PBK/TOPK在诊断和治疗薄型内膜疾病中的应用的制作方法

pbk/topk在诊断和治疗薄型内膜疾病中的应用
技术领域
1.本发明属于生物制药领域，涉及pbk/topk在薄型内膜诊断及治疗中的应用。


背景技术：

2.胚胎植入是妊娠成功的关键环节，成功的植入需要发育良好的胚胎及具有良好容受性的子宫内膜。子宫内膜由单层柱状上皮细胞和富含间质细胞的固有层组成，适当厚度的子宫内膜为受精卵着床所必需。薄型内膜(thin endometrium,te) 是指病人在使用大剂量雌激素刺激后内膜厚度仍无明显提高。然而目前对于薄型内膜厚度的定义尚未达成广泛共识，一般认为是在黄体中期(排卵后6～10d)，子宫内膜厚度<7mm。其主要临床特征为月经周期正常但月经量过少(<30ml)。我们在临床工作中发现，有很大比例的薄型内膜患者是由于宫腔手术所致。由于发病机制不清，目前薄型子宫内膜尚无公认的有效治疗方法。近年来，随着宫腔镜操作及无痛人流术的增加，在我国te的发生率呈上升趋势。因此，亟待寻找有效的预测及治疗薄型内膜的方法。
3.pdz结合激酶(pbk)/t
‑
淋巴因子激活的杀伤细胞源性蛋白激酶topk是一种丝
‑
苏氨酸激蛋白酶，由激酶亚结构域和锌指结合域组成,据报道，在增殖细胞和组织中表达。pbk/topk调控细胞许多重要的生理功能，包括调控细胞有丝分裂、细胞增殖和细胞周期进程等。pbk/topk与薄型内膜是否存在关联，迄今未见报道。我们的研究发现，通过对薄型内膜患者子宫内膜组织中pbk/topk表达水平检测，能够为其诊断、治疗和严重程度评估提供可靠的依据。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供一种pbk/topk在诊断子宫内膜薄相关疾病中的应用。
5.本发明的目的通过以下技术方案实现：
6.pbk/topk在诊断薄型内膜中的应用，所述的检测pbk/topk表达水平的试剂为pbk/topk基因的特异性引物序列(如pcr引物或qpcr引物)或者检测pbk/topk蛋白的抗体。
7.本发明中所述的薄型内膜是指由于子宫内膜基底层损伤，功能层再生修复障碍，形成以内膜增生不良和纤维化为特征的薄型内膜。
8.本发明中所述的子宫内膜薄引起的疾病指薄型内膜以及由此导致的子宫性不孕、反复流产及胎盘植入等。
9.本发明的有益效果为：
10.本发明通过转录组测序发现，在薄型内膜患者子宫内膜中，pbk/topk表达显著下降。免疫组化结果表明，与对照组相比，pbk/topk在薄型患者间质细胞中的减少最为显著。体外结果也证实，在间质细胞中干扰pbk/topk表达后，间质细胞增殖受到抑制。因此，pbk/topk在薄型内膜的诊断及治疗方面可能发挥重要作用，为薄型内膜的诊断、治疗和病情评估提供一个可靠的依据。
附图说明
11.图1、a：由mcode筛选出的最重要模块的蛋白质相互作用网络；绿色表示在薄型内膜患者中表达下调；b：对mcode最重要模块差异表达基因的基因本体论(go)分析。
12.图2、上图：qpcr检测子宫内膜组织中pbk/topk的mrna水平；下图：免疫组化分析子宫内膜组织中pbk/topk的表达量；
13.图3：cck8测定干扰pbk/topk后细胞增殖活性的改变。
14.图4：子宫内膜组织中pbk/topk表达水平的roc曲线。
具体实施方式
15.实施例1使用生物信息学方法对rna
‑
seq差异表达基因进行分析
16.1、材料，试剂，设备
17.1.1人子宫内膜组织来源
18.收集7例对照正常子宫内膜组织以及7例薄型内膜患者子宫内膜组织，获取子宫内膜组织时，根据激素水平确保内膜组织获取阶段全部统一为增殖晚期阶段。所有参与者签署知情同意书，并经过南京鼓楼医院伦理委员会批准。
19.1.2主要试剂
20.rnasy plus micro kit(qiagen，德国)、无水乙醇、depc水、无酶水、反转录试剂(雅酶)、sybr green(雅酶)。
21.1.3主要仪器
22.qubit 3.0荧光计、agilent 2100生物分析仪、illumina hiseq x10平台(illumina，加利福尼亚州，美国)、nano drop。
23.1.4主要方法
24.1.4.1蛋白质
‑
蛋白质相互作用(ppi)网络构建和模块分析
25.用于检索交互基因(string)数据库对rna
‑
seq筛选出的差异表达基因构建蛋白质
‑
蛋白质相互作用(ppi)网络。接着，通过cytoscape分析差异表达基因的ppi网络(下调的基因显示为绿色)。最后，通过mcode插件筛选出了得分最高重要模块。
26.1.4.2差异表达基因的go分析
27.为了揭示子宫内膜变薄的潜在生物学特征，使用metascape数据库进一步研究mcode得分最高模块的基因参与的生物学过程。
28.2、实验结果
29.下调基因主要富集到细胞有丝分裂、细胞周期调控等生物学过程。pbk/topk是 mcode最重要模块中的关键基因(图1)。
30.实施例2pbk/topk在正常及薄型内膜患者子宫内膜组织中的表达
31.1、材料，试剂，设备
32.1.1人子宫内膜组织来源
