一种犹素探针的合成方法与流程

1.本发明属于蛋白质化学合成技术领域，具体涉及一种犹素探针的合成方法，该犹素探针可用于共价交联去修饰酶。


背景技术：

2.犹素(ufm1)是存在于真核生物中的一种保守的类泛素蛋白，含有83个氨基酸。经犹素相关酶e1、e2、e3催化的级联反应，犹素c端甘氨酸会与蛋白底物的赖氨酸侧链形成酰胺键(也被称为异肽键)，从而形成犹素化修饰，进而调控底物蛋白的结构和功能。相似于其它翻译后修饰，犹素化也是动态可逆的过程，其异肽键可被去犹素化酶所特异性水解。
3.研究表明犹素化参与dna损伤修饰、基因转录、内质网稳态、细胞自噬、凋亡等细胞过程，其功能紊乱也被证明与肿瘤、精神分裂症、缺血性心脏病、糖尿病等密切相关。近年来多种犹素化的蛋白底物(如p53、组蛋白等)被相继鉴定，且数量上呈现逐年递增的趋势，但相应的酶催化体系却较为单一，如目前已知具备活性的人源去犹素化酶仅存在一种。犹素底物类型和数量的多样化与去犹素化酶的单一性预示着对犹素修饰系统的认识仍存在很大空白，比如是否存在其它未知的去犹素化酶，酶与不同底物间的选择性识别作用，去犹素化过程的酶催化机制等基础问题仍有待回答。
4.特异性靶向酶活中心的活性探针被认为是研究去犹素化酶的有效分子工具，在分子结构上由纯化标签、犹素、活性基团三部分组成，其原理为在犹素分子c端(异肽键附近)装配亲电基团，犹素作为识别单元与相应的去犹素化酶发生相互作用，此时去修饰酶不再水解酰胺键，其活性中心的半胱氨酸与亲电基团会发生加成或取代反应，进而形成底物
‑
酶的共价交联复合物，从而达到共价捕获蛋白酶的目的。该类型的探针具备多方面的应用价值，包括1)从细胞裂解液中富集纯化并结合蛋白质组学等技术发现新型去犹素化酶；2)分析疾病细胞中活性异常的去修饰酶而发现潜在的药物靶点；3)监测酶抑制剂的活性和选择性以发现潜在的药物分子；4)捕获并稳定去修饰酶的催化构象以促进底物
ꢀ‑
酶复合物的结构解析。
5.c端炔丙胺修饰的犹素探针(tag
‑
ufm1
‑
pa)被证明与去犹素化酶存在很好的交联活性，呈现广泛的应用前景，但其难以通过蛋白质重组表达或酶法进行制备，而目前已建立的全合成或半合成方法存在合成效率低或普适性差等不足。因此，开发更为简单、高效的犹素探针的化学合成方法将有利于推动去犹素化酶相关的机制研究，也为犹素修饰相关的靶点鉴定及抑制剂开发提供必需的探针分子。


技术实现要素：

6.本发明旨在提供一种犹素探针(his6‑
ufm1
‑
pa)的合成方法，具备普适性高、易功能化修饰、操作简易、可大量制备等特点。
7.按照本发明的技术方案，所述犹素探针的合成方法，所述犹素探针为 his6‑
ufm1
‑
pa(氨基酸序列如seq id no.1所示)，包括以下步骤，
8.步骤1：采用多肽固相合成技术分别制备犹素n端酰肼片段和犹素c端酰肼片段；
9.步骤2：采用多肽酰肼连接技术偶联所述犹素n端酰肼片段和犹素c端酰肼片段得到犹素酰肼；
10.步骤3：将所述犹素酰肼进行原位活化和氨解反应，得到所述犹素探针。
11.进一步的，所述犹素n端酰肼片段为his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2，所述犹素c端酰肼片段为ufm1[c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2。
[0012]
进一步的，所述步骤1的具体操作如下：
[0013]
1a、将固相合成树脂与fmoc
‑
nhnh2偶联，得到肼树脂；
[0014]
1b、将所述肼树脂脱除fmoc保护基团，并在含有fmoc
‑
氨基酸和缩合剂的溶液中进行多肽链的延伸偶联，得到连有多肽的树脂；
[0015]
1c、将所述连有多肽的树脂裂解脱除树脂和氨基酸侧链保护基，得到多肽溶液；
[0016]
1d、将所述多肽溶液进行浓缩、冰乙醚沉淀以及高效液相色谱纯化，得到犹素n端酰肼片段his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2和犹素c端酰肼片段 ufm1[c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2。
[0017]
步骤1中犹素n端片段his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2的合成中，在其n末端修饰了6个连续组氨酸的标签，可用于基于镍离子的富集纯化。
[0018]
进一步的，所述步骤1b中，缩合剂为hctu(6
‑
氯苯并三氮唑
‑
1,1,3,3
‑
四甲基脲六氟磷酸酯)、hbtu(苯并三氮唑
‑
n,n,n',n'
‑
四甲基脲六氟磷酸盐)和hatu (2
‑
(7
‑
氮杂苯并三氮唑)
‑
