长度不能太短，但也并不是序列越长编辑效率越高。
[0296]
表4：
[0297]
[0298][0299]
实施例四：不同长度的arrna电转染gm06214细胞后，检测不同时间点的rna编辑效率
[0300]
利用实施例二中的电转染条件向gm06214细胞电转染不同长度的 arrna(参见表4，每条arrna以cm0方式进行化学修饰)，以实施例三中的方法，分别在电转染后第2，4，6，8，10，12，14天检测了细胞内的酶活性，以及第2和第4天细胞内rna靶标位点a到g的突变率。结果如图 4a及4b所示，arrna为91nt时(45
‑
c
‑
45)酶活性最高，在电转染后第6 天idua酶活性仍然维持在高水平。从a到g突变率来看，111nt和91nt 呈现了大致相同的编辑效率。而51nt的arrna始终无法达到一个理想的编辑效率。
[0301]
实施例五：arrna优化
[0302]
通过文献调研，我们认为电转染的方式不能完全满足将来疾病治疗的目的。因此我们测试了脂质体转染的方法。例如在本实施例中，我们使用 lipofectaminernaimax(invitrogen 13778
‑
150)转染arrna。首先我们通过将序列在111nt的基础上从两端同时截短以设计新的arrna，之后扩展到固定一端而从另一端截短。通过这种设计方法，产生了14条arrna序列。同时还设计了4条随机序列(random)作为对照。本实施例中所用arrna序列如下表5所示。每条arrna均以cm0方式进行化学修饰。通过测试转染后48小时idua的酶活性(方法同实施例三)，发现当arrna长度等于或超过111nt时，编辑效率会出现下滑，并且，在arrna等长的情况下，靶向核苷c两端的序列长短不一致时往往可以取得更高的编辑效率，且当5’长度大于3’长度时，编辑效率往往更高(图5)。其中，优选地arrna的3’端长度大于5nt，且在5nt
‑
45nt的范围内达到编辑效率的最高值；而5’端优选地大于25nt，且在超过35nt之后编辑效率显著升高。值得一提的是，61nt，51nt 这种总长度较短的arrna的酶活性始终不高。
[0303]
此外，在本实施例测试的arrna中，经101nt的45nt
‑
c
‑
55nt(seq id no: 17)、91nt的55nt
‑
c
‑
35nt(seq id no:13)、81nt的55nt
‑
c
‑
25nt(seq id no: 24)和71nt的55nt
‑
c
‑
15nt(seq id no:25)编辑的细胞具有更好的idua 酶活性。
[0304]
表5：
[0305]
[0306][0307]
[0308]
实施例六：筛选出编辑位点距离3’端的最优长度
[0309]
idua基因rna中，在靶标位点附近包含多个连续的c。因此在设计与靶标rna序列互补的arrna时，与所述多个连续的c相对应的则是多个g。多个g构成的poly g在目前化学合成技术水平下，合成较为困难，因此应尽量避免。由于所述多个g位于靶向核苷3’端方向上距离靶标位点20nt 处(4个连续的g)，和25nt处(9个连续的g)。因此，在后续的实施例中，我们均尽量使设计的arrna3’端小于25nt，以尽量避免poly g结构，优选的 3’端小于20nt。
[0310]
由于实施例六中，我们在81nt:55
‑
c
‑
25、71nt:55
‑
c
‑
15序列上检测到了较高的idua酶活性和a到g的突变率，体现出其相对较高的编辑效率。为找到更短且更优的3’端的长度，对3’端从距离编辑位点的25nt开始 (81nt:55
‑
c
‑
25)到10nt(66nt：55nt
‑
c
‑
10nt)的序列进行了设计和检测。arrna 序列如表6所示。每条arrna以cm0方式进行化学修饰。用 lipofectaminernaimax转染gm06214细胞，转染前一天接种于6孔板中，每孔接种3*105个细胞，转染当天细胞换新鲜培养液。用20nm的浓度的 arrna转染细胞。转染后48小时收细胞进行酶活性检测。
[0311]
酶活性检测方法如下：将gm06214细胞消化后离心，用33μl含0.1％ triton x
‑
