抑制核盘菌的miRNA及其应用的制作方法

抑制核盘菌的mirna及其应用
技术领域
1.本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及一个抑制核盘菌的mirna及其应用。


背景技术：

2.核盘菌(sclerotinia sclerotiorum(lib.)de bary)是一种典型的死体营养型、寄主范围广泛的丝状植物病原真菌，分布范围覆盖95个国家及地区，可侵染600多种植物，其中包括一些重要农作物，如大豆，油菜，向日葵，芸薹属蔬菜等。在适宜条件下，核盘菌可迅速侵染寄主植物产生菌核病。植物对核盘菌的抗性体现为基础抗性，目前为止仍未找到核盘菌的致病基因及植物中对应的抗病基因，因此寄主植物的抗菌核病育种进展缓慢。目前生产上主要通过一些农业措施和化学药剂来防治菌核病，但效果不稳定，并且存在环境污染及抗药性等问题。开展可抑制核盘菌的生物小分子物质研究，进而指导寄主植物的生产实践，对实现植物的安全稳产有重要意义。
3.植物非寄主抗性是自然界广泛存在的抗病系统，具有持久性和广谱性，对作物抗病育种有重要的应用价值。对于核盘菌而言，水稻是其非寄主植物之一。根据对水稻与油菜接种核盘菌前和接种后的小rna测序(srna
‑
seq)及转录组测序(rna
‑
seq)联合分析，鉴定到1个水稻特异的、响应核盘菌诱导的mirna，该mirna可靶向核盘菌基因。根据其成熟mirna序列特征，将其归属于mir169家族，是该家族一个新成员，本发明将其编号为os
‑
mir169y。mir169基因家族是植物界所发现的较大的mirna基因家族，多数成员具有调控植物生长发育及对逆境产生响应的功能。然而os
‑
mir169y是一个新成员，其功能及靶基因并未有任何报道。本发明对该os
‑
mir169y进行抑菌功能研究，并开发其用于寄主植物的抗性提高的途径，可为寄主植物的菌核病抗性改良提供基础。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供os
‑
mir169y成熟mirna及其应用。
5.首先，本发明提供os
‑
mir169y，其为成熟mirna，序列如seq id no.1所示。
6.本发明还提供编码所述的os
‑
mir169y的前体，其核苷酸序列如seq id no.2所示。
7.本发明还提供含有所述os
‑
mir169y的过表达载体，宿主细胞和工程菌。
8.本发明还提供所述os
‑
mir169y靶向核盘菌基因并抑制核盘菌的用途。
9.本发明还提供所述os
‑
mir169y在调控寄主植物菌核病抗性中的用途。
10.本发明从水稻中鉴定到了1个与核盘菌抗性相关的os
‑
mir169y，经双荧光素酶报告系统检测，os
‑
mir169y可靶向核盘菌ssrpl19基因，利用基因工程手段构建了os
‑
mir169y的核盘菌过表达载体，将其转入野生型核盘菌中超量表达，能抑制核盘菌的菌丝生长，降低致病力，延缓菌核形成时间。利用基因工程手段构建了os
‑
mir169y的植物过表达载体，将其转入野生型拟南芥中超量表达，能有效提高拟南芥菌核病抗性。
11.本发明为核盘菌寄主植物的抗性改良提供了很好的应用前景。
附图说明
12.图1是os
‑
mir169y与靶基因ssrpl19碱基结合情况预测结果。
13.图2是双荧光素酶活检测os
‑
mir169y与ssprl19互作的结果。四组数据依次为：mir169y空载菌液 pgrdl_spb菌液，mir169y空载菌液 pgrdl_spb_169菌液，35s
‑
mir169y菌液 pgrdl_spb_169菌液，35s
‑
mir169y菌液 pgrdl
‑
spb菌液。**表示p<0.01。
14.图3是os
‑
mir169y同源基因在物种间的系统发育分析。os
‑
mir169y成熟序列与其近缘物种及其他植物的序列相比，序列差异明显，表明了该序列的特异性。实心圆表示预测到mirna与ssprl19存在靶向关系。物种拉丁名缩写：aly
‑
arabidopsis lyrata；ath
‑
arabidopsis thaliana；aof
‑
asparagus officinalis；bdi