n,n,n',n'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯)等常用多肽固相合成缩合剂中的一种或多种。
[0019]
具体的，步骤1可以包括以下操作：
[0020]
1a、制备肼树脂：称取2
‑
chlorotrityl chloride树脂置于多肽合成管中，标准洗一次，抽干；加入体积比为1：1的dmf/dcm(n,n
‑
二甲基甲酰胺/二氯甲烷) 混合溶剂溶胀25
‑
35min，抽干；加入fmoc
‑
nhnh2(4当量)、diea(n,n
‑ꢀ
二异丙基乙胺，10当量)的dmf溶液，37℃震荡反应4
‑
6h，抽干；加入甲醇并室温震荡10
‑
15min以封闭未反应的官能团，抽干；dmf、dcm各洗涤3
‑
6 次，抽干待用；
[0021]
1b、称取步骤1a制备的肼树脂(0.1mmol)，加入20％哌啶的dmf溶液 (v/v)脱除fmoc保护基团，室温震荡反应5
‑
8min，dmf洗两次，抽干；再加入20％哌啶的dmf溶液，室温震荡反应10
‑
15min，标准洗一次(dmf洗3次， dcm洗3次，dmf洗3次)，抽干；
[0022]
标准肽链延伸，缩合反应体系为fmoc
‑
氨基酸(4当量)、hctu(3.8当量)、 diea(8当量)的dmf溶液，30℃偶联40
‑
50min，反应结束后，标准洗1次；加入20％哌啶反应两次(5min和10min)，标准洗1次，进行下一个氨基酸的缩合循环；
[0023]
1c、从树脂切割多肽和多肽脱保护：加入20％哌啶反应两次(5min和10 min)，标准洗1次；以dcm洗树脂多次，抽干；加入标准切割试剂 (tfa/thioanisole/phenol/edt/h2o体积比为85/5/5/2.5/2.5)，室温反应2
‑
3h；使用氮气鼓泡方法浓缩多肽溶液至2ml左右；加入冰乙醚沉淀，离心5min，弃上清保留沉淀；用冰乙醚洗涤粗肽两次，沉淀静置晾干获得粗肽；
[0024]
1d、分离纯化：以乙腈
‑
水的混合溶液溶解粗肽，使用半制备型反相高效液相色谱(c18或c4柱)纯化多肽，收集目标组分，低温冷冻干燥后获得目标多肽(his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2和ufm1[c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2)，密封低温保存待用。
[0025]
进一步的，所述步骤2的具体操作如下：
[0026]
2a、将所述步骤1得到的犹素n端酰肼片段his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2溶于氧化缓冲
液，冰盐浴下加入氧化剂反应，随后依次加入硫醇和犹素c端酰肼片段ufm1[c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2并分别进行反应；
[0027]
2b、加入还原剂，纯化而制得his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2；
[0028]
2c、将所述his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2溶于脱硫缓冲液中，加入引发剂和自由基捕获剂，调节ph至7.0
‑
8.0，进行脱硫反应，纯化得到犹素酰肼 his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
a
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2。
[0029]
进一步的，所述氧化缓冲液为ph 3.0
‑
4.0的盐酸胍和磷酸氢二钠的混合溶液。
[0030]
进一步的，所述步骤2a中，氧化剂为亚硝酸钠水溶液，硫醇为4
‑
巯基苯基乙酸溶液。
[0031]
进一步的，所述步骤2b中，还原剂为三(2
‑
羧乙基)膦溶液。
[0032]
进一步的，所述步骤2c中，自由基引发剂为2,2'
‑
氮杂双(2
‑
咪唑啉)(va
‑
044)，捕获剂为还原型谷胱甘肽或叔丁基硫醇，所述脱硫缓冲液为ph 7.0的盐酸胍、磷酸氢二钠和tcep(三(2
‑
羧乙基)膦)的混合液。
[0033]
具体的，4
‑
巯基苯基乙酸溶液由0.2m的4
‑
巯基苯基乙酸溶于连接缓冲液制得；三(2
‑
羧乙基)膦溶液由0.1m的三(2
‑
羧乙基)膦溶于连接缓冲液制得；连接缓冲液为ph 7.0的盐酸胍和磷酸氢二钠的混合溶液。
[0034]
具体的，步骤2可以包括以下操作：
[0035]
2a、称取1当量的his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2溶于氧化缓冲液(6m盐酸胍、 0.2m磷酸二氢钠、ph 3.0)，冰盐浴(约