100的1
×
pbs重新悬浮。在冰上裂解30分钟后，4℃离心2分钟。然后将25μl的细胞裂解液添加到25μl含190μm4
‑
甲基伞形酮
‑
α
‑
l
‑
异丁烯酸酶(4
‑
methylumbelliferyl
‑
α
‑
l
‑
iduronidase)的底物中(glycosynth,44076)。该底物溶解于含有0.4m甲酸钠及0.2％triton x
‑
100，ph3.5的缓冲液。在暗处，于37℃孵育30分钟。之后加入200μl，ph10.3的0.5m naoh/甘氨酸溶液(北京化工，naoh，货号：ar500g；索莱宝，glycine货号:g8200)，灭活催化反应。使用infinite m200仪器(tecan)进行荧光值测量。激发光使用365nm和450nm波长。取细胞裂解液测蛋白浓度。
[0312]
如图6a所示，通过idua酶活测定(结果显示为：相对于gm01323细胞中idua酶活性的倍数)，可见靶向核苷距离3’端为25nt
‑
10nt的arrna均可取得较为理想的编辑效率。为进一步缩短3’长度，我们重新合成了一个批次的arrna，其序列编辑位点距离3`端的长度为16nt
‑
5nt arrna。idua酶活结果如图6b所示。2次实验结果中相同arrna序列转染gm06214细胞 48小时后，得到的酶活性结果基本一致。除此之外，具有7nt
‑
10nt的3’端长度的arrna也展现出较为理想的编辑效率，而其中具有9nt
‑
10nt的3’端长度的arrna效果更佳。从图6b的结果中还可以看出，总长度低于61nt的 arrna编辑效果始终不够理想。
[0313]
结合实施例6的数据，并综合图6a和6b的结果，可知arrna 3’端长度最好控制在9nt
‑
25nt的范围内。且arrna的总长度不宜低于61nt。
[0314]
表6：
[0315]
[0316]
[0317][0318]
实施例七：在优选的3’端长度固定的条件下，筛选出最优5’端长度
[0319]
我们选取了2个不同长度的arrna：76nt:55
‑
c
‑
20、71nt:55
‑
c
‑
15，在3’端长度固定不变的基础上，5’端逐渐截短，如表7所示。每条arrna以cm0 方式进行化学修饰。用lipofectamine rnaimax转染gm06214细胞后，通过实验测定idua酶活性。结果如图7所示，当arrna总长度低于61nt 时,其编辑效率大幅降低。而在总长度大于61nt的情况下，在3’端为15nt或20nt时，当5’端长度大于40nt，arrna编辑后细胞的idua酶活性显著升高。如图7所示。
[0320]
表7：
[0321][0322][0323]
实施例八：靶向核苷位置移动对靶标位点编辑效率影响的研究
[0324]
从前述实施例中优选了3个长度的arrna进行靶向核苷位置移动对靶标位点编辑效率影响的研究。通过将靶向核苷从中心位置往3`端逐渐移动，同时考虑arrna合成的需要避开一些不利于合成的结构，设计出一系列arrna序列。arrna如表8所示。每条arrna以cm0方式进行化学修饰。用lipofectaminernaimax转染gm06214细胞后48hrs收取样品进行酶活测定(酶活测定方法同实施例七，结果显示为相对于gm01323中idua酶活性倍数)。实验结果如图8所示，当在67nt、70nt、72ntarrna上移动靶向核苷位置时，在总长度保持不变，且5’端
长度在43nt
‑
55nt，3’端长度在9nt
‑
25 nt的情况下，靶向核苷位置的移动对酶活不具有显著影响。即：本实施例证明了在前述优选的arrna长度，5’长度，及3’长度的范围内，每一条arrna均能取得较为优秀的编辑效率。
[0325]
表8：
[0326]
[0327]
[0328][0329]
实施例九：arrna化学修饰对编辑效率的影响
[0330]
首先，我们在三种长度的arrna(55
‑
c
‑
16(seq id no:30)、55
‑
c
‑
14 (seq id no:31)和55
‑
c
‑
11(seq id no:34)中，比较了cm1与cm0 修饰对arrna编辑效率的影响。所述cm1修饰方式如下所示：
