1.本发明涉及蛋白质合成技术领域，特别涉及体外无细胞蛋白合成技术领域，具体涉及一种含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系、其试剂盒及其应用，更具体地涉及一种含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系，包括d2p体系(dna-to-protein体系)和mr2p体系(mrna-to-protein体系)、体外蛋白合成试剂盒及其应用。
背景技术：
2.蛋白质是细胞中的重要分子，几乎参与了细胞所有功能的执行。蛋白质合成主要包括传统的细胞内合成技术和新一代的体外合成技术。传统的蛋白表达系统是指通过模式生物如细菌、真菌、植物细胞或动物细胞等表达外源基因的一种分子生物学技术。体外蛋白质合成系统，也称为无细胞表达系统，在1960年代应运而生，其以外源的mrna或dna为蛋白质的合成模板，通过人为控制添加蛋白质合成所需的底物、能量、以及转录和/或翻译相关蛋白因子等物质，实现外源蛋白质的合成。蛋白质体外合成系统一般是指在细菌、真菌、植物细胞或动物细胞的裂解体系中，加入核酸模板(mrna模板或者dna模板)、rna聚合酶、氨基酸、atp等组分，完成外源蛋白的快速高效翻译。蛋白质体外合成系统无需进行质粒构建、转化、细胞培养、细胞收集和破碎步骤，是一种相对快速、省时、便捷的蛋白质表达方式，是蛋白质领域的重要工具(―garcia ra,riley mr.applied biochemistry and biotechnology.humana press.1981,263-264”；―fromm hj,hargrove m.essentials of biochemistry.2012”；cn109988801a；―assenberg r,wan pt,geisse s,mayr lm.advances in recombinant protein expression for use in pharmaceutical research.current opinion in structural biology.2013,23(3):393-402”；―anne zemella,lena thoring,christian hoffmeister and stefan kubick.cell-free protein synthesis:pros and cons of prokaryotic and eukaryotic systems.chembiochem.2015,16:2420-2431”)。体外蛋白合成系统还可以表达对细胞具有毒害作用或者含有非天然氨基酸(如
d-氨基酸)的特殊蛋白质，能够同时平行合成多种蛋白质，便于开展高通量药物筛选和蛋白质组学的研究(spirin as,swartz jr.chapter 1.cell-free protein synthesis systems:historical landmarks,classification,and general methods.wiley-vch verlag gmbh&co.kgaa,2008:1-34.)。利用体外合成体系生产的蛋白质产品，可广泛应用于医药、食品、营养品、膳食补充剂、化妆品等各领域，包括但不限于申请人的proteinn
tm
、普罗敦
tm
、普敦
tm
等品牌的蛋白质产品。
3.蛋白合成能力是决定体外蛋白合成体系是否能实现产业化的关键指标之一，主要包括合成效率、蛋白合成量(蛋白表达量)等。为了提高蛋白合成产量，较多地从细胞提取物、能量系统、遗传模板(核酸模板)、反应器及操作形式等方面对体系进行优化改造(张绪.无细胞体系高效合成复杂膜蛋白的关键技术及工业应用探索[d].浙江大学,2014)，还包括探索尝试各种添加剂。其中，对细胞内蛋白合成起到有益效果的组分往往成为研究首选。不过，由于细胞内合成生物体系和体外合成微环境的巨大差异，效果并非可以简单预期，而是
需要借助大量的实验加以筛选和验证。
[0004]
无机盐离子是体外蛋白合成体系常用的添加剂，包括镁离子、钾离子等。其中，镁离子在蛋白翻译过程中发挥重要作用，其可以促进核糖体组装过程，提高rna的稳定性。此外，镁离子还起到促进聚合酶结合等作用。常见的用作镁离子源的化合物包括醋酸镁、氯化镁、谷氨酸镁等。参考文献包括wo2016005982a1、us20060211083a1、“l kai,v r kaldenhoff and f bernhard.artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins[j].plos one,2013,8(2):e56637”等。
[0005]
随着大量生物遗传信息的成功解读，如何实现在体外系统更高效、更高通量地合成蛋白，是当前蛋白质合成领域的迫切需求。
技术实现要素：
[0006]
针对上述技术问题，本发明公开一种简单、便捷、更高效、更高通量的含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系，该体系采用葡萄糖酸镁作为新型的镁离子供源，相对于传统的镁离子供源，能够显著提高蛋白质合成能力。
[0007]
1.本发明第一方面提供一种含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系，所述“含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系”在本发明中也简记为“cfps(mg )体系”，所述cfps(mg )体系包括外源镁离子；所述外源镁离子来自一种或多种供源，至少包括葡萄糖酸镁(magnesium gluconate)。
[0008]
所述cfps(mg )体系能够与编码外源蛋白的核酸模板共同提供合成外源蛋白所需的翻译相关元件，通过体外蛋白合成反应，表达得到外源蛋白。
[0009]
所述外源镁离子，至少包括葡萄糖酸镁，还可选地来自以下组中一种或多种组分：天门冬氨酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁、氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、柠檬酸镁、磷酸氢镁、碘化镁、乳酸镁、硝酸镁、草酸镁。
[0010]
优选方式之一，所述外源镁离子的供源为葡萄糖酸镁和天门冬氨酸镁(优选l-天门冬氨酸镁)的组合。
[0011]
优选方式之一，所述外源镁离子的供源为葡萄糖酸镁和谷氨酸镁(优选l-谷氨酸镁)的组合。
[0012]
优选方式之一，所述外源镁离子的供源为葡萄糖酸镁、天门冬氨酸镁(独立地优选为l-天门冬氨酸镁)和谷氨酸镁(独立地优选为l-谷氨酸镁)的组合。更优选之一，所述外源镁离子的供源为葡萄糖酸镁、l-天门冬氨酸镁和l-谷氨酸镁的组合。
[0013]
优选之一，所述葡萄糖酸镁提供的外源镁离子占总的外源镁离子的摩尔百分比，选自下述任一个百分比数值，或者下述任两个百分比数值之间的数值范围：25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％；所述数值范围包括两个端点。
[0014]
优选方式之一，至少25mol％所述外源镁离子来自葡萄糖酸镁。
[0015]
优选方式之一，至少30mol％所述外源镁离子来自葡萄糖酸镁。
[0016]
优选方式之一，至少40mol％所述外源镁离子来自葡萄糖酸镁。
[0017]
优选方式之一，至少50mol％所述外源镁离子来自葡萄糖酸镁。
[0018]
优选方式之一，至少80mol％所述外源镁离子来自葡萄糖酸镁。
[0019]
优选方式之一，至少90mol％所述外源镁离子来自葡萄糖酸镁。
[0020]
优选方式之一，100mol％所述外源镁离子来自来葡萄糖酸镁。
[0021]
所述“mol％所述外源镁离子”忽略游离态或螯合态的差异，仅以外源添加的镁元素的摩尔量计算。例如，外源添加1mol氯化镁(完全离子化，镁离子均处于游离态)、1mol葡萄糖酸镁(部分离子化，镁离子部分为游离态，部分为螯合态)，此时，葡萄糖酸镁提供的外源镁离子以50mol％计。
[0022]
能够提高外源蛋白合成量的葡萄糖酸镁用量选自y
prt
(c
mgp
)曲线中外源蛋白表达量大于y0时的葡萄糖酸镁用量区间。上述可选的用量区间可以为连续的，也可以为不连续的。
[0023]
本发明中，
[0024]
q
mgp
，指本发明涵盖的能够提高外源蛋白合成量的葡萄糖酸镁用量。
[0025]
用量，如无特别说明，一般指原料添加量，可以用浓度、质量、物质的量(或摩尔量)等方式表征。
[0026]
c
mgp
，指葡萄糖酸镁用量。本发明中优选采用浓度方式表征葡萄糖酸镁的用量。
[0027]
y
prt
，指外源蛋白表达量。
[0028]
y
prt
(c
mgp
)曲线，指以葡萄糖酸镁用量为自变量、外源蛋白表达量为因变量、其它反应参数均确定时的曲线，本发明中还记为y
prt
～c
mgp
曲线。所述“其它反应参数”包括但不限于：其它体系组分、反应原料的添加方式、反应温度程序、反应时间长度、反应容器的性质、反应体系体积，等等。一组配方的cfps(mg )体系可对应多个y
prt
～c
mgp
曲线。一组配方的cfps(mg )体系可以在不同的反应温度程序下反应，还可以反应不同的时间长度，由此可以产生若干不同的y
prt
～c
mgp
曲线。
[0029]
y
max
，指y
prt
(c
mgp
)曲线中外源蛋白的最高表达量。
[0030]
c
max
，指y
prt
(c
mgp
)曲线中外源蛋白最高表达量时的葡萄糖酸镁用量。
[0031]
y
min
，指y
prt
(c
mgp
)浓度曲线中，y
prt
>y0的区间范围内外源蛋白的最低表达量。
[0032]
y0，指所述c
mgp
为0时对应的外源蛋白表达量。
[0033]
y
δ
，为y
max
与y0的差值，数值上，y
δ
＝y
max-y0。
[0034]
优选地，所述q
mgp
选自外源蛋白表达量至少为y0 50％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0035]
更优选地，所述q
mgp
选自外源蛋白表达量至少为y0 60％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0036]
更优选地，所述q
mgp
选自外源蛋白表达量至少为y0 70％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0037]
更优选地，所述q
mgp
选自外源蛋白表达量至少为y0 80％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0038]
更优选地，所述q
mgp
选自外源蛋白表达量至少为y0 90％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0039]
更优选地，所述q
mgp
选自外源蛋白表达量至少为y0 95％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0040]
更优选地，所述q
mgp
采用外源蛋白最高表达量时的葡萄糖酸镁用量c
max
。
[0041]
一些优选例中，所述葡萄糖酸镁提供的外源镁离子的浓度选自下述任一种浓度，或者下述任两种浓度值之间的浓度范围(所述浓度范围包括两个端点)：0.1mm、0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、22mm、24mm、25mm、28mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、60mm、70mm、80mm。
[0042]
所述cfps(mg )体系，优选地，包括细胞提取物。
[0043]
所述cfps(mg )体系能够与编码外源蛋白的核酸模板共同提供合成外源蛋白所需的翻译相关元件。优选地，所述cfps(mg )体系含有能够识别核酸模板中启动子元件的体系组分，使得所述cfps(mg )体系能够识别所述编码外源蛋白的核酸模板中的启动子元件，例如所述cfps(mg )体系含有与核酸模板中启动子元件相应的rna聚合酶。
[0044]
所述能够识别核酸模板中启动子元件的体系组分(例如相应的rna聚合酶)，可以由所述细胞提取物提供，也可以通过其它外源组分提供，还可以通过两种方式的组合方式提供。
[0045]
通常地，外源蛋白的基因转录过程由核酸模板上的启动子启动。优选方式之一，外源蛋白的基因转录过程由核酸模板上的t7启动子启动。
[0046]
优选方式之一，所述细胞提取物含有内源性表达的rna聚合酶，所述内源性表达的rna聚合酶能够识别核酸模板中启动外源蛋白的基因转录程序的启动子。
[0047]
为了获得含有内源性表达的rna聚合酶的细胞提取物，优选方式之一，所述细胞提取物的来源菌株经过以下方式的基因改造(内源性菌株改造)：将rna聚合酶的编码序列插入到细胞内游离质粒、或者将rna聚合酶的编码基因整合到细胞基因组、或者采用前述两种方式的组合方式。需要说明的是，在进行上述内源性菌株改造时，除整合入上述编码序列/编码基因外，还允许插入其它核苷酸序列，比如非编码序列、增强子序列、kozak序列、前导序列或前导肽序列、信号肽序列、标签序列、密码子序列等等。通过上述内源性菌株改造，使得改造菌株可以内源性表达rna聚合酶。所述rna聚合酶优选t7 rna聚合酶。
[0048]
优选地，所述cfps(mg )体系包括rna聚合酶。所述rna聚合酶的来源包括但不限于：含内源性表达的rna聚合酶的细胞提取物、外源rna聚合酶、编码rna聚合酶的外源核酸模板的翻译产物、及其组合。上述各技术方案，各自独立地优选所述rna聚合酶为t7 rna聚合酶。所述编码rna聚合酶的外源核酸模板，经与所述cfps(mg )体系进行体外蛋白合成反应，可以被翻译为rna聚合酶。
[0049]
优选地，所述cfps(mg )体系包括细胞提取物，所述细胞提取物中含有内源性表达的t7 rna聚合酶。
[0050]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括dna聚合酶。所述dna聚合酶的来源包括但不限于：含内源性表达的dna聚合酶的细胞提取物、外源dna聚合酶、编码dna聚合酶的外源核酸模板的翻译产物、及其组合。上述各技术方案，各自独立地优选所述dna聚合酶为phi29 dna聚合酶。所述编码dna聚合酶的外源核酸模板，经与所述cfps(mg )体系进行体外蛋白合成反应，可以被翻译为dna聚合酶。
[0051]
所述rna聚合酶、dna聚合酶各自独立地，可以通过外源方式直接添加，或者以反应产物或中间产物的方式提供(如添加编码rna聚合酶或/和编码dna聚合酶的外源核酸模
板)。
[0052]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括外源添加的t7 rna聚合酶。
[0053]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括以下至少一种组分：外源性rna聚合酶、编码rna聚合酶的外源核酸模板、外源性dna聚合酶、编码dna聚合酶的外源核酸模板。
[0054]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括外源性rna聚合酶和外源性dna聚合酶。
[0055]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括外源性t7 rna聚合酶和外源性phi29 dna聚合酶。
[0056]
所述细胞提取物为：原核细胞提取物、真核细胞提取物、或者其组合。
[0057]