‑
12℃)冷却10
‑
15min，加入10当量的亚硝酸钠水溶液(0.2m)，冰盐浴搅拌反应20
‑
30min；直接加入60当量的 4
‑
巯基苯基乙酸溶液(4
‑
巯基苯基乙酸溶于6m盐酸胍、0.2m磷酸二氢钠的连接缓冲液，浓度为0.2m)；搅拌数分钟后加入1当量的ufm1[c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2，以2m氢氧化钠溶液调ph至6.6，室温反应2h左右，过程中以高效液相色谱监测反应；
[0036]
2b、反应结束后加入等体积的tcep溶液(0.1m的连接缓冲液溶液)，室温搅拌8
‑
15min；以高效液相色谱进行纯化，收集目标组分并质谱确认，低温冷冻干燥后获得目标产物his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2，密封保存待用；
[0037]
2c、自由基脱硫：称取一定量的his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的冻干固体，加入脱硫缓冲液(6.0m盐酸胍、0.2m磷酸氢二钠、1.0m tcep、ph 7.0) 溶解，加入25当量va
‑
044和50当量还原型谷胱甘肽，调ph至7.5，37℃反应过夜；高效液相色谱纯化，收集目标组分并质谱确认，低温冷冻干燥后获得目标产物
‑
犹素酰肼his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
a
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2，密封保存待用。
[0038]
进一步的，所述步骤3的具体操作如下：
[0039]
将所述步骤2得到的犹素酰肼his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
a
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2溶于氧化缓冲液，冰盐浴下加入氧化剂并反应，随后依次加入硫醇和炔丙胺并分别进行反应，制得所述犹素探针。
[0040]
步骤3为原位“一锅法”反应，中间体不需纯化，犹素探针his6‑
ufm1
‑
pa 的c末端为n
‑
(2
‑
丙炔基)酰胺结构。
[0041]
进一步的，所述氧化剂为亚硝酸钠水溶液，催化剂为4
‑
巯基苯基乙酸溶液 (其制备如上)。
[0042]
具体的，步骤3可以包括以下操作：称取一定量的犹素酰肼，溶于氧化缓冲液，冰盐浴(约
‑
12℃)冷却8
‑
15min，加入10当量的亚硝酸钠水溶液(0.2m)，冰盐浴搅拌反应20
‑
30min；直接加入60当量的4
‑
巯基苯基乙酸溶液，搅拌反应8
‑
15min；直接加入炔丙胺，调节ph至9.0，室温反应8
‑
15min；反应结束后以高效液相色谱进行纯化，收集质谱确认的组分，低温冷冻干燥获得犹素探针his6‑
ufm1
‑
pa。
[0043]
本发明的技术方案相比现有技术具有以下优点：
[0044]
本发明采用全合成制备犹素酰肼，经酰肼的原位氧化和氨解的“一锅法”获得犹素探针，相比于策略1(两片段连接的全合成方法，其中片段连接采用硫酯介导的标准自然化学连接，犹素c端与炔丙胺的偶联采用全保护肽的液相缩合反应)合成操作简单、效率高、可大量制备，且相同策略可拓展至其它c端官能化修饰；相比于策略2(重组表达的半合成方法，即表达制备犹素c端甘氨酸突变为半胱氨酸的突变体ufm1g83c，小分子活化c端半胱氨酸后氨解获得 ufm1
‑
pa)，本发明突破重组表达局限于20种天然氨基酸，普适性高、易功能化修饰(如biotin、荧光分子修饰)，具备更广的应用前景。
[0045]
综上，本发明具备普适性高、操作简单、合成效率高、易功能化修饰、可大量制备等优点。
附图说明
[0046]
图1为本发明专利合成犹素探针(his6‑
ufm1
‑
pa)的基本流程图。
[0047]
图2为本发明专利涉及的犹素探针的应用原理图。
[0048]
图3为犹素n端片段his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2的高效液相色谱图。
[0049]
图4为犹素n端片段his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2的esi
‑
ms质谱图。
[0050]
图5为犹素c端片段ufm1[c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的高效液相色谱图。
[0051]