‑
brachypodium distachyon；bju
‑
brassica juncea；bra
‑
brassica rapa；can
‑
capsicum annuum；ccl
‑
citrus clementina；cmo
‑
cucurbita moschata；csi
‑
citrus sinensis；esa
‑
eutrema salsugineum；fan
‑
fragaria ananassa；fex
‑
fraxinus excelsior；fsy
‑
fagus sylvatica；ghi
‑
gossypium hirsutum；hbr
‑
hevea brasiliensis；hsy
‑
hibiscus syriacus；mac
‑
musa acuminata；nbe
‑
nicotiana benthamiana；ogl
‑
oryza glaberrima；oni
‑
oryza nivara；oru
‑
oryza rufipogon；osa
‑
oryza sativa；pda
‑
phoenix dactylifera；peu
‑
populus euphratica；ptr
‑
populus trichocarpa；qro
‑
quercus robur；sit
‑
setaria italica；sla
‑
silene latifolia；sly
‑
solanum lycopersicum；spe
‑
solanum pennellii；spi
‑
solanum pimpinellifolium；stu
‑
solanum tuberosum；tae
‑
triticum aestivum；zma
‑
zea mays。
15.图4是os
‑
mir169y在核盘菌中超量表达的载体pef1
‑
os
‑
mir169y菌检结果。不同泳道代表不同的单克隆，扩增片段为402bp的单克隆即为os
‑
mir169y的过表达载体pef1
‑
os
‑
mir169y。
16.图5是核盘菌os
‑
mir169y过表达转化子的pcr和荧光定量pcr鉴定结果。pcr鉴定共筛选出7个402bp条带的阳性转化子(a图)，所有转化子的os
‑
mir169y表达量均高于野生型菌株(b图)。
17.图6是os
‑
mir169y过表达的转基因核盘菌表型。os
‑
mir169y过表达的2个转基因菌株ef1
‑
mir169y
‑
1和ef1
‑
mir169y
‑
1，其菌丝生长速度显著低于wt(a图)，培养10天后仍无菌核形成(b图)，培养25天可产生菌核(c图)，接种油菜叶片菌斑面积小于wt(d图)，接种油菜茎秆的菌斑长度显著小于wt(e图)，表明os
‑
mir169y过表达的转基因核盘菌，其菌丝生长速度和致病力显著下降、菌核形成延缓。
18.图7是os
‑
mir169y在拟南芥中超量表达的载体pbinglyred3
‑
os
‑
mir169y菌检结果。不同泳道代表不同的单克隆，扩增片段为222bp的单克隆即为os
‑
mir169y的过表达载体pbinglyred3
‑
os
‑
mir169y。
19.图8拟南芥os
‑
mir169y超量表达株系的pcr和荧光定量pcr鉴定结果。pcr鉴定共筛选出4个222bp条带的阳性转化子(a图)，其中2个纯合株系的os
‑
mir169y表达量均高于野生型拟南芥col
‑
0和转入空载(ev)的拟南芥(b图)。
20.图9是超量表达os
‑
mir169y拟南芥的菌核病抗性鉴定结果。接种24h后转基因拟南芥叶片上菌斑表现比野生型wt小(a图)，测定后超量表达os
‑
mir169y的拟南芥平均菌斑面积显著小于野生型wt(b图)，**表示p<0.01。
具体实施方式
21.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrook j&russell dw,molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
22.实施例1 os
‑
mir169y与核盘菌ssrpl19基因的靶向关系验证
23.靶基因预测