[0331]
cm1：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；并且序列中全部u均经2
’‑
o
‑ꢀ
甲基化修饰。
[0332]
结果如图9a所示，cm1修饰的arrna编辑效率普遍优于cm0修饰的 arrna。
[0333]
随后，我们又选取了2个优选长度的arrna：71nt、76nt，’研究了不同修饰方式的组合对编辑效率的影响。具体修饰方式如下所示，具体序列及修饰标注如表9所示。
[0334]
cm2：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰；同时靶向核苷的3’最近邻核苷经 2
’‑
o
‑
甲基化修饰；
[0335]
cm3：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰；同时靶向核苷的5’最近邻核苷经 2
’‑
o
‑
甲基化修饰；
[0336]
cm4：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前3个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；并且靶向三联体中的三个碱基与各自的3’最近邻核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；
[0337]
cm5：除靶向核苷及与5’端与其邻近的5个碱基以及3’端与其最邻近的 5个碱基之外，所有核苷酸均被2`
‑
ome修饰；同时序列前3个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修
饰。
[0338]
cm6：序列前5个和后5个核苷酸分别被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，并且前5 个和后5个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰；
[0339]
使用lipofectamine rnaimax将不同arrna分别转染进入gm06214 细胞中对idua mrna进行编辑。收集转染后48小时的细胞进行idua酶活性测定(酶活测定方法同实施例七，结果显示为相对于gm01323中酶活性的倍数)，从如图9b所示的实验结果来看，除cm5以外，其余几种修饰组合与cm1修饰相比，编辑效率尚佳。
[0340]
idua酶活性测定可以从蛋白质层面比较不同长度arrna恢复idua蛋白功能的能力。为了能够从rna层面上快速探究arrna的编辑能力，本实施例中还使用了酶切的方法对arrna的编辑效率进行检测。具体方法如下： idua mrna点突变附近位点正常序列包含一个ctgg，经突变后成为 ctag。其中ctag四个碱基是限制性内切酶bfai的酶切位点，所以如果转入的arrna在细胞内实施了靶标位点a到g的编辑，限制性内切酶bfai 的酶切位点ctag就会转变为ctgg，从而bfai的酶切将不再发生。细胞转染arrna的48小时后，提取细胞基因组并反转录。利用引物hidua
‑
62f： ccttcctgagctaccacccg(seq id no:78)和hidua
‑
62r： ccagggctcgaactcggtag(seq id no:79)对样品进行pcr。pcr 产物纯化回收后进行酶切。酶切后产物用2％的琼脂糖进行凝胶电泳，通过计算胶图上未被切开的片段占总体灰度值的百分比计算编辑效率。如图9c 所示，编辑效率结果呈现出跟arrna酶活性结果一致的趋势。
[0341]
表9：
[0342]
[0343]
[0344][0345]
注：“m”指核苷酸核糖上的2'
‑
o
‑
me，“*”是指硫代磷酸酯修饰。
[0346]
实施例十：对cm1修饰的55nt
‑
c
‑
16nt,55nt
‑
c
‑
14nt,55nt
‑
c
‑
11nt进行浓度梯度实验
[0347]
为探究arrna在不同浓度下的编辑能力，本实施例选取了cm1修饰的 55nt
‑
c