优选方式之一，所述细胞提取物为以下任一种来源：原核细胞、酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、或者其组合。所述原核细胞优选为大肠杆菌。
[0058]
所述酵母细胞，优选为克鲁维酵母、酿酒酵母、毕氏酵母、或者其组合。
[0059]
所述克鲁维酵母进一步优选为乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、多布克鲁维酵母、海泥克鲁维酵母、威克海姆克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、湖北克鲁维酵母、多孢克鲁维酵母、暹罗克鲁维酵母、亚罗克鲁维酵母、或者其组合。
[0060]
优选方式之一，所述细胞提取物选自以下任一种来源：大肠杆菌、乳酸克鲁维酵母、麦胚细胞、spodoptera frugiperda细胞(草地贪夜蛾细胞，一种昆虫细胞)、leishmania tarentolae细胞(蜥蜴利什曼原虫细胞)、兔网织红细胞、中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、非洲绿猴肾cos细胞、非洲绿猴肾vero细胞、幼地鼠肾细胞(bhk细胞)、人hela细胞、人hybridoma细胞(人杂交瘤细胞)、人纤维肉瘤ht1080细胞、及前述任意组合。
[0061]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括能量系统；所述能量系统优选选自：糖(如，单糖、二糖、寡糖、多糖)与磷酸盐能量体系、糖与磷酸肌酸能量体系、磷酸肌酸与磷酸肌酸酶体系、磷酸肌酸与磷酸肌酸激酶体系、糖酵解途径及其中间产物能量体系(例如，单糖及其酵解中间产物能量体系、糖原及其酵解中间产物能量体系)、及其组合。
[0062]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括合成蛋白的底物；所述合成蛋白的底物优选为氨基酸混合物，至少包括合成外源蛋白所需的氨基酸混合物。优选地，所述氨基酸混合物为天然氨基酸的混合物。
[0063]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括合成rna的底物；所述合成rna的底物优选为核苷酸混合物，更优选地选自：核苷单磷酸、核苷三磷酸、及其组合。所述合成rna的底物更优选为核苷三磷酸混合物。
[0064]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括合成dna的底物；所述合成dna的底物优选为脱氧核苷酸混合物，更优选为脱氧核苷三磷酸混合物。
[0065]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系中包括以下至少一种外源添加组分：翻译相关元件、dna扩增相关元件、rna扩增相关元件、rna酶抑制剂、拥挤剂、钾离子、抗氧化剂或还原剂、防冻剂、海藻糖、反应促进剂、消泡剂、烷烃、缓冲剂、水性溶剂。
[0066]
所述翻译相关元件优选选自：trna、核糖体、其它翻译相关酶、起始因子、延伸因子、终止因子及其组合。所述翻译相关元件优选为纯化的翻译相关元件。
[0067]
所述拥挤剂优选选自：聚乙二醇、聚乙烯醇、聚苯乙烯、葡聚糖、蔗糖聚合物(包括ficoll蔗糖聚合物，如试剂，一种非离子型合成蔗糖聚合物；还包括聚蔗糖)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、白蛋白、等、及其组合。
[0068]
钾离子源优选选自：醋酸钾、谷氨酸钾、氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、柠檬酸钾、磷酸氢钾、碘化钾、乳酸钾、硝酸钾、草酸钾、及其组合。
[0069]
所述抗氧化剂或还原剂优选选自：二硫苏糖醇、2-巯基乙磺酸、2-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽、三羧甲基磷酸、3-巯基-1,2-丙二醇、及其组合。
[0070]
所述防冻剂，可以包括但不限于海藻糖。
[0071]
海藻糖，既可以作为防冻剂，还可以作为能量系统的构成组分。
[0072]
所述反应促进剂优选为铝盐、铝氧化物(如氧化铝)、铁盐、铁氧化物、钙盐、或者其组合。
[0073]
所述烷烃优选为c6～c
44
烷烃的纯净物或混合物；所述烷烃进一步优选为环己烷、异辛烷、癸烷、十四烷、十五烷基环己烷、角鲨烷、四十四烷、凡士林、或者其组合。
[0074]
所述缓冲剂优选选自：tris-hcl、tris碱、hepes、及其组合。
[0075]
所述水性溶剂优选为缓冲剂。
[0076]
本发明所涉及的cfps(mg )体系的任一种组分，允许发挥两种或者两种以上的功能。
[0077]
所述cfps(mg )体系能够与编码外源蛋白的dna模板、编码外源蛋白的mrna模板中任一种核酸模板或者其组合，通过体外蛋白合成反应得到外源蛋白。
[0078]
上述各优选方式可以以任意合适的方式结合。
[0079]
2.本发明第二方面提供一种体外蛋白合成试剂盒，所述体外蛋白合成试剂盒包括：
[0080]
(i)第一方面所述含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(cfps(mg )体系)；
[0081]
(ii)可选地包括编码外源蛋白的核酸模板；
[0082]
(iii)标签或说明书。
[0083]
所述cfps(mg )体系能够与所述编码外源蛋白的核酸模板共同提供合成外源蛋白所需的翻译相关元件。
[0084]
优选地，所述cfps(mg )体系的各组分以固体、半固体(如膏状体)、液体、乳液(也称乳浊液)、悬浊液、或者其组合方式置于一个或多个容器中。
[0085]
优选地，所述(i)中具有独立分装的细胞提取物。
[0086]
利用所述体外蛋白合成试剂盒，可以进行体外蛋白合成反应，合成外源蛋白。
[0087]
3.本发明第三方面提供一种外源蛋白的合成方法，所述合成方法包括以下步骤：
[0088]
(i)提供本发明第一方面所述cfps(mg )体系；
[0089]
(ii)添加编码外源蛋白的核酸模板，进行孵育反应，合成所述外源蛋白；
[0090]
所述cfps(mg )体系能够与所述编码外源蛋白的核酸模板共同提供合成外源蛋白所需的翻译相关元件；
[0091]
还可选地包括步骤(iii)：分离或/和检测所述外源蛋白。
[0092]
第二方面和第三方面中，各自独立地包括但不限于以下几种优选方式：
[0093]
(1)优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板含有能够被所述cfps(mg )体系所识别的启动子元件。
[0094]
(2)优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括细胞提取物，所述编码外源蛋白的核酸模板含有所述细胞提取物能够识别的启动子元件。例如，所述细胞提取物中含有内源性
表达的、与核酸模板上启动子元件相对应的rna聚合酶。
[0095]
(3)优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板中含有t7启动子，所述cfps(mg )体系含有t7 rna聚合酶。
[0096]
(4)优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板中含有t7启动子，所述cfps(mg )体系包括细胞提取物，所述细胞提取物含有内源性表达的t7 rna聚合酶。
[0097]
(5)优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板含有能够启动外源蛋白的基因转录程序的t7启动子，也即外源蛋白的基因转录过程由核酸模板上的t7启动子启动。
[0098]
(6)优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板含有能够启动外源蛋白的基因转录程序的t7启动子，所述cfps(mg )体系含有t7 rna聚合酶。
[0099]
(7)优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板含有能够启动外源蛋白的基因转录程序的t7启动子(t7启动子位于核酸模板中外源蛋白的编码序列的上游，由t7启动子启动外源蛋白的基因转录程序)，所述cfps(mg )体系包括细胞提取物，所述细胞提取物含有内源性表达的t7 rna聚合酶。
[0100]
第二方面和第三方面中，所述编码外源蛋白的核酸模板为dna模板、mrna模板、或者其组合；所述编码外源蛋白的核酸模板优选为dna模板。
[0101]
4.本发明第四方面提供第一方面所述含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(cfps(mg )体系)的应用，应用于蛋白合成方面。所述应用于蛋白合成方面，包括但不限于，应用于蛋白制造，或者应用于基于蛋白合成的检测等方面。
[0102]
5.本发明第五方面提供葡萄糖酸镁在第一方面所述含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系中，或者在第二方面所述体外蛋白合成试剂盒中，或者在第三方面所述外源蛋白的合成方法中的应用。
[0103]
有益效果：
[0104]
本发明对体外无细胞蛋白合成体系进行优化，提供一种含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(cfps(mg )体系)，采用葡萄糖酸镁作为新型镁离子供源，相对于传统的镁离子供源(特别是相对于常用的醋酸镁和谷氨酸镁)，能够显著提高蛋白合成效率和蛋白合成量。进而还提供一种更高效、更高通量的体外无细胞蛋白合成试剂盒(特别是d2p试剂盒)及外源蛋白的合成方法，还兼具简单、便捷、低成本的优点。此外，本发明可以采用包括但不限于真核细胞提取物，能够提供较优的翻译后修饰机制，用于合成复杂的、含翻译后修饰(如：二硫键、糖基化等)的功能性蛋白，具有广泛的应用空间。
[0105]
我们推测，在反应进行过程中，核苷酸与外源镁离子供源之间具有竞合的对金属镁离子结合作用(也即核苷酸对金属镁离子的相互作用，与外源镁离子中对镁离子的相互作用之间，是竞争性的)，随着核苷酸和核酸物质的动态浓度变化，导致体系的镁离子浓度处于一个不稳定的状态，进而影响蛋白合成效率和蛋白表达量。相对于传统的镁源(醋酸镁、谷氨酸镁)，葡萄糖酸镁分子中，葡萄糖酸残基部分对镁离子具有相对较强的结合力，能够在溶液中形成镁离子-葡萄糖酸络合物，结构中的多个羟基也可以参与稳定镁离子，为体系提供更稳定的镁离子浓度，从而增加体系的蛋白合成能力(参考以下文献“bailey gd and carper wr.13c nmr relaxation studies of gluconate and magnesium-gluconate interactions[j].journal of inorganic biochemistry,1993,52(2),99-108”)。
[0106]
体外蛋白合成主要受不同菌种间的通用属性的调控时，相应的技术手段产生的技
术效果可以不受菌种差异的影响，能够在这些菌种之间普遍适用。本发明中提供的新型的镁离子供源，不仅适用于乳酸克鲁维酵母细胞提取物的体外蛋白合成体系的优化，也适用于对其它的酵母系统、其它的真核系统的体外蛋白合成体系的优化；还可以用于对原核系统的体外蛋白合成体系进行优化。
附图说明
[0107]
图1、编码外源蛋白megfp的质粒dna的结构示意图，共6056bp，记为质粒d2p-megfp(简记为pd2p-megfp)。所述megfp为增强型绿色荧光蛋白的突变体。该质粒dna包括以下元件：t7启动子(能够被t7 rna聚合酶识别)、5’非编码区、前导序列、纯化标签(可选元件)、外源蛋白megfp的编码序列、3’非编码区、lac4终止子、复制起始位点(f1 ori)、ampr启动子、氨苄青霉素抗性基因(ampr基因)、高拷贝数复制起始位点(ori)、控制质粒拷贝数的基因(rop基因，位于ori下游，图中未标示)、laci启动子、lac抑制子(laci)的编码基因。
[0108]
图2、外源核酸模板的一种示例结构。图中的外源核酸模板为编码外源蛋白的质粒dna。
[0109]
图3、外源核酸模板的另一种示例结构。图中的外源核酸模板为编码外源蛋白的质粒dna。
[0110]
图4、葡萄糖酸镁、醋酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。横坐标标记为“组别-镁离子浓度值”，其中镁离子浓度值以mm为单位。gluconate组、acetate组分别由葡萄糖酸镁、醋酸镁提供外源镁离子。bc为空白对照。
[0111]
图5、葡萄糖酸镁、醋酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。横坐标以“镁离子总浓度(葡萄糖酸镁百分比)”的方式标注。
[0112]
图6、葡萄糖酸镁、谷氨酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。横坐标标记为“组别-镁离子浓度值”，其中镁离子浓度值以mm为单位。gluconate组由葡萄糖酸镁提供外源镁离子。bc为空白对照。pc为阳性对照，采用谷氨酸镁提供外源镁离子。
[0113]
图7、葡萄糖酸镁、谷氨酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。横坐标标记为“组别-镁离子浓度值”，其中镁离子浓度值以mm为单位。gluconate组由葡萄糖酸镁提供外源镁离子。bc为空白对照。pc为阳性对照，采用谷氨酸镁提供外源镁离子。
[0114]
图8、葡萄糖酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。外源镁离子构成见实施例7的表4。
[0115]
图9、葡萄糖酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。横坐标标记为“组别-镁离子浓度值”，其中镁离子浓度值以mm为单位。bc为空白对照。gluc组、ace组、glut组分别由葡萄糖酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁提外源镁离子。
[0116]
图10、葡萄糖酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响(3h)。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。gluc组、ace组、glut组分别由葡萄
糖酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁提外源镁离子。
[0117]
图11、葡萄糖酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响(20h)。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。gluc组、ace组、glut组分别由葡萄糖酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁提外源镁离子。
[0118]
图12、葡萄糖酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。外源镁离子的构成见实施例10的表5。
[0119]
图13、葡萄糖酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。外源镁离子的构成见实施例11的表6。
[0120]