24.使用patmatch_v1.2软件来进行小rna和靶基因的互补配对，再通过程序筛选预测得到最终结果，其筛选的条件需同时满足：小rna与靶基因的靶向互补关系中，最多可允许出现4个错配(g
‑
u配对算0.5个错配)；不允许发生连续的错配；小rna的5'端(2～12的位置中)不允许碱基错配；小rna/target的10～11的位置，不允许碱基错配；小rna/target的mirna 5'端1～12位最多允许2.5个错配；小rna/target的mfe(最小自由能)必须大于或等于mirna与靶基因完美结合mfe的60％(图1)。
25.双荧光报告系统载体构建
26.以pgrdl_spb质粒为模板，以t
‑
f/169
‑
l19r、169
‑
l19f/t
‑
r为引物(引物序列t
‑
f:5'
‑
cgccggtgaacttcccgccg
‑
3'，t
‑
r:5'
‑
ctggattttggttttaggaat
‑
3'，169
‑
l19f:5'
‑
gtcgacccaagccaagaaggctgccctgcagtcgccatgcgg
‑
3'，169
‑
l19r:5
’‑
ggcagccttcttggcttgggtcgacaaggaattcttacacgg
‑3’
)，分别扩增位于luc基因下游的两个片段，将克隆所得的片段分别命名为片段1、片段2，替换的靶位点序列包含在169
‑
l19f/169
‑
l19r中。扩增出的片段1、片段2胶回收后，按照摩尔比1：1进行混合，以混合物为模板，t
‑
f/t
‑
r为引物进行融合pcr，反应体系为：2μl片段1，2μl片段2，25μl 2
×
taq mix，2μl t
‑
f(10μm)，2μl t
‑
r(10μm)，17μl dd h2o，反应程序为94℃，5min；94℃，30s；60℃，30s；72℃，1min；30个循环，72℃，5min；16℃，10min。将融合pcr所得产物胶回收，连接t载体。连接产物转化大肠杆菌后，挑取单克隆用t
‑
f/t
‑
r为引物进行菌检并测序，测序比对结果正确的菌液提取质粒后，sal i/spe i双酶切获得含有靶位点的目的片段，同时sal i/spe i双酶切pgrdl_spb质粒获得线性化的载体骨架，将上述载体和目的片段通过t4 dna连接酶连接，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取适当数量的单克隆进行菌检，用于菌检的引物为：t
‑
f/t
‑
r。
27.转化农杆菌感受态
28.挑选一个菌检正确的菌液提取质粒，将该质粒命名为pgrdl_spb_169，所提质粒转化农杆菌感受态细胞。步骤如下：取
‑
80℃保存的gv3101(psoup)农杆菌感受态细胞于冰水浴中融化；无菌条件下，向感受态细胞中加入100ng～1μg质粒dna轻轻混匀，冰水浴中静置5min；将离心管置于液氮中速冻5min；然后快速将离心管置于37℃水浴中保持5min，此过程勿晃动水面；将离心管放回冰水浴中，冰浴5min；无菌条件下加入800μl无抗生素lb液体培养基，于28℃摇床振荡培养2～3小时；5000rpm离心5min收菌体，留100μl左右上清，轻轻吹打重悬菌体，取适量菌液，涂布于相应抗生素的lb平板上，于28℃培养箱中倒置培养过夜。
29.烟草瞬时共表达
30.将带有重组质粒的农杆菌在lb液体培养基中(含kan/rif)28℃，200rpm过夜培养；将培养好的农杆菌液转入50ml无菌离心管中，低温高速离心机4℃，4000rpm离心10min，弃上清；向离心管中加入适量烟草侵染悬浮液并吹打沉淀，使菌体悬浮起来，分光光度计测量od 600＝0.6～1.2，0.8最佳，室温放置2h，彻底悬浮菌液；取1000x(x＝0.8/所测od值)微升
菌液至2ml离心管中，4000rpm离心10min后弃上清，加入1ml的悬浮液重新悬浮菌体；按照以下四组设计方案：荧光素酶质粒pgrdl_spb菌液 35s空载质粒菌液、质粒pgrdl_spb菌液 35s
‑
mir169y菌液、质粒pgrdl_spb_169菌液 35s空载质粒，质粒pgrdl_spb_169 35s
‑