图6为犹素c端片段ufm1[c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的esi
‑
ms质谱图。
[0052]
图7为连接产物his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的高效液相色谱图。
[0053]
图8为连接产物his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的esi
‑
ms质谱图。
[0054]
图9为脱硫产物
‑
犹素酰肼his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
a
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的高效液相色谱图。
[0055]
图10为脱硫产物
‑
犹素酰肼his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
a
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的esi
‑
ms 质谱图。
[0056]
图11为犹素探针his6‑
ufm1
‑
pa的高效液相色谱图。
[0057]
图12为犹素探针his6‑
ufm1
‑
pa的esi
‑
ms质谱图。
具体实施方式
[0058]
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0059]
实施例1
[0060]
称取1.5g的2
‑
chlorotrityl chloride树脂置于多肽合成管中，标准洗一次，抽干；加入38ml体积比为1:1的dmf/dcm混合溶剂溶胀30min，抽干；加入fmoc
‑
nhnh2(4当量)、diea(10当量)的dmf溶液(25ml)，37℃震荡反应5h，抽干；加入1.2ml甲醇并室温震荡10min以封闭未反应的官能团，抽干；dmf、dcm各洗涤多次，所制备的肼树脂抽干待用；
[0061]
称取一定量上述肼树脂(0.1mmol)，加入2ml的20％哌啶的dmf溶液 (v/v)脱除
fmoc保护基团，室温震荡反应5min，dmf洗两次，抽干；再次加入2ml的20％哌啶的dmf溶液，室温震荡反应10min，标准洗一次(dmf 洗3次，dcm洗3次，dmf洗3次)，抽干；
[0062]
标准肽链延伸，缩合反应体系为fmoc
‑
氨基酸(4当量)、hctu(3.8当量)、 diea(8当量)的3ml dmf溶液，30℃偶联45min，反应结束后，标准洗1 次；加入2ml的20％哌啶反应两次(5min和10min)，标准洗1次，进行下一个氨基酸的缩合循环；
[0063]
从树脂切割多肽和多肽脱保护：肽链延伸完成后，在反应管中加入2ml的 20％哌啶反应两次(5min和10min)，标准洗1次；以dcm洗树脂多次，抽干；加入10ml切割试剂(tfa/thioanisole/phenol/edt/h2o体积比为 85/5/5/2.5/2.5)，室温反应2h；使用氮气鼓泡方法浓缩多肽溶液至2ml左右；加入40
‑
45ml冰乙醚沉淀，离心5min，弃上清保留沉淀；用冰乙醚洗涤粗肽两次，沉淀静置晾干获得粗肽；
[0064]
分离纯化粗肽：以乙腈
‑
水的混合溶液溶解粗肽，使用半制备型反相高效液相色谱(c18或c4柱)纯化多肽，收集目标组分，低温冷冻干燥后获得目标多肽(his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2和ufm1[c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2)，密封低温保存待用。
[0065]
如图3所示，his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2的高效液相色谱图。色谱分离条件： c18色谱柱，250
×
4.6mm，5μm粒径，线性梯度为20
‑
80％乙腈30min，流速为1.0ml/min，λ＝214nm。
[0066]
如图4所示，his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2的esi
‑
ms质谱图。理论分子量： 5577.41，实际测定分子量：5576.55。
[0067]
如图5所示，ufm1[c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的高效液相色谱图。色谱分离条件： c18色谱柱，250
×
4.6mm，5μm粒径，线性梯度为20％
‑
80％乙腈30min，流速为1.0ml/min，λ＝214nm。
[0068]