‑
16nt,55nt
‑
c
‑
14nt,55nt
‑
c
‑
11nt进行测试。取160nm，80nm，40nm，2 0nm，10nm，5nm，2.5nm，1.25nm，0.625nm共9个不同的稀释浓度的a rrna，使用lipofectamine rnaimax转染gm06214细胞。转染后48小时，对细胞进行酶活性检测，并使用二代测序的方法进行基因编辑效率的检测。如图10a所示，3条arrna在酶活性结果上整体趋势基本一致，55nt
‑
c
‑
16nt
ꢀ‑
cm1在转染浓度大于10nm的情况下酶活性高于其他2条arrna。但酶活性的拐点浓度均在20nm
‑
5nm之间。低于5nm时，编辑效率已不够理想。二代测序检测的编辑效率的结果趋势整体跟酶活性趋于一致，如图10b所示。由此可见，使用脂质体转染arrna的浓度最好大于等于5nm，优选地大于等于10nm，更优选地大于等于20nm。
[0348]
实施例十一：通过arrna编辑后idua可持续保持蛋白酶活性
[0349]
本实验通过使用靶向人idua靶标位点的3个优选arrna并对其进行 cm1方式的化学修饰，在gm06214细胞上获得显著提高的idua酶活性，并且可持续约3周以上。
[0350]
我们选取20nm的浓度在不同时间通过idua酶活性和编辑效率进行比较。如图11a所示，arrna转染gm06214细胞后我们连续检测了14天的 idua酶活性。结果显示，转染后酶活的高峰为第4天到第10天，并主要集中于第4天到第9天。并且第14天的酶活性仍高于第2
天，随后我们又在第17天和21天检测了酶活性，从12a图上可以看到第21天的酶活仍高于转染后第1天，酶活约为gm01323的6到10倍。图11b中显示了idua靶标位点的编辑效率，从图中可以看出arrna转染后编辑效率由高到低，最高峰位于转染后第1天，为约为70％的编辑，直到转染后第10天编辑效率方与对照组持平。
[0351]
因此容易推测，如果在第10
‑
14天进行第二次转染，将可以使idua酶活性始终维持在高于首次转染第二天时的水平。而如果在第17至21天时进行第二次转染，则可使idua酶的活性至少高于gm01323中酶的活性，使细胞的idua酶活性保持在一个相对正常的状态。
[0352]
实施例十二：arrna在人原代肝脏细胞上对idua(c.1205
‑
5bp)野生位点进行体外编辑
[0353]
本实验涉及在原代培养的人肝脏细胞上利用leaper技术对野生型的 idua基因位点进行编辑。本实施例中将所述cag中的a作为靶标进行编辑，以测试本技术的方法在肝脏细胞中对idua的编辑效率，arrna的序列见表10。
[0354]
人肝脏原代细胞购买于lonza(货号：hucpi)，细胞按照厂家说明书复苏培养(复苏培养基货号：mcht50；铺板培养基货号：mp100)。细胞贴壁后更换为肝细胞维持培养基5c(参考文献：xiang c,du y,meng g,etal.long
‑
term functional maintenance of primary human hepatocytes in vitro[j]. science,2019,364(6438)：399
‑
402)。
[0355]
人的肝脏细胞贴壁培养24小时后，用lipofectmine rnaimax转染 arrna。其中arrna的转染浓度分别为20nm和40nm。转染后分别于0小时，12小时，24小时，48小时和72小时收取样品，收取样品后利用二代测序对样品进行编辑效率检测，如图12所示，arrna转染后idua的编辑效率最高可以达40％。证明使用本技术中的方法在人体肝脏细胞中编辑idua 转录本的靶标腺苷的可行性和有效性。
[0356]
表10：
[0357][0358]
实施例十三：化学修饰方式与长度的组合比较
[0359]
本实施例通过在gm06214细胞上对c.1239g>a(p.trp402ter)突变位点的编辑，比较了本技术中的方法与现有技术中的优选方法。进一步显示出本技术所述方法的优势。
[0360]
序列及修饰方式如表11所示。其中本技术所述方法的代表序列为55nt
‑ꢀ
c
‑
15nt