mir169y质粒，按照前者：后者体积比＝1:10混合菌液，终体积1ml；选取生长一个月左右的本氏烟(4～5叶期)进行注射，注射前要充分吸水使其气孔张开，用1ml注射器，以叶脉为界限一片叶子注射两个伤口，1ml打3片叶子并用马克笔圈出侵染部位，每组菌液注射三片叶子；将处理过的烟草做好标记，暗培养12h后放回培养箱正常管理。
31.双荧光素酶活性检测
32.注射菌液2～3天后进行测量，在马克笔圈出的范围内剪取叶片(≤25mg)放入1.5ml离心管中，加入干净的钢珠，放入液氮中冷冻，并用打样机打碎；在震碎的烟草组织中加入100μl 1
×
cell lysis buffer(细胞裂解液)混匀，室温放置5
‑
10min(如果荧光素酶表达水平过低，可适当减少裂解液用量以提高蛋白浓度)；12000rpm离心2分钟，吸取20μl上清于2ml离心管中，加入100μl平衡至室温的luciferase substrate迅速混匀，用发光检测仪检测firely luciferase报告基因活性；在以上反应液中加入100μl新鲜配置的renilla底物工作液，迅速混匀后用发光检测仪检测renilla luciferase报告基因活性，renilla luciferase作为校正转染效率的内参，消除孔间细胞数量和转染效率的差异。
33.经patmatch_v1.2软件对os
‑
mir169y与核盘菌ssrpl19基因进行靶向关系预测，两者存在互作关系，os
‑
mir169y和靶基因的互补配对情况见图1。通过双荧光素酶活检测，确认了os
‑
mir169y与核盘菌ssrpl19基因的互作，其结果见图2。进一步，将os
‑
mir169y的成熟序列与已知的mirna序列对比和系统进化树分析，该序列与其他同源mirna差异明显，表明了os
‑
mir169y的特异性(图3)。
34.实施例2 os
‑
mir169y的核盘菌转基因载体pef1
‑
os
‑
mir169y构建
35.人工合成os
‑
mir169y的前体序列(序列如seq id no.2)，将生物公司返回的含有该序列的质粒进行ecor v单酶切，另外用ecor v单酶切pef1载体质粒，两者酶切体系均为：2μl ecor v，5μl质粒dna(1000ng/μl)，5μl 10x fastdigest buffer，38μl ddh2o，均在pcr仪中37℃孵育1h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，切取目的片段大小(os
‑
mir169y前体序列为118bp，pef1载体约为9000bp)的胶块于1.5ml离心管中，用琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收。对线性化pef1载体进行去磷酸化处理，反应体系为：1μl quick cip，5μlbuffer，2μl dna(1000ng/μl)，12μl ddh2o。反应条件为37℃，30min；80℃，2min。将上述胶回收获得的前体序列和去磷酸化后的线性化pef1载体通过t4 dna连接酶进行连接，连接体系为：3μl胶回收产物，3μl pef1载体，1μl t4 dna ligase，3μl ddh2o。pcr仪中22℃连接1h。将上述连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，挑取适当数量的单克隆于含有对应抗性的lb液体培养基(添加amp，100mg/ml)中，37℃摇床200rpm培养6～8个小时后进行菌液pcr检测，引物为gy2f/gy2r(gy2f:5
’‑
ctggacttcacttttgcctct
‑3’
，gy2r:5
’‑
ctcttggacatatccctctgg
‑3’
)，pcr体系为：2μl菌液，12.5μl 2
×
taq mix，2μl gy2 f(10μm)，2μl gy2r(10μm)，6.5μl ddh2o，反应程序为：94℃，5min；94℃，30s；58℃，30s；72℃，30s；30个循环，72℃，5min；16℃，end。将扩增片段为402bp的克隆菌液进行扩大培养，所得菌液提取质粒，即为os
‑