图14、葡萄糖酸镁、醋酸镁、谷氨酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。外源镁离子的构成见实施例12的表7。
[0121]
图15、葡萄糖酸镁、天门冬氨酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。横坐标以“镁离子总浓度(葡萄糖酸镁百分比)”的方式标注。
[0122]
图16、葡萄糖酸镁、天门冬氨酸镁、醋酸镁浓度对体外无细胞蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响。外源蛋白megfp的合成量以rfu值指示。横坐标以“镁离子总浓度(葡萄糖酸镁百分比)”的方式标注。
[0123]
核苷酸和/或氨基酸序列表
[0124]
seq id no.:1，外源蛋白megfp的基因序列，长度为714个碱基。
[0125]
seq id no.:2，外源蛋白megfp的氨基酸序列，共238个氨基酸。
具体实施方式
[0126]
本发明术语、名词、短语的含义。
[0127]
本部分的含义解释适用于本发明的全文，既适用于下文，也适用于上文。本发明中涉及引用文献时，相关术语、名词、短语在引用文献中的定义也一并被引用，但是，与本发明中的定义相冲突时，以本发明中的定义为准。在引用文献中的定义与本发明中的定义发生冲突时，并不影响所引用的成分、物质、组合物、材料、体系、配方、种类、方法、设备等以引用文献中确定的内容为准。
[0128]
体外蛋白合成反应，是指在体外无细胞合成体系中合成蛋白的反应，至少包括翻译过程。包括但不限于ivt反应(体外翻译反应)、ivtt反应(体外转录翻译反应)、ivdtt反应(体外复制转录翻译反应)。本发明中，优选ivtt反应。ivtt反应，对应ivtt体系，是在体外将dna转录翻译为蛋白质(protein)的过程，因此，我们还将这类的体外蛋白合成体系称为d2p体系、d-to-p体系、d_to_p体系、dna-to-protein体系；相应的体外蛋白合成方法，还称为d2p方法、d-to-p方法、d_to_p方法、dna-to-protein方法。
[0129]
d2p，dna-to-protein，从dna模板到蛋白质产物。比如，d2p技术、d2p体系、d2p方法、d2p试剂盒等等。
[0130]
mr2p，mrna-to-protein，从mrna模板到蛋白质产物。比如，mr2p技术、mr2p体系、mr2p方法、mr2p试剂盒等等。
[0131]
ivtt，in vitro transcription translation，体外转录翻译。
[0132]
ivdtt，in vitro duplication transcription translation，体外复制转录翻
译。
[0133]
cfps体系：cell-free protein synthesis system，无细胞蛋白合成体系。
[0134]
cfps(mg )体系，本发明的“含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系”的一种简记方式。
[0135]
cfps(mg-)体系，指所述cfps(mg )体系中除外源镁离子以外的其它组分构成的体系。
[0136]
cfps(mgp-)体系，指所述cfps(mg )体系中除葡萄糖酸镁以外的其它组分构成的体系。
[0137]“无细胞体系”，是指进行体外蛋白合成时，并非通过完整细胞分泌表达的方式。需要说明的是，本发明的体外无细胞蛋白合成体系中，也允许添加细胞组分以促进反应，但所添加的细胞不以分泌表达外源靶蛋白(exogeneous target protein，外源目的蛋白)为主要目的。此外，在本发明指导下构建的无完整细胞的cfps体系中，有意地添加少量完整细胞(例如，其提供的蛋白含量与细胞提取物提供的蛋白含量相比，不超过30wt％)，这样的“规避”方式，也囊括在本发明的保护范围之内。
[0138]“本发明的表达系统”、“本发明的体外表达系统”、“体外无细胞表达系统”、“体外无细胞表达体系”可互换使用，均指本发明的体外蛋白表达体系，也可采用其它描述方式，如：蛋白质体外合成系统、体外蛋白合成体系、无细胞系统、无细胞体系、无细胞蛋白合成体系、无细胞体外蛋白合成体系、体外无细胞蛋白合成体系、体外无细胞合成体系、cfs体系(cell-free system)、cfps体系(cell-free protein synthesis system)等描述方式。根据反应机理，可包括体外翻译体系(可简记为ivt体系，一种mr2p体系)、体外转录翻译体系(可简记为ivtt体系，一种d2p体系)、体外复制转录翻译体系(可简记为ivdtt体系，一种d2p体系)等。本发明中，优选ivtt体系。我们还将体外蛋白合成系统称为“蛋白质合成工厂”(“protein factory”或“proteinfactory”)。本发明提供的体外蛋白合成系统，对其组分是采用开放式的描述方式的。
[0139]
体外蛋白合成反应混合物，也描述为反应混合物、反应混合体系、体外蛋白合成反应混合体系，指包括体外蛋白合成体系、编码外源蛋白的核酸模板的混合体系；可以是均质的，也可以是非均质的，允许是溶液、乳浊液、悬浊液等液态体系。
[0140]
镁源：本发明的外源镁离子的镁源，通过负价部分进行分类，所述负价部分包括但不限于负价基团、负价离子。如无特别说明，对镁原子和负价部分之间的比例没有特别限制。比如，本发明中“天门冬氨酸镁”，限定了镁源由天门冬氨酸的残基(具体地为羧基)提供负价部分，对其与镁之间的螯合比例没有特别限定，比如，可以是一个镁原子螯合两个天门冬氨酸分子，也可以通过分子内螯合，使一个镁原子与一个天门冬氨酸分子螯合；而且，对与镁离子络合/结合/螯合的部位没有特别限定，可以是α位羧基，也可以是ε位羧基，还可以为两者的组合。又比如，二谷氨酸镁则是明确限定了一个镁原子螯合两个谷氨酸分子。此外，对于镁源是否带有结合水也不做限定。本发明对外源镁离子的定量，是通过对镁原子的含量进行控制的。
[0141]
rfu，相对荧光单位值(relative fluorescence unit)。
[0142]
egfp：增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein)。
[0143]
megfp：egfp的a206k突变体。
[0144]
mol％：摩尔百分比，表示物质的量所占百分比。
[0145]
wt％或％(wt)：为质量浓度单位，均表示质量百分比。
[0146]
(v/v)％或％(v/v)：均表示体积百分比。
[0147]
％(w/v)：质量体积浓度单位，对应于g/100ml。
[0148]
本发明中，“蛋白”与“蛋白质”具有相同含义，均译为protein，可以互换使用。
[0149]
本发明中，“系统”和“体系”，均译为system，可以互换使用。
[0150]
本发明中，“蛋白合成量”、“蛋白表达量”与“蛋白表达产量”具有相同含义，可互换使用。
[0151]
本发明中，细胞提取物、细胞提取液、细胞裂解物、细胞破碎物、细胞溶解产物的含义相同，可以互换使用，英文可采用cell extract、cell lysate等描述方式。
[0152]
本发明中，能量体系、能量系统、能量供应体系具有同等含义，可互换使用。能量再生体系、能量再生系统具有同等含义，可互换使用。能量再生系统是能量系统的优选实施方式或者组成部分。
[0153]
翻译后修饰：也称翻译后加工，post-translational modification，ptm。ptm系统对于蛋白质的正常折叠、活性和稳定性具有重大作用。
[0154]
本发明中，“翻译相关元件”，指从核酸模板到蛋白质产物合成过程中所需的相关功能元件，不局限于翻译过程需要的功能元件；当核酸模板为dna时，还广义地包括转录过程中需要的功能元件。所述翻译相关元件，可通过细胞提取物(各种内源性因子)、体外蛋白合成体系的其它外源添加组分(如外源rna聚合酶、trna、核糖体、其它翻译相关酶、起始因子、延伸因子、终止因子等翻译相关元件，或其组合)、核酸模板上的功能元件(如控制外源蛋白转录/翻译的功能元件、抗性基因翻译系统、lac抑制子翻译系统、控制质粒拷贝数的翻译系统等)等方式提供。所述控制外源蛋白转录/翻译的功能元件，举例如启动子、终止子、增强子、ires元件、kozak序列、其它调节翻译水平的元件、信号序列、前导序列、功能标签(如筛选标记标签、增强翻译水平的标签)等。
[0155]
dna扩增相关元件，至少包括dna聚合酶。依据不同的扩增机理，还可以包括诸如解旋酶(hda扩增)、重组酶和单链dna结合蛋白(rpa扩增)、等其它因子。
[0156]
基因：包括编码区和非编码区。
[0157]
核苷酸序列：由核苷酸单元构成的序列。
[0158]
核酸序列：核酸物质的序列，包括dna序列、rna序列。
[0159]
编码序列：coding sequence，缩写为cds。与蛋白质的密码子完全对应的核苷酸序列，该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列(不考虑mrna加工等过程中的序列变化)。
[0160]
编码基因：编码蛋白质的有效基因片段，可以为连续的，也可以为不连续的。编码基因中必然包括编码序列。
[0161]
核酸模板：也称为遗传模板，指作为蛋白合成模板的核酸序列，包括dna模板、mrna模板及其组合。本发明的任一个实施方式中，所述核酸模板各自独立地可以为dna模板、mrna模板或其组合。本发明的任一个实施方式中，所述核酸模板可各自独立地优选为dna模板。本发明中，如无特别说明，编码外源蛋白的核酸模板优选为dna模板。
[0162]“编码x蛋白的核酸模板”指核酸模板中含有该x蛋白的编码序列，以该核酸模板为基础可以经至少翻译过程(还比如经过转录翻译过程)合成x蛋白，而且允许该核酸模板中
binding protein,mbp)等。
[0174]
同源性(homology)，如没有特别说明，指具有至少50％同源性；优选至少60％同源性，更优选至少70％同源性，更优选至少75％同源性，更优选至少80％同源性，更优选至少85％同源性，更优选至少90％同源性；还比如至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的同源性。描述对象举例如本发明书提及的ω序列的同源序列。
[0175]“变体”，variant，指具有不同结构(包括但不限于进行微小变异)，但仍能保持或基本保持原有功能或性能的物质。所述变体包括但不限于核酸变体、多肽变体、蛋白变体。获得相关变体的方式包括但不限于结构单元的重组、删除或缺失、插入、移位、置换等。所述变体包括但不限于经修饰的产物、基因改造产物、融合产物等。为获得基因改造产物，进行基因改造的方式包括但不限于基因重组(对应基因重组产物)、基因删除或缺失、插入、移码、碱基置换等。基因突变产物，也称为基因突变体，属于基因改造产物的一种类型。
[0176]
经修饰的产物：包括但不限于化学修饰产物、氨基酸修饰物、多肽修饰物、蛋白修饰物等。所述化学修饰产物指采用有机化学、无机化学、高分子化学等化学合成方法进行改造的产物。修饰方法举例如离子化、盐化、脱盐化、络合、解络合、螯合、解螯合、加成反应、取代反应、消除反应、插入反应、氧化反应、还原反应、翻译后修饰等修饰方法，具体举例如氧化、还原化、甲基化、去甲基化、氨基化、羧基化、硫化等修饰方法。
[0177]“突变体”，mutant，本发明中如无特别说明，指仍能保持或基本保持原有功能或性能的突变产物，对突变位点的数量没有特别限制。所述突变体包括但不限于基因突变体、多肽的突变体、蛋白的突变体。突变体是变体的一种类型。获得相关突变体的方式包括但不限于结构单元的重组、删除或缺失、插入、移位、置换等。基因的结构单位为碱基，多肽和蛋白的结构单元为氨基酸。基因突变的类型包括但不限于基因删除或缺失、插入、移码、碱基置换等。
[0178]
氨基酸混合物，指含有至少两种氨基酸的混合物。
[0179]
本发明中，如无特别说明，所述氨基酸可以为天然氨基酸，也可以为非天然氨基酸，可以为
l-氨基酸、
d-氨基酸或者其组合，还可以为放射性同位素标记的氨基酸、经修饰的氨基酸等结构。所述经修饰的氨基酸，指连接有化学修饰基团的氨基酸，其结构没有特别限制，包括但不限于通过氨基酸侧基进行修饰。上述氨基酸的定义范围涵盖本发明中任一种包括氨基酸单元的物质，包括但不限于：多肽及其衍生物、蛋白及其衍生物、多肽标签、蛋白标签、多肽序列、蛋白序列、氨基酸修饰物、多肽修饰物、蛋白修饰物、前述任一种的部分结构域、前述任一种的亚基或片段(包括前述任一种的结构域)、前述任一种的变体(包括前述任一种的结构域、亚基、片段的变体)。所述“前述任一种的变体”包括但不限于“前述任一种的突变体”。本发明中，对于表示手性类型的“l
-”
、“d
-”
，下标形式与非下标形式具有相同含义。
[0180]
拥挤剂，crowding agent，用于在体外模拟细胞内拥挤的大分子环境的试剂。参考文献“x ge,d luo and j xu.cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions[j].plos one,2011,6(12):e28707”及其引用文献等。
[0181]
蔗糖聚合物：指含有至少2个蔗糖单元的聚合物。包括但不限于聚蔗糖。
[0182]
ficoll蔗糖聚合物：如无特别说明，特指试剂，一种非离子型合成蔗糖聚合
物，是由蔗糖和环氧氯丙烷共聚而成的一种高度分支化的聚合物，可选自市售产品。举例如ficoll-400(聚蔗糖400，cas:26873-85-8)、ficoll-70(聚蔗糖70，cas：72146-89-5)。其中，pm 400(sigma aldrich)是由蔗糖和环氧氯丙烷共聚而成的一种高度分支化的聚合物，平均分子量400kg/mol；ficoll pm 70(sigma aldrich)的平均分子量为70kg/mol。
[0183]
磷酸化合物，包括有机物和无机物。
[0184]
磷酸盐，如无特别说明，指无机磷酸盐。
[0185]
本发明中，“常温”优选室温至37℃，具体地，优选20～37℃，更优选25～37℃。
[0186]
本发明中，“优选”、“较佳”、“更佳”、“最优选”等优选实施方式，并非用于限定本发明的实施方式，仅用于提供技术效果更好的实施方式的举例。
[0187]
本发明的描述中，对于“优选之一”、“优选方式之一”、“优选实施方式之一”、“优选例之一”、“优选例”、“在一优选的实施方式中”、“优选为”、“优选”、“优选地”、“更优选”、“更优地”、“进一步优选”、“最优选”等优选方式，以及“实施方式之一”、“方式之一”、“示例”、“具体示例”、“举例如”、“作为举例”、“例如”、“比如”、“如”等示意的列举方式，各方式所描述的具体特征包含于本发明的至少一个具体实施方式中。本发明中，各方式所描述的具体特征可以在任何的一个或者多个具体实施方式中以合适的方式结合。本发明中，各优选方式对应的技术方案也可以通过任意合适的方式结合；举例如，可以同时加入外源rna聚合酶、外源dna聚合酶，参考专利类文献cn108642076a。
[0188]
本发明中，“可选地”，表示可以有，也可以无。以是否适合相应的体系为选择依据。
[0189]
本发明中，“其任意组合”，在数量上表示“大于1”，在涵盖范围上表示以下情形构成的组：“任选其中一个，或者任选其中至少两个构成的组”。
[0190]
本发明中，“一个或多个”、“一种或多种”、“一种或多种或全部”等“一或多”的描述，与“至少一个”、“至少一种”、“或其组合”、“及其组合”、“或其任意组合”、“及其任意组合”等具有相同含义，可以互换使用，表示数量上表示“等于1或大于1”。
[0191]
本发明中，采用“或/和”、“和/或”表示“任选其一或者任选其组合”，也表示至少其一。举例如“包括合成rna的底物和/或合成蛋白的底物”，表示可以仅包括合成rna的底物，可以仅包括合成蛋白的底物，还可以同时包括合成rna的底物和合成蛋白的底物。