如图6所示，ufm1[c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的esi
‑
ms质谱图。理论分子量： 4062.63，实际测定分子量：4061.50。
[0069]
称取16.6mg的his6‑
ufm1[s2‑
a
45
]
‑
nhnh2溶于氧化缓冲液(6m盐酸胍、 0.2m磷酸氢二钠、ph 3.0)，冰盐浴(约
‑
12℃)冷却10min，加入100μl的亚硝酸钠水溶液，冰盐浴搅拌反应25min；直接加入400μl的0.2m的4
‑
巯基苯基乙酸溶液；搅拌数分钟后加入11.0mg的ufm1[c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2，以2m 氢氧化钠溶液调ph至6.6，室温反应2h左右，过程中以分析型高效液相色谱检测反应；反应结束后加入等体积的tcep溶液(0.1m的连接缓冲液溶液)，室温搅拌10min；以高效液相色谱进行纯化，收集目标组分并质谱确认，低温冷冻干燥后获得目标产物his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2，密封保存待用；
[0070]
如图7所示，his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的高效液相色谱图。色谱分离条件：c18色谱柱，250
×
4.6mm，5μm粒径，线性梯度为20％
‑
80％乙腈 30min，流速为1.0ml/min，λ＝214nm。
[0071]
如图8所示，his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的esi
‑
ms质谱图。理论分子量：9608.02，实际测定分子量：9607.20。
[0072]
自由基脱硫：称取8.1mg的his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
c
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的冻干固体，加入0.9ml脱硫缓冲液(6.0m盐酸胍、0.2m磷酸氢二钠、1.0m tcep、ph 7.0) 溶解，加入6.6mg的va
‑
044和12.5mg还原型谷胱甘肽，调ph至7.5,37℃反应过夜；高效液相色谱纯化，收集目标组分并质谱确认，低温冷冻干燥后获得 his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
a
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2，密封保存待用。
[0073]
如图9所示，his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
a
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的高效液相色谱图。色谱分离条件：c18色谱柱，250
×
4.6mm，5μm粒径，线性梯度为20％
‑
60％乙腈 30min，流速为1.0ml/min，λ
＝214nm。
[0074]
如图10所示，his6‑
ufm1[s2‑
a
45
‑
a
46
‑
v
82
]
‑
nhnh2的esi
‑
ms质谱图。理论分子量：9575.96，实际测定分子量：9574.80。
[0075]
原位氧化氨解：称取5.3mg犹素酰肼，溶于氧化缓冲液，冰盐浴(约
‑
12℃) 冷却10min，加入20微升亚硝酸钠水溶液(0.2m)，冰盐浴搅拌反应25min；直接加入200微升的4
‑
巯基苯基乙酸溶液，搅拌反应10min；加入炔丙胺调节 ph至9.0，室温反应10min；反应结束后以高效液相色谱进行纯化，收集质谱确认的组分，低温冷冻干燥得犹素探针his6‑
ufm1
‑
pa。
[0076]
如图11所示，his6‑
ufm1
‑
pa的高效液相色谱图。色谱分离条件：c18色谱柱，250
×
4.6mm，5μm粒径，线性梯度为20％
‑
80％乙腈30min，流速为1.0 ml/min，λ＝214nm。
[0077]
如图12所示，his6‑
ufm1
‑
pa的esi
‑
ms质谱图。理论分子量：9598.60，实际测定分子量：9597.60。
[0078]
综上所述，本发明提供了一种简易获取犹素探针his6‑
ufm1
‑
pa的合成方法。
[0079]
显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引申出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
[0080]
[0081]