mir169y的过表达载体pef1
‑
os
‑
mir169y(图4)。
36.实施例3转基因载体pef1
‑
os
‑
mir169y转入核盘菌
37.核盘菌原生质体的制备
38.将核盘菌菌株
‘
1980’接种到铺有玻璃纸的土豆葡萄糖(pda)培养基上培养36h，在超净工作台刮取1～2皿菌丝于100ml pdb培养基中，22℃150rpm摇床震荡培养36h；培养好的菌丝用300目大小的网筛过滤得到菌丝体，用0.8mmgso4洗涤菌丝体两次；将菌丝体挑入酶解液中，30℃150rpm摇床中酶解2～3h，期间抽取1ml酶解液在计数板上观察酶解情况；用灭菌漏斗过滤酶解后的溶液，4000rpm，4℃离心10min，沉淀即为核盘菌原生质体；将上述沉淀用2～5ml 0.8m mgso4溶液清洗两次，4 000rpm，4℃离心10min，弃上清液；原生质体悬浮液吹打悬浮沉淀，分装于1.5ml离心管中，每管100μl；将制备好的核盘菌原生质体保存于
‑
80℃低温冰箱中，备用。
39.peg介导的原生质体转化
40.将载体pef1
‑
os
‑
mir169y质粒单酶切线性化后利用peg介导的原生质体转化的方式转化核盘菌菌株1980，具体步骤如下：质粒单酶切后进行胶回收，向胶回收产物中分别加入2μl亚精胺和2μl肝素钠；将上述混合物加入制备好的100μl原生质体中，冰浴40min；向离心管中加入1ml ptc轻柔混匀，切勿吹打震荡，25℃处理30min；将上述混合液加入配置好的rm底部培养基中(培养基温度不可过高，以手背触摸培养基瓶身不烫手为宜)，轻轻晃动培养基，混匀后迅速倒在培养皿中，每皿约20ml左右，于22℃培养箱中倒置培养；培养16h后，重新打开培养皿倒入5ml左右含潮霉素200μg/l的rm顶部培养基，顶部培养基要均匀的覆盖在底部上；22℃培养箱中正置培养约4～5d，即可在在顶部培养基表面长出肉眼可见的菌落。用接种针挑取从顶部培养基表面生长出来的单菌落于含潮霉素(100μg/ml)的pda培养基上，22℃培养箱中倒置暗培养1天。选取在潮霉素(100μg/ml)抗性的pda培养基上生长正常的菌丝转移至新的潮霉素(200μg/ml)抗性的pda培养基中进行筛选，将培养基中潮霉素浓度提高为300μg/ml进行最终的筛选。将经过3次筛选的单菌落进行编号，即获得具有稳定潮霉素抗性的转化子。
41.实施例4 os
‑
mir169y的转基因核盘菌筛选
42.将经过潮霉素抗性筛选的转化子接种到铺有玻璃纸的pda培养基上，22℃培养36h，刮取菌丝于装有钢珠的2ml离心管，立即置于液氮中，采用ctab法提取核盘菌dna，以核盘菌1980为对照，用引物gy2f/gy2r(gy2f:5
’‑
ctggacttcacttttgcctct
‑3’
,gy2r:5
’‑
ctcttggacatatccctctgg
‑3’
)进行pcr扩增，筛选产物为402bp的个体作为阳性转化子。另外，收集菌丝用trnzol法提取其总rna，用北京全式金生物技术有限公司生产的mirna first
‑
strand cdna synthesis supermix进行mirna反转录试剂(加尾法)，体系如下：5μl total mirna，1μlmirna rt enzyme mix，10μl 2
×
ts mirna reaction mix，4μl rnase
‑
free water，反应程序为：37℃，1h。反转录cdna后进行荧光定量pcr检测，以ssu6为内参(引物为at
‑
u6f:5
′‑
cgataaaattggaacgatacag
‑3′
；universal mirna
‑
r:5
′‑
gatcgcccttctacgtcgtat
‑3′
)，检测转化子中os
‑
mir169y的表达量(引物rt
‑
mir169 f:5
′‑
ggcagtctccttggctaga
‑3′
；universal mirna
‑
r:5
′‑
gatcgcccttctacgtcgtat
‑3′
)。pcr反应程序为:94℃预变性5min；94℃20s，56℃20s，72℃20s，41个循环，接着，采集溶解曲线：将温度调至60℃，90s，预溶解；接着以1.0℃/s速度升温，每升温1℃保温5s，直至95℃。经pcr检测，共筛选出7个402bp大小条带的阳性转化子(图