[0192]
本发明所述的“通常”、“常规”、“一般”、“经常”、“往往”等方式描述的现有技术手段，也都被引用作为本发明内容的参考，如无特别说明，可视为本发明的优选方式之一。
[0193]
在本发明提及的所有文献及这些文献直接引用或者间接引用的文献，都在本技术中被引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。
[0194]
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(包括但不限于实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案，只要能够体外合成外源蛋白或者优选地高效合成外源蛋白即可。限于篇幅，不再一一累述。
[0195]
1.本发明第一方面提供一种含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系，所述“含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系”本发明中也简记为“cfps(mg )体系”，包括外源镁离子；所述外源镁离子来自一种或多种供源，至少包括葡萄糖酸镁。所述cfps(mg )体系能够与编码外源蛋白的核酸模板共同提供合成外源蛋白所需的翻译相关元件。
[0196]
所述cfps(mg )体系能够与所述编码外源蛋白的核酸模板进行体外蛋白合成反应，从而表达外源蛋白。
[0197]
优选地，所述cfps(mg )体系含有能够识别核酸模板中启动子元件的体系组分，使得所述cfps(mg )体系能够识别编码外源蛋白的核酸模板的启动子元件。
[0198]
通过能够实现“表达外源蛋白”的技术功能的限定，本发明仅涵盖那些能够实现上述功能的技术特征的组合方式，不能实现上述功能的技术特征的组合方式当然地被排除在本发明范畴之外。也即，所述cfps(mg )体系首先应当是一个可工作的体系，是一个能够表达外源蛋白的体系。
[0199]
1.1.含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(cfps(mg )体系)
[0200]
本发明的体外蛋白合成反应，在含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系中进行。
[0201]
所述cfps(mg )体系能够提供体外合成蛋白过程所需的各种因子。可通过细胞提取物的方式集成式地提供，也可通过分别添加的方式提供(如日本的pure系统，比如purexpress试剂盒)。
[0202]
所述cfps(mg )体系的各组分的种类和含量，没有特别限制，只要所构成的体系能够与编码外源蛋白的核酸模板进行反应合成外源蛋白即可，并且优选那些能够高效表达外源蛋白的组合方式。而那些因为某些组分浓度过低或过高，而导致不能表达外源蛋白的组合方式，当然地被排除在本发明范畴之外。
[0203]
所述cfps(mg )体系的各组分的加入顺序没有特别限制。
[0204]
所述cfps(mg )体系的各组分的浓度，如无特别说明，指在体外蛋白合成反应混合物中的起始浓度。
[0205]
优选地，所述cfps(mg )体系含有能够识别核酸模板上的启动子元件的体系组分，例如与启动子元件相应的rna聚合酶。
[0206]
所述能够识别核酸模板中启动子元件的体系组分(例如相应的rna聚合酶)，可以由体系中的细胞提取物提供，也可以通过外源添加方式提供，还可以通过前述两种方式的组合方式提供。
[0207]
实施方式之一，所述cfps(mg )体系包括细胞提取物、外源镁离子(至少包括葡萄糖酸镁)。
[0208]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系至少包括细胞提取物。所述细胞提取物旨在提供用于蛋白转录翻译的结构或生物因子。所述细胞提取物的选取标准为：能够以编码外源蛋白的核酸模板为基础，经体外蛋白合成反应合成外源蛋白。本发明的细胞提取物来源可以为野生型，也可以为非野生型。非野生型的改造方式包括但不限于基因改造型。本发明的细胞提取物优选地来源于真核细胞，更优选来源于酵母细胞，更优选来源于乳酸克鲁维酵母细胞。
[0209]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括细胞提取物，所述细胞提取物中含有内源性表达的、与核酸模板上启动子元件相对应的rna聚合酶。具体地例如，乳酸克鲁维酵母细胞提取物中含有内源性表达的t7 rna聚合酶，能够识别核酸模板上的t7启动子。
[0210]
优选方式之一，采用日本科学家开发的pure系统(protein synthesis using recombinant elements(pure)system)分别提供体外合成蛋白过程所需的各种因子，并非通过细胞提取集成式地提供各种因子。参考“lu,y.advances in cell-free biosynthetic technology.current developments in biotechnology and bioengineering,2019,
chapter 2,23-45.”、“y shimizu,a inoue,y tomari,et al.cell-free translation reconstituted with purified components[j].nature biotechnology,2001,19(8):751-755”等文献及其引用文献中有关pure系统的介绍。
[0211]
本发明的体外无细胞蛋白合成体系包括外源镁离子，该cfps(mg )体系至少包括葡萄糖酸镁；优选至少25mol％，更优选至少30mol％，更优选至少40mol％，更优选至少50mol％所述外源镁离子由葡萄糖酸镁提供。
[0212]
体外合成蛋白的过程至少包括翻译过程，还可选地包括转录过程。
[0213]
将dna转化为mrna的转录过程离不开rna聚合酶。此时，对应的所述cfps(mg )体系，优选地还包括rna聚合酶，所述rna聚合酶的来源可以选自：内源性表达的rna聚合酶(经由细胞提取物提供)、外源添加的rna聚合酶、编码rna聚合酶的外源核酸模板的翻译产物，及其组合。
[0214]
所述内源性表达的rna聚合酶不独立添加，而是存在于细胞提取物中。
[0215]
为了实现所述细胞提取物中含有内源性表达的rna聚合酶，优选地将rna聚合酶的编码序列/编码基因整合入制备细胞提取物的宿主细胞内；具体地优选通过以下方式实现：将rna聚合酶的编码序列/编码基因插入到细胞内游离质粒、或者将rna聚合酶的编码基因整合到细胞基因组、或者采用前述两种方式的组合方式进行菌株改造，然后制备细胞提取物。所述将rna聚合酶的编码序列/编码基因整合到细胞基因组的方式包括但不限于：插入到细胞基因组、原位替换基因组的部分基因、及其组合方式。
[0216]
所述外源添加的或内源性表达的rna聚合酶各自独立地优选t7 rna聚合酶。
[0217]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括dna聚合酶，所述dna聚合酶的来源可以选自：内源性表达的dna聚合酶(经由细胞提取物提供)、外源添加的dna聚合酶、编码dna聚合酶的外源核酸模板的翻译产物，及其组合。
[0218]
所述cfps(mg )体系，可选地包括外源性rna聚合酶或/和编码rna聚合酶的核酸模板。
[0219]
所述cfps(mg )体系，可选地包括外源性dna聚合酶或/和编码dna聚合酶的核酸模板。
[0220]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括外源性rna聚合酶、外源性dna聚合酶。参考文献cn108642076a。
[0221]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括能量系统。
[0222]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括合成rna的底物。
[0223]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括合成蛋白的底物。
[0224]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括dna聚合酶、合成dna的底物。
[0225]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系，包括细胞提取物、外源镁离子(至少包括葡萄糖酸镁)、能量系统、合成rna的底物、合成蛋白的底物。
[0226]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系，包括细胞提取物、外源镁离子(至少包括葡萄糖酸镁；优选之一为葡萄糖酸镁)、能量系统、合成蛋白的底物、rna聚合酶(包含于细胞提取物，或者独立地外源添加)、合成rna的底物。
[0227]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系，包括细胞提取物、葡萄糖酸镁、能量系统、合成蛋白的底物、rna聚合酶(包含于细胞提取物，或者独立地外源添加)、合成rna的底物、dna
聚合酶(包含于细胞提取物，或者独立地外源添加)、合成dna的底物。
[0228]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系，包括乳酸克鲁维酵母细胞提取物(含有内源性表达的t7 rna聚合酶)、葡萄糖酸镁、能量系统、合成rna的底物、合成蛋白的底物。
[0229]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系，包括乳酸克鲁维酵母细胞提取物(宿主细胞未内源性整合rna聚合酶的编码基因)、葡萄糖酸镁、能量系统、外源rna聚合酶、合成rna的底物、合成蛋白的底物。
[0230]
所述cfps(mg )体系还可选地包括以下至少一种外源添加组分：翻译相关元件、dna扩增相关元件、rna扩增相关元件、rna酶抑制剂、拥挤剂、钾离子、抗氧化剂或还原剂、防冻剂、海藻糖、反应促进剂、消泡剂、烷烃、缓冲剂、水性溶剂。
[0231]
1.1.1.外源镁离子
[0232]
本发明的体外无细胞蛋白合成体系包括外源镁离子，构成cfps(mg )体系。
[0233]
所述外源镁离子的供源，至少包括葡萄糖酸镁。
[0234]
所述外源镁离子的供源，还可选地来自以下组：天门冬氨酸镁(
l-型、
d-型或其组合，优选
l-型)、醋酸镁、谷氨酸镁(
l-型或
d-型或其组合，优选
l-型)、氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、柠檬酸镁、磷酸氢镁、碘化镁、乳酸镁、硝酸镁、草酸镁、及其组合。
[0235]
本发明中，如无特别说明，“镁离子源”特指“外源镁离子的供源”。
[0236]
优选方式之一，镁离子源包括葡萄糖酸镁，还包括天门冬氨酸镁(独立地优选l-天门冬氨酸镁)、谷氨酸镁(独立地优选l-谷氨酸镁)、醋酸镁中任一种、任两种或者三种。
[0237]
优选方式之一，镁离子源为葡萄糖酸镁、天门冬氨酸镁(独立地优选l-天门冬氨酸镁)、谷氨酸镁(独立地优选l-谷氨酸镁)的组合。更优选之一，镁离子源为葡萄糖酸镁、l-天门冬氨酸镁和l-谷氨酸镁的组合。
[0238]
优选方式之一，镁离子源为葡萄糖酸镁、天门冬氨酸镁(优选l-天门冬氨酸镁)的组合。
[0239]
能够提高外源蛋白合成量的葡萄糖酸镁用量(q
mgp
)，根据y
prt
(c
mgp
)曲线中的外源蛋白表达量确定，选自y
prt
(c
mgp
)曲线中外源蛋白表达量大于y0时的用量区间。所述y
prt
(c
mgp
)曲线可以通过预实验获得。
[0240]
所述q
mgp
优选选自外源蛋白表达量至少为y0 50％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0241]
所述q
mgp
更优选选自外源蛋白表达量至少为y0 60％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0242]
所述q
mgp
更优选选自外源蛋白表达量至少为y0 70％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0243]
所述q
mgp
更优选选自外源蛋白表达量至少为y0 80％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0244]
所述q
mgp
更优选选自外源蛋白表达量至少为y0 90％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0245]
所述q
mgp
更优选选自外源蛋白表达量至少为y0 95％y
δ
时的葡萄糖酸镁用量区间；
[0246]
更优选地，所述q
mgp
采用外源蛋白最高表达量时的葡萄糖酸镁用量c
max
。
[0247]
优选地，所述q
mgp
、c
mgp
、c
max
采用相同的表征方式，比如均采用浓度方式表征，或均采用质量方式表征，或均采用摩尔量方式表征。比如，以浓度方式表征葡萄糖酸镁用量(c
mgp
)，分别向cfps(mgp-)体系中添加不同量的葡萄糖酸镁，获得一系列具有不同葡萄糖酸镁浓度的cfps(mg )体系；进行体外蛋白合成反应，经测试得到外源蛋白表达量(y
prt
)，可获得外源蛋白表达量(y
prt
)和葡萄糖酸镁添加浓度(c
mgp
)之间的关系曲线(y
prt
(c
mgp
)曲线)；从曲线中确定外源蛋白的最高表达量(y
max
)时对应的葡萄糖酸镁添加浓度(c
max
)，进而以浓度
表征方式，确定本发明保护的能够提高外源蛋白表达量的葡萄糖酸镁用量(q
mgp
)的浓度方式的用量区间。
[0248]
本发明中，对于葡萄糖酸镁的用量，优选地以外源试剂的添加量进行计量和控制。
[0249]
对于外源蛋白表达量(y
prt
)，可以任选合适的测定方法，可以任选合适的表征方式。测定蛋白表达量的方法包括但不限于紫外吸收法、双缩脲法、bca方法、lowry法、考马斯亮蓝法、凯氏定氮法等。可以采用不同的表征方式来指示蛋白的浓度、质量或物质的量，比如，包括但不限于荧光类蛋白的吸光度值(od值)、荧光类蛋白的相对荧光单位值(rfu值)等。
[0250]
本发明中优选采用浓度方式表征葡萄糖酸镁的用量。
[0251]
实施方式之一，采用具有增强绿色荧光蛋白的突变体megfp或其融合蛋白作为外源蛋白(prt)，其中的megfp部分可发荧光；体外蛋白合成反应结束后，采用紫外吸收法，在激发波长488nm、发射波长507nm的条件下，测试溶液样品的rfu值。含有megfp结构的外源蛋白产物的表达量(y
prt
)，可以根据以下的公式换算得到：其中，rfu为相对荧光单位值读数，c
prt
为外源蛋白产物的浓度(单位μg/ml)，m
megfp
为megfp荧光蛋白结构的相对分子量，m
prt
为外源蛋白产物的相对分子量。在常规的测试范围内，c
prt
与rfu之间能够基本符合线性关系。当直接采用megfp作为外源蛋白时，m
prt
与m
megfp
相等，如实施例3-15。再结合外源蛋白产物的溶液体积，可以计算得到外源蛋白产物的质量和摩尔量。
[0252]
优选方式之一，所述葡萄糖酸镁用量的确定方法为：所述cfps(mg )体系组分的种类和含量均确定时，在较宽泛的浓度范围内调整葡萄糖酸镁用量，在指定的反应条件下(反应温度、反应时间等)，外源蛋白表达量最高时的葡萄糖酸镁用量c
max
，即为该技术方案下葡萄糖酸镁的最适用量。
[0253]
所述y
prt
(c
mgp
)曲线，q