‑
cm1，选自现有技术(cn110352244a)的阳性对照序列为36nt
‑
c
‑
13 nt
‑
cm11。其中36nt
‑
c
‑
13nt
‑
cm11除编辑位点“cca”外，所有核苷酸均被 2'
‑
o
‑
me修饰，并且其首尾各4个核苷酸间连接被硫代磷酸化。此外，本实施例中还取本技术中经cm0修饰的序列(55nt
‑
c
‑
15nt)及cm0修饰的随机序列(random
‑
70)进行了对照。
[0361]
本实施例使用lipofectaminernaimax将arrna转染至gm06214细胞后48小时，使用
实施例七所示的方法检测idua酶活性。结果如图13所示。可以看出55nt
‑
c
‑
15nt
‑
cm1具有比36nt
‑
c
‑
13nt
‑
cm11显著更高的编辑效率。
[0362]
表11：
[0363][0364]
注：“m”指核苷酸核糖上的2
’‑
o
‑
me修饰，“*”是指硫代磷酸酯修饰。
[0365]
实施例十四：末端修饰对arrna编辑效率的影响
[0366]
本实施例在cm1的基础上，对arrna两端进行了不同数量的2’moe 和lna修饰，并与cm1修饰进行了比较。其中2’moe指2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰。
[0367]
如表12所示，序列55nt
‑
c
‑
20nt(seq id no:26)分别经过cm1，cm148， cm149，cm150，cm151，cm152和cm153修饰后，用于本实施例的测试。本实施例中使用lipofectaminernaimax将arrna转染至idua报告子细胞，转染浓度为20nm。并分别在48(第2天)和168(第7天)小时后，用流式细胞仪测定荧光强度。结果如图14所示。可见，cm151具有显著更高的编辑效率，其次是cm148。并且，cm148、
[0368]
cm149、cm150、cm151、cm152、cm153均优于cm1的修饰方法。
[0369]
本实施例中使用的具体修饰方法(除cm1如前所述)如下所示：
[0370]
cm148：序列前4个和后4个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰，前 3个和后4个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有u均经2
’‑
o
‑
me 修饰；
[0371]
cm149：序列前3个和后3个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰，前 2个和后3个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有u均经2
’‑
o
‑
me 修饰；
[0372]
cm150：序列前2个和后2个核苷酸分别经2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰，第 1个和后2个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有u均经2
’‑
o
‑
me 修饰；
[0373]
cm151：序列前4个和后4个核苷酸分别经lna修饰，前3个和后4 个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有尿苷均经2
’‑
o
‑
me修饰；
[0374]
cm152：序列前3个和后3个核苷酸分别经lna修饰，前2个和后3 个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有尿苷均经2
’‑
o
‑
me修饰；
[0375]
cm153：序列前2个和后2个核苷酸分别经lna修饰，前2个和后3 个核苷酸间连接分别经硫代磷酸酯修饰，且所有尿苷均经2
’‑
o
‑
me修饰。
[0376]
表12：
[0377]
[0378][0379]
注：“m”指核苷酸核糖上的2'
‑
o
‑
me修饰；“*”是指硫代磷酸酯修饰；“ ”指锁核酸(lna)修饰；“moe”指2