5a)，荧光定量pcr显示7个转化子的os
‑
mir169y表达量均高于野生型菌株(图5b)。
43.实施例5 os
‑
mir169y的转基因核盘菌表型鉴定
44.根据实施例4中荧光定量pcr结果，选取阳性转化子ef1
‑
mir169y
‑
1与ef1
‑
mir169y
‑
2进行后续的表型鉴定。将野生型核盘菌菌株1980(wt)及阳性转化子在普通pda培养基上活化，用直径为6mm的打孔器沿菌丝边缘打孔，将新鲜的菌丝块转移至新的pda培养基中央(20ml/皿)，置于22℃霉菌培养箱中培养，每隔12h采用十字交叉法测量其生长直径，取平均值计算生长面积s(按圆形计算，单位cm2)和生长面积变化度d
s
，d
s
(％)＝100*(s
转化子
‑
s
wt
)/s
wt
。实验重复5次，每个处理5皿/重复。将上述完成生长速度测定的核盘菌在22℃霉菌培养箱中继续培养，培养10天时观察菌核形成情况。
45.在pda上培养36h的菌丝边缘用6mm打孔器打取菌丝块，在油菜6
‑
9叶期之间，采用离体叶片接种法接种于油菜中双11号的倒三叶，每个菌株每次接种5片叶片，每个叶片接种2个菌丝块，接种后置于22
±
1℃、湿度>85％条件下。接种48h后采用十字交叉法测量菌斑长径a和短径b，采用公式s＝π*a*b/4计算叶片发病面积，病斑面积变化度d
s
(％)＝100*(s
转化子
‑
s
wt
)/s
wt
。实验重复5次。
46.在pda上培养36h的菌丝边缘用6mm打孔器打取菌丝块，在油菜成熟前2周，采用离体茎秆接种法接种于油菜中双11号茎秆节间平整部位，每个菌株每次接种5个茎秆，每个茎秆上接种3个菌丝块，中间间隔15cm，接种后置于22
±
1℃、湿度>85％条件下，96h后统计菌斑长度l，计算病斑长度变化度d
l
(％)＝100*(l
转化子
‑
l
wt
)/l
wt
。实验重复5次。
47.经表型鉴定，培养36h的os
‑
mir169y过表达转化子菌丝生长面积相对于wt减小了48.8％(s
ef1
‑
mir169y
‑1＝15.05
±
1.34cm2，s
ef1
‑
mir169y
‑2＝16.09
±
2.13cm2,s
wt
＝30.42
±
0.71cm2)(p<0.01)(图6a)；培养10天后，os
‑
mir169y过表达转化子则尚未形成菌丝团结构(图6b)，培养25天后，os
‑
mir169y过表达转化子的菌核体积较小，单粒干重显著小于wt(w
ef1
‑
mir169y
＝0.13g，w
wt
＝0.17g)(p<0.05)(图6c)；致病力检测发现，接种mir169y过表达转化子的病斑面积较wt减小了33.1％(s
oe
‑
mir169y
‑1＝2.88
±
0.44cm2，s
oe
‑
mir169y
‑2＝2.95
±
0.44cm2,s
wt
＝4.36
±
0.72cm2)(p<0.01)(图6d),接种mir169y过表达转化子的病斑长度较wt减小了47.0％(l
oe
‑
mir169y
‑1＝2.96
±
0.30cm，l
oe
‑
mir169y
‑2＝2.60
±
0.36cm,l
wt
＝5.25
±
0.31cm)(p<0.01)(图6e)。综合上述结果，os
‑
mir169y过表达的转基因核盘菌，其菌丝生长速度和致病力显著下降、菌核形成延缓。
48.实施例6 os
‑
mir169y的植物转基因载体pbinglyred3
‑
os
‑
mir169y构建
49.将生物公司返回的含有mir169y前体序列的质粒及pbinglyred3质粒用xba i/xho i双酶切，琼脂糖电泳后胶回收，胶回收产物用t4 dna连接酶连接并转化大肠杆菌，挑取适当数量的单克隆进行菌检，引物组合为qw586f/qw586r(qw586f:5
’‑
cgcacaatcccactatcctt
‑3’
；qw586r:5
’‑
aaaagacaaaagtggggtag
‑3’
)，菌检条带为222bp的菌液提取质粒，将该质粒转入农杆菌用于拟南芥遗传转化。其中涉及的双酶切、胶回收、连接、菌检等操作同实施例2。根据上述步骤，本发明将pcr扩增片段为222bp的克隆菌液进行扩大培养，所得菌液提取质粒，即为os