mgp
，c
mgp
，y
prt
，y
max
，c
max
，y0，y
δ
的定义与上述一致。
[0254]
优选方式之一，由葡萄糖酸镁提供至少25mol％所述外源镁离子。
[0255]
优选方式之一，由葡萄糖酸镁提供至少30mol％所述外源镁离子。
[0256]
优选方式之一，由葡萄糖酸镁提供至少40mol％所述外源镁离子。
[0257]
优选方式之一，由葡萄糖酸镁提供至少50mol％所述外源镁离子。
[0258]
优选方式之一，由葡萄糖酸镁提供至少80mol％所述外源镁离子。
[0259]
优选方式之一，由葡萄糖酸镁提供至少90mol％所述外源镁离子。
[0260]
优选方式之一，由葡萄糖酸镁提供100mol％所述外源镁离子。
[0261]
葡萄糖酸镁提供的外源镁离子占总的外源镁离子的摩尔百分比，举例如下述浓度值中的任一种百分比数值，或者下述任两个百分比数值之间的数值范围(所述数值范围包括两个端点)：25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
[0262]
优选实施方式之一，外源镁离子的浓度为0.1～50mm。
[0263]
另优选实施方式之一，外源镁离子的浓度为0.5～20mm。
[0264]
另优选实施方式之一，外源镁离子的浓度为1～10mm。
[0265]
另优选实施方式之一，外源葡萄糖酸镁的浓度为0.1～50mm，更优选为0.5～20mm，进一步优选为1～10mm。
[0266]
所述葡萄糖糖酸镁提供的外源镁离子的浓度，举例如下述任一种浓度，或者下述任两种浓度值之间的浓度范围(所述浓度范围包括两个端点)：0.1mm、0.5mm、1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm、5mm、5.5mm、6mm、6.5mm、7mm、7.5mm、8mm、8.5mm、9mm、9.5mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm、22mm、24mm、25mm、28mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、60mm、70mm、80mm。
[0267]
本发明的保护范围仅涵盖那些能够提高外源蛋白表达量的葡萄糖酸镁用量所对应的技术方案。本发明中，对于任一种体系配方的cfps(mg )体系，仅要求存在至少一个葡萄糖酸镁用量值能够提高外源蛋白表达量，而不要求所有的葡萄糖酸镁用量值均起到提升作用。
[0268]
1.1.2.细胞提取物
[0269]
所述细胞提取物应当能够表达编码外源蛋白的核酸模板，也即能够以所述编码外源蛋白的核酸模板为模板合成其编码的外源蛋白。
[0270]
所述细胞提取物旨在提供用于蛋白表达(比如转录、翻译)的结构因子或/和生物因子。
[0271]
细胞提取物可以提供合成外源蛋白所需的许多关键的翻译相关元件；这是内源性的提供方式。
[0272]
所述细胞提取物，包括酵母细胞提取物，典型地用于提供核糖体、转运rna(trna)、氨酰trna合成酶、蛋白质合成所需的起始因子和延伸因子以及终止释放因子等物质，还可以经菌株改造后内源性地提供聚合酶(rna聚合酶和/或dna聚合酶)等其它酶物质。
[0273]
所述细胞提取物原则上不含有完整的细胞，这是因为细胞提取物的制备方法含有破碎细胞的步骤(也称为破细胞处理、裂解步骤等)。相较于传统的由完整细胞分泌表达蛋白的合成方式，由此构建的体外蛋白合成体系被称为无细胞体系。
[0274]
细胞提取物中还可以含有一些源自细胞的细胞质中的其它蛋白，尤其是可溶性蛋白。
[0275]
优选地，所述细胞提取物含有蛋白合成所需的各种因子。
[0276]
上述细胞提取物提供的各种蛋白类因子，相关的编码基因可以天然存在于细胞基因组中，也可以将相关编码基因整合到细胞的基因组中(整合到染色体)，还可以将相关的基因或基因片段或编码序列插入到细胞内游离质粒中。以rna聚合酶、dna聚合酶为例进行说明，优选方式之一，所述细胞提取物中含有内源性表达的rna聚合酶和/或dna聚合酶。
[0277]
所述cfps(mg )体系可选地包括纯化的翻译相关元件。当细胞提取物不足以提供合成外源蛋白所需的所有翻译相关元件时(种类不足和/或含量不足)，还可以通过外源添加的方式加入所缺失的翻译相关元件。特别是为了表达异源蛋白，而来源菌株的内源分泌产物又缺失某种成分时，就可以通过外源添加方式进行补充。比如，所述纯化的翻译相关元件，包括但不限于，可以选自下组中任一种或者其组合：trna、核糖体、其它翻译相关酶、起始因子、延伸因子、终止因子。所述翻译相关酶包括但不限于各种氨酰trna合成酶、肽基转移酶等。
[0278]
针对细胞提取物的来源细胞，将异源蛋白的编码序列或编码基因进行内源性整
合，可以使改造后的菌株内源性表达异源蛋白，所述异源蛋白可以包括但不限于：rna聚合酶、dna聚合酶等。将异源蛋白的编码序列或编码基因进行内源性整合的方法可以参考包括但不限于文献cn109423496a、cn10697843a、cn2018116198190、“molecular and cellular biology,1990,10(1):353-360”等现有文献及其引用文献提供的方法，具体地，包括但不限于：将编码序列插入到游离型细胞内质粒、将编码基因插入到细胞基因组、用编码基因原位替代细胞基因组的部分基因等方式、及其组合方式。
[0279]
优选方式之一，所述细胞提取物的来源细胞内源性整合有rna聚合酶的编码基因，可以内源性表达rna聚合酶，能够在不添加外源性rna聚合酶的情形下，进行体外无细胞蛋白合成，取代外源添加模式，简化配方，提高操作便捷性，节约成本。所述内源性整合rna聚合酶的实现方式包括但不限于：将rna聚合酶的编码基因插入到细胞质粒或者插入到细胞基因组、用rna聚合酶的编码基因原位替换基因组的部分基因或序列(也即包括敲除原有部分基因或序列的步骤)、敲除原有部分基因并插入rna聚合酶的编码基因、及其组合。进一步优选地，所述细胞提取物的来源是酵母。更进一步优选地，所述细胞提取物的来源是乳酸克鲁维酵母。实施例2-15中，将t7 rna聚合酶的编码基因整合到了乳酸克鲁维酵母细胞的基因组中，该乳酸克鲁维酵母细胞内源性表达t7 rna聚合酶，以此制备的细胞提取物含有内源性表达的t7 rna聚合酶，体外无细胞蛋白合成体系没有再额外添加rna聚合酶。另外的一些具体实施方式中，还将rna聚合酶的编码序列插入到乳酸克鲁维酵母的细胞内游离质粒中，进而制备细胞提取物。具体参照cn109423496a的制备方法。
[0280]
还可以采用其它的基因改造方法对来源细胞进行改造，以提高细胞提取物的活力，更好地促进体外蛋白合成，如cn2018116083534、cn2019107298813、cn108949801a的基因敲除方法，如cn2018112862093的基因改造方法等。
[0281]
所述细胞提取物的制备方法可以采用已报道的技术手段。简要概括而言，通常可包括以下步骤：提供足量细胞，用液氮将细胞速冻，破碎细胞，离心收集上清液，即获得细胞提取物。参考cn106978349a、cn108535489a、cn108642076a、cn109593656a、cn109971783a等文献。可对种子细胞进行发酵培养，离心，去除培养液，收集到足量细胞，进而制备细胞提取物。
[0282]
采用本发明提供的方法制备的细胞提取物可以使体外蛋白合成反应正常进行，含有具备氨基酸转运功能的trna、氨酰trna合成酶等蛋白合成所需的必要组分。在一些实施例中，所述细胞提取物为酵母细胞提取物，采用包括以下步骤的方法制备：(i)提供来源细胞；(ii)对酵母细胞进行洗涤处理，获得经洗涤的酵母细胞；(iii)对经洗涤的酵母细胞进行破细胞处理，从而获得酵母粗提物；和(iv)对所述酵母粗提物进行固液分离，收集的上清液部分即为细胞提取物。所述酵母细胞提取物，优选地为乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
[0283]
在本发明中，所述细胞提取物中所含蛋白含量的优选方式之一为20～100mg/ml。另优选方式之一为20～50mg/ml。另优选方式之一为50～100mg/ml。另优选方式之一为25mg/ml、30mg/ml、35mg/ml、40mg/ml、45mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml中任一种浓度，或者任两种浓度之间的浓度范围(包括两个端点)。测定蛋白含量的方法包括但不限于紫外吸收法、双缩脲法、bca方法、lowry法、考马斯亮蓝法、凯氏定氮法等。优选方式之一，所述测定蛋白含量的方法为考马斯亮蓝测定方法。
[0284]
所述细胞提取物在体外蛋白合成反应混合物中的浓度没有特别限制。可以采用体
积比，也可采用重量比；如无特别说明，指最终的体积比。优选实施方式之一，细胞提取物的浓度为20％～80％(v/v)；另一优选实施方式，细胞提取物的浓度为20％～70％(v/v)；另一优选实施方式，细胞提取物的浓度为30％～60％(v/v)；另一优选实施方式，细胞提取物的浓度为40％～50％(v/v)；另一优选实施方式，细胞提取物的浓度为80％(v/v)；均以所述体外无细胞蛋白合成体系的总体积计。细胞提取物的浓度举例还包括但不限于下述任一种体积百分比，或者下述任两种体积百分比之间的数值范围(所述数值范围可以包括两个端点，也可以不包括两个端点)：20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、100％。
[0285]
所述细胞提取物来源于原核细胞、真核细胞、或者其组合。
[0286]
本发明的细胞提取物优选方式之一为来源于原核细胞，更优选大肠杆菌(e.coli细胞)或杆菌bacillus。
[0287]
本发明的细胞提取物优选方式之一为来源于真核细胞。
[0288]
原核细胞与真核细胞在翻译启动与调控机制方面具有根本差异，原核表达系统缺少多种蛋白质翻译后加工机制。典型地，基于大肠杆菌细胞的无细胞系统缺乏只有真核无细胞系统才能进行的翻译或翻译后修饰的能力，使得许多真核蛋白不适于在大肠杆菌系统中表达；合成的蛋白质进程含有不完整的新多肽。基于原核系统的无细胞蛋白合成体系与基于真核系统的无细胞蛋白合成体系的合成机理相差甚远，特别是涉及细胞提取物中的各种因子层面。参考包括但不限于以下文献：“nicole e.gregorio,max z.levine and javin p.oza.methods protoc.2019,2,24”、“edited by alexander s.spirin and james r.swartz.cell-free protein synthesis:methods and protocols[m].2008,p.5”、“张绪.无细胞体系高效合成复杂膜蛋白的关键技术及工业应用探索[d].浙江大学,2014.”等。本发明的体外无细胞蛋白合成体系优选采用真核细胞提取物。
[0289]
所述细胞提取物的细胞来源可以选自，包括但不限于，以下组中的真核细胞：哺乳动物细胞(如兔网织红细胞、hf9、hela、cho、k562、hek293)、植物细胞(如麦胚细胞、烟草by-2细胞)、酵母细胞、昆虫细胞、线虫细胞、及其组合。所述哺乳动物细胞的来源包括但不限于鼠源、兔源、猴源、人源、羊源、猪源、牛源等。
[0290]
所述细胞提取物的细胞来源及其制备方法还可以参考现有文献所报道，包括但不限于下述文献所报道的细胞来源均作为参考纳入本发明：“nicole e.gregorio,max z.levine and javin p.oza.a user's guide to cell-free protein synthesis[j].methods protoc.2019,2,24”、“y lu.advances in cell-free biosynthetic technology[j].current developments in biotechnology and bioengineering,2019,chapter 2,23-45”等文献及其直接引用或间接引用的文献。例如，原核细胞来源包括但不限于大肠杆菌(e.coli)；真核细胞来源包括但不限于酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、变铅青链霉素菌(streptomyces lividans)、麦胚细胞(wheat germ)、烟草by-2细胞(tobacco by-2cell)、草地贪夜蛾细胞(spodoptera frugiperda cell，sf细胞，一种昆虫细胞)、粉蚊夜蛾细胞(trichoplusiani cell，一种昆虫细胞)、兔网织红细胞(rabbit reticulocyte)、cho细胞(chinese hamsterovary cell，中国仓鼠卵巢细胞)、人k562细胞、hek293细胞、hela细胞、小鼠纤维成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast)、蜥蜴利什曼原虫细胞(leishmania tarentolae cell，protozoan，为单细胞生物)等。
[0291]
所述酵母细胞优选实施方式之一，优选为酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母、或者其组合；所述克鲁维酵母进一步优选为乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis，k.lactis)、kluyveromyces lactis var.drosophilarum、kluyveromyces lactis var.lactis、马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)、kluyveromyces marxianus var.lactis、kluyveromyces marxianus var.marxianus、kluyveromyces marxianus var.vanudenii、多布克鲁维酵母(kluyveromyces dobzhanskii)、海泥克鲁维酵母(kluyveromyces aestuarii)、非发酵克鲁维酵母(kluyveromyces nonfermentans)、威克海姆克鲁维酵母(kluyveromyces wickerhamii)、耐热克鲁维酵母(kluyveromyces thermotolerans)、脆壁克鲁维酵母(kluyveromyces fragilis)、湖北克鲁维酵母(kluyveromyces hubeiensis)、多孢克鲁维酵母(kluyveromyces polysporus)、暹罗克鲁维酵母(kluyveromyces siamensis)、亚罗克鲁维酵母(kluyveromyces yarrowii)、等、或者其组合；参考文献包括但不限于以下文献：ep1197560a1、“marc-andr
é
lachance.the yeasts(fifth edition),chapter 35,kluyveromyces van der walt(1971).2011,pages 471-481”、“jl souciet,b dujon,c gaillardin,m johnston et al.comparative genomics of protoploid saccharomycetaceae[j].genome res.2009,19:1696-1709”。
[0292]