33.收集8例正常子宫内膜组织以及10例薄型内膜患者子宫内膜组织，获取子宫内膜组织时，根据激素水平确保内膜组织获取阶段全部统一为增殖晚期阶段。所有参与者签署知情同意书，并经过南京鼓楼医院伦理委员会批准。
34.1.2主要试剂
35.trnzol(天根)、氯仿、异丙醇、无水乙醇、depc水、无酶水、反转录试剂 (雅酶)、sybr green(雅酶)、二甲苯、95％、80％及75％乙醇、3％双氧水、柠檬酸修复液、pbk/topk抗体(abcam)、dab显色液、苏木素、氨水、中性树脂。
36.pbk/topk引物序列：
37.forward primer 5
’‑3’
：ccaaacattgttggttatcgtgc(seq id no.1)；
38.reverse primer 5
’‑3’
：ggctggctttatatcgttcttct(seq id no.2)
39.1.3主要仪器
40.nano drop、金属浴、qpcr仪(roche)、pcr仪(abi)、烘箱、显微镜(leica)。
41.1.4主要方法
42.1.4.1组织rna提取及实时荧光定量pcr
43.采用trnzol法提取总rna。内膜组织中加入1ml trnzol溶液，充分匀浆，加入200μl氯仿，充分振荡，静置10min；在4℃12000rpm离心15min，吸取上清，加入等体积异丙醇，充分混匀，静置15min，4℃12000rpm离心15min；弃去上清，加入1ml 75％乙醇，充分振荡，4℃7500g离心5min，弃去上清，重复乙醇清洗一次，室温干燥20min，加入20μl无酶水56℃金属浴溶解，测浓度及纯度。取1ug rna反转录后得到cdna，用适量体积的rnase
‑
free水稀释后， sybr green方法进行荧光定量pcr检测，目标基因的表达量，采用gapdh作为内参，相对表达水平用2
‑
δct
值表示。
44.1.4.2子宫内膜组织免疫组化
45.石蜡切片80℃烘箱60min，二甲苯处理3次，每次5min，100％乙醇5min， 95％乙醇5min，80％乙醇5min，75％乙醇5min，流水冲洗适当时间，3％ h2o215min(去除内源性过氧化物酶)，流水冲洗适当时间；柠檬酸热修复，一抗37℃孵育2h，pbst冲洗3遍，每次5min，二抗孵育8min，pbst冲洗3遍，每次5min。显微镜下dab显色，苏木素染核，氨水返蓝，中性树脂封片后显微镜观察并拍照。
46.2、实验结果
47.薄型内膜患者子宫内膜组织中，pbk/topk的mrna和蛋白表达显著下降，并且以间质细胞中的表达下降最为显著(图2)。
48.实施例3pbk/topk对人子宫内膜间质细胞增殖的影响
49.1、材料，试剂，设备
50.1.1主要试剂
51.cck8试剂盒(vazyme)、透明质酸酶(sigma)、dnaase(roche)、pbs、 dmem/f12培养基(gibco)、fbs血清(gibco)、抗生素、胰蛋白酶 1.2主要仪器
52.滤网、离心机、细胞培养箱、细胞计数仪、酶标仪
53.1.3主要方法
54.1.3.1人子宫内膜间质细胞分离培养
55.取宫腔镜下刮取的人子宫内膜组织，生理盐水冲洗，剪碎。加入0.1％ⅰ型胶原酶消化液，37℃恒温消化1hour。过100目筛网去除组织残渣，滤过液经230
×
g、 5min离心后弃上清。无血清dmem/f12重悬沉淀，过400目筛网，230
×
g、 5min离心弃上清。用dmem/f12培养液重悬细胞，接种于培养瓶中，37℃、 5％co2培养30min后，弃上清，得到贴壁单层间质细胞，添加新培养基，隔天换液，细胞贴壁密度达70％～80％时传代。
56.1.3.2cck8实验检测细胞增殖活性
57.消化对数生长期细胞，按5000个/孔细胞的密度种到96孔板，补充完全培养基至100μl。将96孔板放于37℃孵箱中分别孵育24、48和72h。在所需时间点取出对应的96孔板，加入cck810μl，37℃孵育2h。用酶标仪检测450nm处每孔吸光度值，绘制曲线。
58.2、结果
59.与对照组相比,干扰pbk/topk后人子宫内膜间质细胞增殖活性下降(图3)。实施例4pbk/topk对薄型内膜的诊断价值
60.1、样本，材料，统计
61.1.1统计对象
62.收集8例正常子宫内膜组织以及10例薄型内膜患者子宫内膜组织，获取子宫内膜组织时，根据激素水平确保内膜组织获取阶段全部统一为增殖晚期阶段。经宫腔镜及超声测量子宫内膜厚度并诊断。qpcr检测子宫内膜pbk/topk的mrna 水平。根据正常和薄型内膜分组结合样本pbk/topk的表达水平制作roc曲线图。
63.1.2统计学处理
64.用graphpad prism软件进行统计学分析，p<0.05认为差异有统计学意义。
65.2、结果
66.pbk/topk诊断薄型内膜的roc曲线图可以看出pbk/topk对薄型内膜诊断具有诊断价值：area为0.9625，面积标准误为0.03945，面积的95％ci为0.8852
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1.000，p value为0.001(图4)。