’‑
o
‑
(2
‑
甲氧乙基)修饰。
[0380]
实施例十五：硫代、二甲氧、及脱氧核糖核苷替代组合修饰对arrna编辑效率的影响
[0381]
本实施例尝试在arrna上增加更多的硫代磷酸酯及2
’‑
o
‑
me修饰，并引入脱氧核糖核苷替代。
[0382]
具体序列修饰如下所述：
[0383]
cm71:序列前3个和后3个核苷酸分别被2`
‑
ome修饰，同时序列中全部u和除靶向三
联体以外的全部c均被2`
‑
ome修饰，且前3个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰。
[0384]
cm94:序列前3个和后3个核苷酸、序列中的全部u和除靶向三联体以外的全部c均被2
’‑
o
‑
甲基化修饰，前4个和后3个核苷酸间连接均为硫代磷酸酯修饰，且从5’末端第4个核苷酸间连接至3’末端第3个核苷酸间连接中除靶向三联体中各核苷酸5’最近邻核苷酸间连接不做硫代磷酸酯修饰以外，每隔一个核苷酸间连接经硫代磷酸酯修饰；
[0385]
cm104:序列前3个和后3个核苷酸分别被2`
‑
o
‑
甲基化修饰，同时序列中全部u和除靶向三联体以外的全部c均被2`
‑
o
‑
甲基化修饰，除靶向三联体中各核苷酸5’最近邻的核苷酸间连接不做硫代磷酸酯修饰以外，所有核苷酸间连接均经硫代磷酸酯修饰。
[0386]
cm105:除包含cm104中所有修饰以外，靶向核苷酸c做脱氧核糖核苷替代修饰。
[0387]
cm106:除包含cm104中所有修饰以外，靶向三联体中的各个核苷酸均做脱氧核糖核苷替代修饰。
[0388]
cm107:除包含cm94中所有修饰以外，靶向核苷酸c做脱氧核糖核苷替代修饰。
[0389]
cm108:除包含cm94中所有修饰以外，靶向三联体中的各个核苷酸均做脱氧核糖核苷替代修饰。
[0390]
cm114:除包含cm94中所有修饰以外，靶向三联体中各核苷酸5’最近邻核苷酸间连接也经硫代磷酸酯修饰。
[0391]
cm115:除包含cm94中所有修饰以外，靶向三联体中各核苷酸3’最近邻核苷酸间连接也均经硫代磷酸酯修饰。
[0392]
cm116:除包含cm94中所有修饰以外，靶向核苷酸的5’最近邻核苷酸的5’最近邻核苷酸间连接也经硫代磷酸酯修饰。
[0393]
cm117:除包含cm94中所有修饰以外，靶向核苷酸的3’最近邻核苷酸间连接也经硫代磷酸酯修饰。
[0394]
cm118:除包含cm115中所有修饰以外，靶向核苷酸c做脱氧核糖核苷替代修饰。
[0395]
cm119:除靶向核苷酸c的5’端核苷酸间连接不做硫代磷酸酯修饰外，其他修饰同cm118.
[0396]
cm120:除包含cm116中所有修饰以外，靶向核苷酸c做脱氧核糖核苷替代修饰。
[0397]
cm121:除包含cm117中所有修饰以外，靶向核苷酸c做脱氧核糖核苷替代修饰。
[0398]
cm122:除包含cm114中所有修饰以外，靶向三联体核苷酸均做脱氧核糖核苷替代修饰。
[0399]
cm123:靶向三联体核苷酸均做脱氧核糖核苷替代修饰，其他修饰同 cm119。
[0400]
cm124:除包含cm116中所有修饰以外，靶向三联体核苷酸均做脱氧核糖核苷替代修饰。
[0401]
cm125:除包含cm117中所有修饰以外，靶向三联体核苷酸均做脱氧核糖核苷替代修饰。
[0402]
本实施例使用的序列55nt
‑
c
‑
20nt(seq id no:26)及修饰标注如表13 所示。本实施例使用lipofectaminernaimax将arrna转染至idua reporter 细胞，转染浓度为20nm。并分别在72、120和168小时后，用流式细胞仪测定荧光强度。结果如图15所示，cm94，cm123和cm125具有显著更高的编辑效率，此外cm119和cm120相对于cm1较为稳定，可以在更长的时间里保持较高的编辑效率。
[0403]
表13
[0404][0405]
[0406]
[0407]
[0408][0409][0410]“m”指核苷酸核糖上的2'
‑
o
‑
methylation；“*”是指硫代磷酸酯修饰；“d”指脱氧核
糖核苷替代。