克鲁维酵母(kluyveromyces)是一种子囊孢子酵母，其中，马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)和乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis)是工业上广泛使用的酵母。与其它酵母相比，乳酸克鲁维酵母具有许多优点，如超强的分泌能力，更好的大规模发酵特性、食品安全的级别、还具有蛋白翻译后修饰的能力等。乳酸克鲁维酵母的野生菌株的基因组中不含有t7 rna聚合酶的编码基因。
[0293]
优选方式之一，所述细胞提取物的来源是乳酸克鲁维酵母，且内源性整合有以下任一种基因序列或其组合：rna聚合酶的编码基因、dna聚合酶的编码基因。优选地，内源性整合方式为整合入细胞内游离质粒中或整合入细胞基因组中。
[0294]
优选方式之一，所述细胞提取物的来源是乳酸克鲁维酵母，且内源性整合有以下任一种基因序列或其组合：t7 rna聚合酶的编码基因、phi29 dna聚合酶的编码基因。优选地，内源性整合方式为整合入细胞内游离质粒中或整合入细胞基因组中。
[0295]
本发明所述细胞提取物的优选实施方式之一，所述细胞提取物可选自以下任一种来源：大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、及其组合。所述酵母细胞更优选为克鲁维酵母、酿酒酵母、毕氏酵母、或者其组合；所述克鲁维酵母进一步优选为乳酸克鲁维酵母、kluyveromyces lactis var.drosophilarum、kluyveromyces lactis var.lactis、马克斯克鲁维酵母、kluyveromyces marxianus var.lactis、kluyveromyces marxianus var.marxianus、kluyveromyces marxianus var.vanudenii、多布克鲁维酵母、非发酵克鲁维酵母、海泥克鲁维酵母、威克海姆克鲁维酵母、耐热克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母、湖北克鲁维酵母、多孢克鲁维酵母、暹罗克鲁维酵母、亚罗克鲁维酵母、或者其组合。
[0296]
另一优选实施方式，所述细胞提取物为酵母细胞提取物，更优选克鲁维酵母细胞提取物，更优选马克斯克鲁维酵母细胞提取物或乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
[0297]
另一优选实施方式，所述细胞提取物可选自以下任一种来源：大肠杆菌、乳酸克鲁维酵母、麦胚细胞、spodoptera frugiperda细胞(sf细胞，一种昆虫细胞)、蜥蜴利什曼原虫细胞、兔网织红细胞、中国仓鼠卵巢细胞(cho细胞)、非洲绿猴肾cos细胞、非洲绿猴肾vero
细胞、幼地鼠肾细胞(bhk细胞)、人hela细胞、人hybridoma细胞(人杂交瘤细胞)、人纤维肉瘤ht1080细胞、及其组合。
[0298]
1.1.3.外源rna聚合酶、外源dna聚合酶
[0299]
当作为细胞提取物来源的细胞的基因组中不含有rna聚合酶的基因，也没有内源性整合rna聚合酶的编码序列/编码基因的情况下，通常需要额外加入外源性rna聚合酶以促进反应进行。比如采用野生型乳酸克鲁维酵母的细胞提取物时，野生乳酸克鲁维酵母菌株制备的细胞提取物不能识别t7启动子。
[0300]
向体外蛋白合成体系中添加外源rna聚合酶是传统的技术手段。现有技术中报道的添加外源rna聚合酶的体外蛋白合成体系，均纳入到本发明中，作为本发明的cfps(mgp-)体系的可选方式。所述cfps(mgp-)体系，指所述cfps(mg )体系中除葡萄糖酸镁以外的其它组分构成的体系。例如，cn108535489a中添加外源rna聚合酶(如t7 rna聚合酶)的乳酸克鲁维酵母体外蛋白合成体系，均作为cfps(mgp-)的可选方式纳入到本发明中。
[0301]
所述cfps(mg )体系中还可以包括以下至少一种组分：外源rna聚合酶、编码rna聚合酶的外源核酸模板、外源dna聚合酶、编码dna聚合酶的外源核酸模板。
[0302]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括外源性rna聚合酶和外源性dna聚合酶。
[0303]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系包括外源性t7 rna聚合酶和外源性phi29 dna聚合酶。
[0304]
可以直接添加外源性rna聚合酶，也可以添加编码rna聚合酶的外源核酸模板，或者添加其组合。rna聚合酶的编码序列，可以一并构建于编码外源蛋白的核酸模板中，也可以另外构建在独立的外源核酸模板中。
[0305]
同样地，dna聚合酶也可以直接添加，或者添加含有其编码序列的外源核酸模板，或者添加其组合。可以是编码外源蛋白的核酸模板，也可以是独立的外源核酸模板。
[0306]
所述编码外源蛋白的核酸模板为dna模板时，可以包括dna的扩增过程，也可以不包括dna扩增过程；如果体外蛋白合成反应中还包括dna扩增过程，特别是dna模板数量不足时，则需要体系中含有内源表达的或/和外源添加的dna聚合酶，例如cn108642076a中加入外源性phi29 dna聚合酶。本发明的实施例1-15中，对编码外源蛋白megfp的dna进行体外扩增后，将扩增产物加入到反应体系中，作为外源dna模板，体外蛋白合成反应不再需要包括dna扩增过程。体系中添加dna聚合酶时，也即当体外反应过程包括dna的扩增过程时，通常还需添加合成dna的底物。
[0307]
dna聚合酶可以是源自真核生物或原核生物的聚合酶。真核生物聚合酶的举例如下述任一种或其任意组合：pol-α，pol-β，pol-δ，pol-ε、等、前述任一种片段、前述任一种的变体(包括前述任一种片段的变体)。原核生物聚合酶举例如下述任一种或其任意组合：大肠杆菌(e.coli)dna聚合酶i(如klenow片段)、大肠杆菌dna聚合酶ii、大肠杆菌dna聚合酶iii、大肠杆菌dna聚合酶iv、大肠杆菌dna聚合酶v、噬菌体t4 dna聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(bacillus stearothermophilus)聚合酶i、phi29 dna聚合酶、t7 dna聚合酶、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)pol i，金黄葡萄球菌(staphylococcus aureus)pol i，等，前述任一种的部分结构域，前述任一种的亚基或片段，前述任一种的变体(包括前述任一种片段的变体)。所述变体包括但不限于突变体。
[0308]
所述聚合酶(外源性rna聚合酶、外源性dna聚合酶)优选可进行常温扩增的聚合
酶，所述常温优选室温至37℃，具体地，优选20～37℃，更优选25～37℃。所述可进行常温扩增的聚合酶可根据外源核酸模板进行选取；可用于体外无细胞体系的常温扩增聚合酶均作为参考纳入本发明的范围，包括但不限于phi29 dna聚合酶、t4 dna聚合酶、t7 dna聚合酶、exo-klenow dna聚合酶、bsu dna聚合酶、pol iii dna聚合酶、t7 rna聚合酶、t3 rna聚合酶、t4 rna聚合酶、t5 rna聚合酶等，上述任一种聚合酶的部分结构域，前述任一种的亚基或片段，前述任一种的变体，及前述聚合酶及其部分结构域、亚基、片段、变体(包括但不限于突变体)的任意组合。本发明还可采用taq dna聚合酶、pfu dna聚合酶、pol i dna聚合酶、pol ii dna聚合酶等其它dna聚合酶。
[0309]
在一些优选例中，dna聚合酶具有链置换功能。
[0310]
在一些优选例中，dna聚合酶缺失3
’-5’
核酸外切酶活性。
[0311]
本发明可采用的扩增技术，特别是常温扩增方法没有特别限制，体外无细胞体系可采用的常温扩增技术均作为参考纳入本发明的范围。
[0312]
1.1.4.能量系统/能量再生系统
[0313]
能量系统/能量再生系统用于提供蛋白合成过程所需能量。
[0314]
已报道的用于无细胞体外蛋白合成系统的能量系统/能量再生系统均可为本发明的体外蛋白合成体系提供能量。包括但不限于文献：cn109988801a、cn2018116198186、cn2018116198190、us20130316397a、us20150376673a、“mj anderson,jc stark,ce hodgman and mc jewett.energizing eukaryotic cell-free protein synthesis with glucose metabolism[j].febs letters,2015,589(15):1723-1727”、“y lu.advances in cell-free biosynthetic technology[j].current developments in biotechnology and bioengineering,2019,chapter 2,23-45”、“p shrestha,mt smith and bc bundy.cell-free unnatural amino acid incorporation with alternative energy systems and linear expression templates[j].new biotechnology,2014,31(1):28-34”等文献及其直接引用或间接引用文献中报道的能量系统/能量再生系统，均作为参考纳入本发明。
[0315]
优选实施方式之一，所述能量系统为糖(如：单糖、二糖、寡糖或多糖)与磷酸盐能量体系、糖与磷酸肌酸能量体系、磷酸肌酸与磷酸肌酸酶体系、磷酸肌酸与磷酸肌酸激酶体系、糖酵解途径及其中间产物能量体系(单糖及其酵解中间产物能量体系、糖原及其酵解中间产物能量体系)、或者其组合。具体地，所述磷酸盐，指无机磷酸盐，优选为正磷酸盐、磷酸二氢盐、磷酸氢二盐、偏磷酸盐、焦磷酸盐或者其组合。所述多糖可选自包括但不限于淀粉、糖原、糊精(如麦芽糊精、玉米糊精、环糊精)等多糖。所述二糖，举例如蔗糖、麦芽糖等。所述单糖可以为六碳糖，也可以为五碳糖。所述单糖举例如：葡萄糖、甘露糖、乳糖等。所述糖酵解途径及其中间产物能量体系包括但不限于基于葡萄糖的能量体系。
[0316]
优选方式之一，所述能量体系为糖与磷酸盐能量体系，根据使用的细胞提取物的菌株种类，所述糖可以选自包括但不限于：葡萄糖、岩藻糖、甘露糖、半乳糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糖原、糊精(如麦芽糊精、玉米糊精、环糊精、环糊精)，及其任意组合。
[0317]
能量系统中各组分的浓度没有特别限制，包括但不限于采用现有已报道的技术方案及其等同技术方案。实施例3-15采用的能量系统单糖(葡萄糖)、多糖(麦芽糊精或玉米糊
biotechnology,2017,2,23-27”、“w gao,e cho,y liu and y lu.advances and challenges in cell-free incorporation of unnatural amino acids into proteins[j].frontiers in pharmacology,2019,10:611”等文献及其直接引用或间接引用的文献。所述放射性同位素标记的氨基酸没有特别限制，包括但不限于已报道的蛋白合成领域中采用的同位素标记。所述经修饰的氨基酸没有特别限制，包括但不限于通过氨基酸侧基进行修饰。
[0331]
优选地，所述氨基酸混合物为天然氨基酸的混合物。
[0332]
优选方式之一，所述氨基酸混合物为二十种天然氨基酸的混合物。
[0333]
1.1.8.其它添加剂组分
[0334]
所述cfps(mg )体系中还可以包括以下至少一种外源添加组分：翻译相关元件、dna扩增相关元件、rna扩增相关元件、rna酶抑制剂、拥挤剂(优选之一为聚乙二醇和/或其类似物)、钾离子、抗氧化剂或还原剂、防冻剂、海藻糖、反应促进剂、消泡剂、烷烃、缓冲剂、水性溶剂。可以参考文献wo2016005982a1、us20060211083a1、“l kai,vr kaldenhoff and f bernhard.artificial environments for the co-translational stabilization of cell-free expressed proteins[j].plos one,2013,8(2):e56637”、us20030119091a1、us20180245087a1、us5665563、wo2019033095a1、us9410170b2、us9528137b2等文献及其直接或间接引用的文献。
[0335]
外源蛋白翻译所需的相关元件，还可以通过外源添加翻译相关元件的方式提供或补充。所述翻译相关元件优选选自：trna、核糖体、其它翻译相关酶、起始因子、延伸因子、终止因子及其组合。所述翻译相关元件优选为纯化的翻译相关元件。
[0336]
当蛋白合成过程涉及dna扩增时，除内源提供方式外，还可以通过外源方式添加dna扩增相关元件。所述dna扩增相关元件，除dna聚合酶外，依据不同的扩增机理，还可以包括诸如解旋酶(hda扩增)、重组酶和单链dna结合蛋白(rpa扩增)、等其它因子。
[0337]
当蛋白合成过程涉及rna扩增时，除内源提供方式外，还可以通过外源方式添加rna扩增相关元件。
[0338]
所述rna抑制剂可以起到稳定rna的作用。
[0339]
在一些优选例中，cfps(mg )体系还含有拥挤剂(crowding agents)，用于模拟细胞内的拥挤的大分子环境。所述拥挤剂的结构没有特别限制，可以为线性的，也可以为非线性，所述非线性结构包括但不限于支化、多臂、环状、梳状、树状、星形等结构类型。在一些优选例中，所述拥挤剂可以选自以下组：聚乙二醇、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol，pva)、聚苯乙烯(polystyrene)、葡聚糖(dextran)、蔗糖聚合物(如ficoll蔗糖聚合物，如聚蔗糖，如ficoll-400)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp，poly(vinylpyrrolidone))、白蛋白、等、其任意组合。所述白蛋白的来源包括但不限于：人血清白蛋白、牛血清白蛋白、猪血清白蛋白、及其组合；优选地，所述白蛋白为人血清白蛋白(human serum albumin)。所述拥挤剂还可参考下述文献所公开的拥挤剂：文献“x ge,d luo and j xu.cell-free protein expression under macromolecular crowding conditions[j].plos one,2011,6(12):e28707”及其引用文献。在一些优选例中，拥挤剂在所述体外蛋白合成反应混合物中的浓度足以提高蛋白合成量。
[0340]
在一些优选例中，拥挤剂的分子量不超过400kda。在一些优选例中，拥挤剂的分子
量不超过200kda。通常，分子量规格优选分子量分布为
±
10％或更窄。优选方式之一，拥挤剂的用量，以拥挤剂在所述体外蛋白合成反应混合物中的重量百分比(wt％)或体积百分比(％(v/v))或质量体积浓度(％(w/v))为单位，选自0.5％～15％，进一步优选选自1％～12％；举例如下述浓度值中的任一种浓度，或下述任意两个浓度值之间的浓度范围(所述浓度范围包括两个端点)：1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％、10.5％、11.0％、11.5％、12.0％、12.5％、13.0％、13.5％、14.0％、14.5％、15.0％。
[0341]