‑
mir169y的过表达载体pbinglyred3
‑
os
‑
mir169y(图7)。
50.实施例7转基因载体pbinglyred3
‑
os
‑
mir169y转入拟南芥
51.将农杆菌菌液在含有kan(50mg/l)rif(25mg/l)、str(25mg/l)的lb液体培养基中
培养，28℃，200rpm过夜培养；将培养好的农杆菌液转入50ml无菌离心管中，低温高速离心机4℃，4000rpm离心10min，弃上清；向离心管中加入适量侵染悬浮液吹打沉淀，使菌体悬浮起来，分光光度计将侵染液od600调节至0.8～1.0；在人工气候培养箱中种植的野生型拟南芥col
‑
0，待盛花期，去掉已经完成受精的荚果后，将拟南芥花序浸泡于侵染液中轻轻晃动30s，取出后将拟南芥用保鲜膜覆盖保湿，暗培养24h后转移至培养箱正常培养，待拟南芥成熟后收获种子。
52.实施例8 os
‑
mir169y的转基因拟南芥筛选
53.将侵染后收获的拟南芥种子用红色激发光照射，挑选呈现红色荧光的种子为t0代，t0代种子种植后单株收获得到t1种子，将每个单株的种子再次进行照射筛选，选出发红色荧光:不发光的种子数量＝3:1株系的种植下一代，每个株系种植20株左右，t2代收获的种子中全部发红色荧光的植株即为该株系的纯合植株。
54.取转化的拟南芥和野生型拟南芥(阴性对照)苗期叶片用ctab法粗提dna，并其进行pcr鉴定，所使用引物组合为qw586f/qw586r(qw586f:5
’‑
cgcacaatcccactatcctt
‑3’
；qw586r:5
’‑
aaaagacaaaagtggggtag
‑3’
)，具有222bp扩增片段的为转基因阳性植株。
55.取阳性转基因纯合植株幼嫩叶片1
‑
2片装入有钢珠的2ml无rnase的离心管，立即放入液氮，用trnzol法提取总rna，利用加尾法进行mirna反转录，转录步骤同实施例4。反转录合成cdna后进行荧光定量pcr检测，以at
‑
u6为内参(引物为at
‑
u6f:5
′‑
cgataaaattggaacgatacag
‑3′
；universal mirna
‑
r:5
′‑
gatcgcccttctacgtcgtat
‑3′
)，检测转基因拟南芥中os
‑
mir169y的表达量(引物为rt
‑
mir169f:5
′‑
ggcagtctccttggctaga
‑3′
；universal mirna
‑
r:5
′‑
gatcgcccttctacgtcgtat
‑3′
)，pcr反应程序为同实施例4。
56.经pcr鉴定，共获得4个阳性植株(图8a)，目前分离出2个纯和株系(35s
‑
mir169y
‑
1、35s
‑
mir169y
‑
2)，荧光定量pcr检测出2个转基因株系的os
‑
mir169y表达量均高于野生型拟南芥col
‑
0(wt)，其中35s
‑
mir169y
‑
1中mir169y的表达量为wt的30.88倍、35s
‑
mir169y
‑
2中mir169y表达量为wt的20.65倍(图8b)。
57.实施例9 os
‑
mir169y的转基因拟南芥表型鉴定
58.苗期选取拟南芥生长状态一致的叶片作为接种材料，用直径为2mm的打孔器在核盘菌野生型菌株培养36h的菌丝边缘打取菌丝块，采用活体接种方式，将长有菌丝的一面贴合于拟南芥叶片表面，22℃保湿培养，接种24h后，以接种点为圆心采用十字交叉的方法测量病斑直径大小，计算病斑面积，计算方法同实施例5。实验重复3次，每个株系每次至少接种5苗。
59.对拟南芥的表型鉴定结果发现，接种24h后转基因株系35s
‑
mir169y
‑
1和35s
‑
mir169y
‑
2的发病面积分别为0.52
±
0.15cm2，0.73
±
0.21cm2，显著小于野生型col
‑
0(1.03
±
0.23cm2)(p<0.01)，os
‑
mir169y超量表达的转基因株系菌斑面积分别减小了52.5％和32.1％(图9)。
60.虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。