优选方式之一，所述cfps(mg )体系还含有聚乙二醇和/或其类似物，用作拥挤剂。其中如聚乙二醇，还可以调节体系粘度。聚乙二醇，具有ch2ch2o的重复单元(eo单元)，通常记为peg(polyethylene glycol)、peo(poly(ethylene oxide))、poe(polyoxyethylene)。所述聚乙二醇的类似物包括但不限于富含eo单元的共聚物、聚乙二醇衍生物、可起到拥挤剂作用的其它聚氧化烯烃(举例如聚氧丙烯，pop)、所述其它聚氧化烯烃的衍生物等；所述衍生物，以聚乙二醇衍生物为例，举例如，包括但不限于化学修饰物(举例如甲氧基聚乙二醇、氨基修饰物、羧基修饰物等)、氨基酸修饰物、多肽修饰物、蛋白修饰物、含聚乙二醇嵌段的嵌段聚合物、含聚乙二醇侧链的聚合物等。聚乙二醇或其类似物的浓度没有特别限制，通常，聚乙二醇或其类似物的浓度为0.1％～10％，优选0.1％～8％，更优选0.5％～4％，更优选1％～2％，以在所述体外蛋白合成反应混合物中的质量体积浓度计(％(w/v))或者以总重量计(wt％)；如无特别说明，本发明中均指质量体积浓度，单位为％(w/v)，如2％，指2％(w/v)，对应2g/100ml、20mg/ml。一些优选例中，聚乙二醇和/或其类似物的分子量不超过40000da，代表性的分子量举例如下述任一种分子量或者下述任两种分子量之间的数值区间(包括两个端点值)：200、400、500、600、800、1000、1200、1400、1450、1500、1600、1800、2000、2500、3000、3350、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10000、12000、14000、15000、16000、18000、20000、25000、30000、35000、40000；单位da；上述各数字在数值上等于重均分子量或数均分子量。通常，分子量规格优选分子量分布为
±
10％或更窄。所述聚乙二醇和/或其类似物优选分子量为200da～10000da，更优选分子量为3000da～10000da。另优选方式之一为200da～8000da。另优选方式之一为2000da～8000da。另优选方式之一为3000da～8000da。本发明中，聚乙二醇或其类似物的分子量如无特别说明，均指重均分子量m
w
。代表性的peg选自下组：peg200、peg400、peg1000、peg1500、peg2000、peg3000、peg3350、peg5000、peg6000、peg8000、peg10000、等、其组合；其中，3350等数字在数值上等于重均分子量。
[0342]
所述钾离子来源于钾离子源，没有特别限制，所述钾离子源可以选自下组：醋酸钾、谷氨酸钾(优选l-谷氨酸钾)、氯化钾、磷酸钾、硫酸钾、柠檬酸钾、磷酸氢钾、碘化钾、乳酸钾、硝酸钾、草酸钾、其组合。优选实施方式之一的浓度范围是0～500mm。另优选实施方式之一的浓度范围是1～250mm。另优选实施方式之一的浓度范围是5～200mm。另优选实施方式之一的浓度范围是10～100mm。优选方式之一，钾离子源选自天门冬氨酸钾、谷氨酸钾、醋酸钾中任一种、任两种或者全部。
[0343]
专利文献wo2016005982a1中报道的聚乙二醇、镁离子、钾离子的优化作用及优选方式，参考性地纳入本发明中。
[0344]
所述抗氧化剂，也可称为还原剂。可包括但不限于二硫苏糖醇(dtt，
dithiothreitol)、2-巯基乙磺酸、2-巯基乙醇、还原型谷胱甘肽(gsh)、三羧甲基磷酸(tcep)、3-巯基-1,2-丙二醇(mpd)等等。优选实施方式之一为二硫苏糖醇。dtt采用其常规使用浓度即可；具体实施方式之一如0.5～10mm；另一实施方式中采用浓度0～1.7mm。
[0345]
所述防冻剂，可以选自包括但不限于专利文献wo2018138195a1及其引用文献中用于固体制剂的防冻剂。举例如，海藻糖。加入防冻剂的目的，主要是为了整个体系或体系的部分分装组分能够进行低温存储，特别是以试剂盒方式保存时。所加入的防冻剂，允许同时具有调节体外蛋白合成反应的作用。
[0346]
一些防冻剂，包括但不限于海藻糖，还可以作为能量系统的构成组分。
[0347]
所述反应促进剂，包括但不限于，如cn109971783a所提供的反应促进剂(如铝盐)。优选方式之一，所述反应促进剂为铝盐、铝氧化物(如氧化铝)、铁盐、铁氧化物、钙盐、或者其组合。
[0348]
所述消泡剂，举例如cn1934276a及其引用文献中提供的消泡剂。具体举例如，包括但不限于烷基聚氧化亚烷基乙二醇醚(alkyl polyoxyalkylene glycol ether)、酯、硅氧烷、聚硅氧烷、亚硫酸盐、磺酸盐、脂肪酸及其衍生物等。
[0349]
所述烷烃可起到提供疏水界面或者模拟疏水环境的作用。专利申请cn202010179689.4的相关内容作为参考纳入本发明中。举例如c
6～44
烷烃的纯净物或混合物，进一步举例如环己烷、异辛烷、癸烷、十四烷、十五烷基环己烷、角鲨烷、四十四烷、凡士林等。
[0350]
所述缓冲剂，主要用于维持体系的ph环境。优选实施方式之一为，选自以下任一种或者其组合：tris-hcl、tris碱、hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸体系)。
[0351]
所述水性溶剂，优选为缓冲剂。
[0352]
需要说明的是，本发明所涉及的所述cfps(mg )体系的任一种组分，允许以前述以外的其它功能或目的加入到体系中。
[0353]
本发明所涉及的所述cfps(mg )体系的任一种组分，允许发挥两种或者两种以上的功能。举例，如，一些糖组分，既可以作为能量系统的组分，也允许同时作为拥挤剂、防冻剂等功能性组分。
[0354]
1.1.9.含外源镁离子的体外蛋白合成体系(cfps(mg )体系)的具体实施方式举例
[0355]
下述具体实施方式中的各组分浓度为终浓度(相对于母液)，对应在体外蛋白合成反应混合物中的起始浓度。
[0356]
优选实施方式之一为，所述cfps(mg )体系含有细胞提取物、葡萄糖酸镁、内源性表达的rna聚合酶(包含于前述细胞提取物中)或者外源添加的rna聚合酶、能量系统、合成rna的底物、合成蛋白的底物、拥挤剂、钾离子、缓冲液，还可选地包括以下任一种外源组分：其它镁离子源、编码rna聚合酶的外源核酸模板(独立地优选为dna模板)、内源性表达的dna聚合酶或者外源添加的dna聚合酶、编码dna聚合酶的外源核酸模板(独立地优选为dna模板)、其它dna扩增相关元件、合成dna的底物、翻译相关元件、rna扩增相关元件、rna酶抑制剂、抗氧化剂或还原剂、防冻剂、海藻糖、反应促进剂、消泡剂、烷烃、水性溶剂。所述细胞提取物优选为真核细胞提取物，更优选酵母细胞提取物，更优选方式之一为乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
[0357]
优选实施方式之一为，所述cfps(mg )体系含有细胞提取物(细胞来源经过菌株改
造，已把rna聚合酶的编码基因整合到细胞基因组中或者插入到细胞内游离质粒中)、葡萄糖酸镁，还含有选自以下组的一种或多种或全部组外源分：4-羟乙基哌嗪乙磺酸钾(hepes-k)或三羟甲基氨基甲烷(tris)、醋酸钾、谷氨酸钾(优选l-谷氨酸钾)、氯化钾、醋酸镁、谷氨酸镁(优选l-谷氨酸镁)、天门冬氨酸镁(优选l-天门冬氨酸镁)、核苷三磷酸混合物(ntps)、氨基酸混合物、磷酸肌酸、磷酸肌酸酶、磷酸肌酸激酶、葡萄糖、l-阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糖原、糊精、玉米糊精、麦芽糊精、环糊精、磷酸盐(如磷酸钾)、dna扩增相关元件、脱氧核苷三磷酸混合物、rna扩增相关元件、rna酶抑制剂、聚乙二醇、葡聚糖、蔗糖聚合物、二硫苏糖醇(dtt)。所述细胞提取物优选为真核细胞提取物，更优选酵母细胞提取物，更优选方式之一为乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
[0358]
优选实施方式之一为，所述cfps(mg )体系含有细胞提取物、葡萄糖酸镁，还含有选自以下组的一种或多种或全部外源组分：hepes-k或tris、醋酸钾、谷氨酸钾(优选l-谷氨酸钾)、氯化钾、醋酸镁、谷氨酸镁(优选l-谷氨酸镁)、天门冬氨酸镁、核苷三磷酸混合物(ntps)、氨基酸混合物、磷酸肌酸、磷酸肌酸酶、磷酸肌酸激酶、葡萄糖、l-阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糖原、糊精、玉米糊精、麦芽糊精、环糊精、磷酸盐(如磷酸钾)、rna酶抑制剂、聚乙二醇、葡聚糖、蔗糖聚合物、二硫苏糖醇、外源性t7 rna聚合酶、外源性phi29 dna聚合酶、其它dna扩增相关元件、脱氧核苷三磷酸混合物、rna扩增相关元件。所述细胞提取物优选为真核细胞提取物，更优选酵母细胞提取物，更优选方式之一为乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
[0359]
优选实施方式之一为，所述cfps(mg )体系含有细胞提取物(来源细胞可选地经过菌株改造，可选地把rna聚合酶的编码基因整合到细胞基因组中或者插入到细胞内游离质粒中)、葡萄糖酸镁，还含有选自以下组的一种或多种或全部外源组分：hepes-k或三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(tris
·
hcl)、醋酸钾、谷氨酸钾(优选l-谷氨酸钾)、氯化钾、醋酸镁、谷氨酸镁(优选l-谷氨酸镁)、天门冬氨酸镁(优选l-天门冬氨酸镁)、核苷三磷酸混合物(ntps)、氨基酸混合物、磷酸肌酸、磷酸肌酸酶、磷酸肌酸激酶、葡萄糖、l-阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、糖原、糊精、玉米糊精、麦芽糊精、环糊精、磷酸钾、rna酶抑制剂、聚乙二醇、葡聚糖、蔗糖聚合物、二硫苏糖醇、海藻糖、氧化铝促进剂、消泡剂、烷烃、外源性t7 rna聚合酶、外源性phi29 dna聚合酶、编码t7rna聚合酶的dna模板、编码phi29 dna聚合酶的dna模板、其它dna扩增相关元件、脱氧核苷三磷酸混合物、rna扩增相关元件。所述细胞提取物优选为真核细胞提取物，更优选酵母细胞提取物，更优选方式之一为乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
[0360]
另一种优选实施方式为，所述cfps(mg )体系含有细胞提取物、葡萄糖酸镁，还含有选自以下组的一种或多种或全部外源组分：tris-hcl(ph8.0)、醋酸钾、谷氨酸钾(优选l-谷氨酸钾)、氯化钾、醋酸镁、谷氨酸镁(优选l-谷氨酸镁)、天门冬氨酸镁(优选l-天门冬氨酸镁)、葡萄糖、l-阿拉伯糖、蔗糖、麦芽糖、麦芽糊精、玉米糊精、核苷三磷酸混合物(四种核苷三磷酸混合物，其中单一核苷三磷酸浓度均相同)、氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸；优选二十种氨基酸的混合物；其中，单一氨基酸浓度可以均相同)、磷酸钾、外源性t7 rna聚合酶、外源性phi29 dna聚合酶、其它dna扩增相关元件、脱氧核苷三磷酸混合物、rna扩增相关元件、rna酶抑制剂、聚乙二醇、葡聚糖、蔗糖聚合物、二硫苏糖醇。所述细胞提取物优选为真核细胞提
取物，更优选酵母细胞提取物，更优选方式之一为乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
[0361]
具体地，优选实施方式之一为，所述cfps(mg )体系含有50％～80％(v/v)细胞提取物、1.5～12mm葡萄糖酸镁，还含有选自以下组的一种或多种或全部成分：9.78mm ph8.0的tris-hcl、20～80mm醋酸钾、2～10mm醋酸镁、1.5～6mm l-天门冬氨酸镁、0.5～5mm四种核苷三磷酸(单一核苷三磷酸浓度均相同，如1.8mm)、0.1～1mm二十种氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，单一氨基酸浓度均相同，如0.5mm)、10～40mm葡萄糖、5～110mm l-阿拉伯糖、200～400mm麦芽糊精(以葡萄糖单体计量，如320mm时对应约52mg/ml)、10～40mm磷酸钾、0.5％～5％(w/v)聚乙二醇(如2％(w/v))、0.4～5mm二硫苏糖醇(如0.44mm)。所述细胞提取物优选为真核细胞提取物，更优选酵母细胞提取物，更优选方式之一为乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
[0362]
尚未添加葡萄糖酸镁的cfps(mgp-)体系的具体实施方式之一，还包括但不限于，例如wo2016005982a1所记载的基于大肠杆菌的无细胞蛋白合成体系。本发明的其它引用文献、其直接及间接引用文献中所记载的包括但不限于基于麦胚细胞、兔网织红细胞、酿酒酵母、毕赤酵母、马克斯克鲁维酵母的体外无细胞蛋白合成体系，也均作为本发明cfps(mgp-)体系的可选实施方式纳入本发明。举例如，文献“lu,y.advances in cell-free biosynthetic technology.current developments in biotechnology and bioengineering,2019,chapter 2,23-45”中包括但不限于“2.1systems and advantages”部分第27-28页所引用文献中记载的体外无细胞蛋白合成体系，均作为本发明的尚未添加葡萄糖酸镁的cfps(mgp-)体系的可选实施方式。举例如，文献cn106978349a、cn108535489a、cn108690139a、cn108949801a、cn108642076a、cn109022478a、cn109423496a、cn109423497a、cn109837293a、cn109971783a、cn109988801a、cn110551700a、cn109971775a、cn110551745a、cn110551700a、cn2018116083534、cn2018116198186、cn2018116198190、cn2019102128619、cn2019102355148、cn2019107298813、cn2019112066163、cn2018108881848、cn2018109550734、cn2018111131300、cn2018111423277、cn2018112862093、cn201911418151.8、cn202010069383.3、cn202010179689.4及其引用文献中记载的体外无细胞蛋白合成体系，均作为本发明的cfps(mgp-)体系的可选实施方式。
[0363]
1.2.外源蛋白
[0364]
适用于本发明的所述cfps(mg )体系的外源蛋白，没有特别限制，只要能够基于细胞提取物(包括原核细胞提取物、真核细胞提取物；特别地真核细胞提取物，更特别地酵母细胞提取物，更特别地乳酸克鲁维酵母细胞提取物)进行体外合成即可。现有技术已公开的适用原核细胞提取物、真核细胞提取物(优选地酵母细胞提取物、更优选地乳酸克鲁维酵母来源)的体外蛋白合成体系的外源蛋白，或者适用于细胞内合成的原核细胞体系或真核细胞体系(优选为酵母细胞体系，更优选为乳酸克鲁维酵母体系)的内源蛋白，也均可以采用本发明的体系进行合成，或者尝试用本发明提供的体外蛋白合成体系进行合成。
[0365]
所述外源蛋白的应用领域包括但不限于生物医药、分子生物、医学、体外检测、医疗诊断、再生医学、生物工程、组织工程、干细胞工程、基因工程、聚合物工程、表面工程、纳米工程、化妆品、食品、食品添加剂、营养剂、农业、饲料、生活用品、洗涤、环境、化学染色、荧
光标记等领域。
[0366]
外源蛋白可以为天然蛋白或其改造产物，也可以为人工合成序列。所述天然蛋白的来源没有特别限制，包括但不限于：真核细胞、原核细胞；其中真核细胞来源包括但不限于：哺乳动物细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞、线虫细胞、及其组合；所述哺乳动物细胞来源包括但不限于鼠源、兔源、猴源、人源、猪源、羊源、牛源等。
[0367]
外源蛋白的类型包括但不限于多肽(本发明中“外源蛋白”广义地包括多肽)、荧光类蛋白、酶及相应的酶原、抗体及其片段、抗原、免疫球蛋白、激素、胶原、聚氨基酸、疫苗等，前述任一种蛋白的部分结构域，前述任一种蛋白的亚基或片段，以及前述任一种蛋白的变体。所述“前述任一种蛋白的亚基或片段”包括“前述任一种蛋白的部分结构域”的亚基或片段。所述“前述任一种蛋白的变体”包括“前述任一种蛋白的部分结构域、前述任一种蛋白的亚基或片段”的变体。所述“前述任一种蛋白的变体”包括但不限于前述任一种蛋白的突变体。本发明中，其它位置的连续两个或两个以上“前述”的情形，含义做类似解释。
[0368]
外源蛋白的结构，既可以为完整结构，也可以选自相应的部分结构域、亚基、片段、二聚体、多聚体、融合蛋白、糖蛋白等。举例如，作为不完整的抗体结构的纳米抗体(缺失轻链的重链抗体)。
[0369]
例如，本发明的所述cfps(mg )体系可合成的外源蛋白，可以选自包括但不限于以下任一种蛋白、任意组合方式的融合蛋白、任意组合方式的混合物：荧光素酶(如萤火虫荧光素酶)、绿色荧光蛋白(gfp)、增强绿色荧光蛋白(egfp)、黄色荧光蛋白(yfp)、氨酰trna合成酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、过氧化氢酶(catalase，举例如鼠过氧化氢酶)、肌动蛋白、抗体的可变区域(如抗体的单链可变区域，scfv)、抗体的单链及其片段(如抗体的重链、抗体的轻链)、α-淀粉酶、肠道菌素a、丙型肝炎病毒e2糖蛋白、胰岛素及其前体、胰高血糖素样肽(glp-1)、干扰素(包括但不限于干扰素α，如干扰素αa、干扰素β、干扰素γ等)、白介素(如白细胞介素-1β、白介素2、白介素12，等)、溶菌酶素、血清白蛋白(包括但不限于人血清白蛋白、牛血清白蛋白)、甲状腺素运载蛋白、酪氨酸酶、木聚糖酶、β-半乳糖苷酶(β-galactosidase,lacz，举例如大肠杆菌β-半乳糖苷酶)，等，前述任一种蛋白的部分结构域，前述任一种蛋白的亚基或片段，或前述任一种的变体(如前述定义，所述变体包括突变体，举例如萤光素酶突变体、egfp的突变体)。所述氨酰trna合成酶，举例如人赖氨酸-trna合成酶(lysine-trna synthetase)、人亮氨酸-trna合成酶(leucine-trna synthetase)等。所述甘油醛-3-磷酸脱氢酶，举例如拟南芥甘油醛3-磷酸脱氢酶，glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase。还可参考专利文献cn109423496a。所述任意组合方式的混合物，可以包括前述任一种的蛋白，也可以包括前述任意组合方式的融合蛋白。
[0370]
优选实施方式之一，采用gfp、egfp、类似物质、或其突变体等具有荧光性质的外源蛋白对所述cfps(mg )体系的蛋白合成能力进行评估。
[0371]
1.3.外源核酸模板(包括编码外源蛋白的核酸模板)
[0372]
本发明的外源核酸模板，如无特别说明，特指编码外源蛋白的核酸模板。此外，本发明的外源核酸模板，在指明的情况下，还可以包括编码体外蛋白合成过程所需蛋白因子或蛋白酶的核酸模板，举例如编码rna聚合酶的外源核酸模板、编码dna聚合酶的外源核酸模板。
[0373]
若合成体系中没有编码外源蛋白的核酸模板，外源蛋白体外合成反应就无法进
行。
[0374]
本发明的任一实施方式中的编码外源蛋白的核酸模板各自独立地可以为dna模板、mrna模板、或者其组合。
[0375]
本发明的任一实施方式中的编码外源蛋白的核酸模板可以各自独立地优选为dna模板。
[0376]
所述编码外源蛋白的核酸模板作为合成外源蛋白的直接模板(mrna)、间接模板(dna)、或者其组合。
[0377]
所述编码外源蛋白的核酸模板允许包括非编码区。所述表达产物可以为多肽或蛋白，也可以为融合蛋白。对一个核酸模板分子完成一次翻译(或转录翻译)过程，允许合成的多肽或蛋白分子数量可以为1个、2个或更多个。
[0378]
转录翻译方式的蛋白合成过程以dna模板为间接模板，仅翻译方式的蛋白合成过程可以采用mrna模板作为直接模板。
[0379]
优选地，本发明的所述cfps(mg )体系为体外转录翻译体系，也即ivtt体系，采用dna模板作为编码外源蛋白的核酸模板。
[0380]
所述编码外源蛋白的核酸模板含有合成外源蛋白所需的翻译相关元件。
[0381]
本发明的任一实施方式中，各自独立地优选，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有所述细胞提取物能够识别的启动子元件。
[0382]
优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板含有所述细胞提取物能够识别的启动子元件。
[0383]
优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板含有能够启动外源蛋白的基因转录程序的t7启动子，也即外源蛋白的基因转录过程由核酸模板上的t7启动子启动。
[0384]
优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板含有能够启动外源蛋白的基因转录程序的t7启动子(此时，t7启动子位于核酸模板外源蛋白的编码序列的上游，由t7启动子启动外源蛋白的基因转录程序)，所述cfps(mg )体系中的细胞提取物中含有内源性表达的t7 rna聚合酶。
[0385]
优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板包括外源蛋白翻译系统、抗性基因翻译系统、lac抑制子翻译系统；上述各翻译系统中分别包括相应的启动子。
[0386]
优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有控制质粒拷贝数的基因。
[0387]
优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有转录增强元件，如kozak序列。
[0388]
优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板还含有翻译增强元件，如翻译增强子元件、ires元件、kozak序列等。
[0389]
1.3.1.外源dna模板(包括编码外源蛋白的dna模板)
[0390]
本发明的外源dna模板，如无特别说明，特指编码外源蛋白的dna模板。
[0391]
本发明的外源dna模板，可以为dna、cdna、甲基化dna、或者其组合。其中，cdna可以由rna或mirna经逆转录获得。mirna(microrna)是一类由内源基因编码的长度约为20～25个核苷酸的非编码单链rna分子。
[0392]
所述编码外源蛋白的dna模板中含有外源蛋白的编码序列。
[0393]
优选地，所述编码外源蛋白的dna模板中含有外源蛋白的编码基因。
[0394]
所述编码外源蛋白的dna模板根据外源蛋白确定。
[0395]
所述编码外源蛋白的dna模板还可以含有选自启动子、终止子、增强子(举例如cn109423497a、cn109022478a、cn109837293a(cn201711194355.9)、cn109971775a)等文献中记载及其引用文献中记载的增强子元件，例如ω序列及其同源序列、组合的增强子元件)、kozak序列(参考cn109022478a、cn109837293a、cn109971775a等文献及其引用文献)、ires元件(内部核糖体进入序列，参考cn109022478a、cn109423497a等文献及其引用文献)、多克隆位点(mcs)、控制质粒拷贝数的基因等的其它功能元件。还可以含有编码信号肽(对应signal sequence)、前导肽(对应leader sequence)、功能标签(如纯化标签、增溶标签)、连接肽等其它氨基酸链的编码序列。还可以含有5’非翻译序列、3’非翻译序列。专利申请cn201911204796.1及其引用文献中直接或间接披露的增溶标签也均作为参考纳入本发明。
[0396]
所述编码外源蛋白的dna模板优选地含有启动子元件。所述启动子元件要求能够被所使用的细胞提取物或者所述cfps(mg )体系的其它组分所识别；可以是野生型细胞提取物能识别的启动子，也可以将细胞提取物的来源菌株改造成能识别该启动子的菌株。本发明dna模板中的启动子可以选自以下组：aod1、mox、aug1、aox1、gap、fld1、pex8、ypt1、lac4、pgk、adh4、amy1、gam1、xyl1、xpr2、tef、rps7、t7、及其组合。参考包括但不限于以下文献及其引用文献：“cereghino g.applications of yeast in biotechnology:protein production and genetic analysis.current opinion in biotechnology,1999,10(5),422-427”。
[0397]
在实施例3-15中，外源dna模板采用t7启动子启动外源蛋白的转录过程；所述t7启动子是能够对t7 rna聚合酶有特异性反应的强启动子。
[0398]
优选地，外源dna模板含有能够启动外源蛋白的基因转录过程的t7启动子。
[0399]
关于外源dna模板的浓度选取，根据实验方案拟表达的外源蛋白量确定。优选实施方式之一为，外源dna模板的浓度采用1～400ng/μl。另优选实施方式之一为，外源dna模板的浓度采用1～80ng/μl。另优选实施方式之一为，外源dna模板的浓度采用5～50ng/μl。另优选实施方式之一为，外源dna模板的浓度采用1～50ng/μl。本发明中，如无特别说明，dna模板的添加浓度为终浓度，所述终浓度指体外蛋白合成反应混合物中的起始浓度。
[0400]
所述外源dna模板可以是环状dna，也可以是线性dna；可以是单链的，也可以是双链的。所述外源蛋白的编码基因可以选自包括但不限于：基因组序列、cdna序列、及其组合。所述外源dna模板还可以含有启动子序列、5’非翻译序列、3’非翻译序列。
[0401]
优选实施方式之一，所述外源dna模板还包括选自下组的任一种元件或其组合：启动子、终止子、poly(a)元件、转运元件、基因靶向元件、筛选标记基因、增强子、ires元件、kozak序列、抗性基因、转座酶编码基因、信号序列(signal sequence)、前导序列(leading sequence，举例如cn109022478a中记载及其引用的前导序列)、控制质粒拷贝数的基因(rop基因)、增强翻译水平的标签(如cn2019112066163所记载的多肽标签)、其它功能标签(如纯化标签、荧光标签、增溶标签等)等。可参考文献us20060211083a1等。
[0402]
所述外源dna模板还可构建于表达载体之中。本领域普通技术人员可以使用熟知的方法构建含有外源蛋白的编码基因的表达载体。这些方法包括体外重组dna技术、dna合成技术、体内重组技术等。
[0403]
例如，将“z1-z2”结构的核酸构建物插入到质粒载体的克隆位点，作为质粒dna；其
中，z1为启动子，
“-”
为共价键或者核苷酸片段，z2为外源蛋白的编码序列。其中，z1的优选方式之一为t7启动子。
[0404]
优选实施方式之一，所述外源dna模板为环状dna，进一步优选为质粒dna。相应的质粒dna没有特别限制，只要能够与体系的细胞提取物进行反应合成外源蛋白即可。通常地，质粒中含有启动子、终止子、非翻译区(utr)等功能元件。优选方式之一所述质粒含有体外蛋白合成体系能够识别的启动子；具体优选方式之一，所述质粒含有细胞提取物能够识别的启动子。举例如，含有t7启动子的质粒理论上都可以作为实施例3-15所使用的外源dna模板的表达载体。例如大肠杆菌的pet系列质粒、pgem系列质粒等均可以用之替代实施例3-15的乳酸克鲁维酵母提取物的质粒载体以实施本发明。另一优选方式，所述质粒含有能够被外源添加组分所识别的启动子。
[0405]
以外源dna模板采用t7启动子启动外源蛋白的转录程序为例，所述t7启动子可以被细胞提取物中内源性表达的t7 rna聚合酶所识别启动，也可以被外源添加的t7 rna聚合酶所识别启动。
[0406]
线性dna可以通过体外核酸扩增技术获得。可采用的扩增技术没有特别限制，包括但不限于pcr扩增技术、恒温扩增技术、常温扩增技术、室温扩增技术等。其中，恒温扩增技术优选常温扩增技术。
[0407]
优选实施方式之一为，所述外源dna模板为线性dna，且为pcr线性片段。所述pcr线性片段可以通过已报道的pcr技术获得。
[0408]
另一优选实施方式为，所述外源dna模板为线性dna，且为经扩增系统得到的双链线性dna。所述扩增系统没有特别限制，可以从包括但不限于现有的商业化试剂盒、文献报道的扩增系统中选取，只要能够扩增本发明的编码外源蛋白的dna模板即可。举例如，包括但不限于biocompare、neta scientific inc、abm公司、thermo fisher scientific公司、expedeon公司、vivantis公司等企业提供的商业化dna扩增系统。
[0409]
另一优选实施方式为，采用双链dna作为外源dna模板，且构建于环状质粒载体中。所采用的质粒载体，典型结构之一，含有t7启动子、t7或lac4终止子、5’utr、3’utr等功能元件。
[0410]
作为优选实施方式之一，实施例3-15中，采用双链dna作为外源dna模板，构建于环状质粒载体；这些质粒含有t7启动子，作为启动外源蛋白转录翻译的启动子；在实施例2-15中，改造型乳酸克鲁维酵母可内源性表达t7 rna聚合酶，由改造菌株制备细胞提取物，进而构建体外无细胞蛋白合成体系，该体系中的t7启动子可适用于各种蛋白的体外无细胞表达。该质粒中还包含终止子、utr等功能元件。
[0411]
在一些具体实施方式中，质粒dna中包括以下功能元件：启动子、5’非编码区、外源蛋白的编码序列、3’非编码区、终止子、复制起始位点(f1 ori)、ampr启动子、氨苄青霉素抗性基因(ampr基因)、高拷贝数复制起始位点(ori)、控制质粒拷贝数的基因(rop基因)、laci启动子、laci的编码序列。
[0412]
具体实施方式之一，质粒dna至少包括表1所标示的结构元件。具体举例如图2所示的质粒结构。
[0413]
表1图2中标示的编码megfp的质粒dna(pd2p)的结构元件的说明
[0414][0415]
另一些具体实施方式中，除了图2标示的功能元件，在5’utr与megfp的编码序列之间还具有纯化标签，如多聚组氨酸标签(his-tag)。举例如图3所示。
[0416]
另一些具体实施方式中，除了图2标示的功能元件，在5’utr下游存在kozak序列，用于提高翻译水平。举例如图3所示。
[0417]
另一些具体实施方式中，除了图2标示的功能元件，在5’utr与megfp的编码序列之间、5’utr的下游，还具有信号肽的编码序列(信号序列)。
[0418]
另一些具体实施方式中，质粒dna中包括以下功能元件：启动子、5’非编码区、前导序列、外源蛋白的编码序列、3’非编码区、终止子、复制起始位点(f1 ori)、ampr启动子、ampr基因、高拷贝数复制起始位点(ori)、控制质粒拷贝数的基因(rop基因)、laci启动子、laci的编码序列。举例如图1所示的质粒结构。其中，rop基因未标示，其中外源蛋白翻译系统采用t7启动子和lac4终止子。
[0419]
另一些具体实施方式中，质粒dna中包括以下功能元件：启动子、5’非编码区、信号肽的编码序列、外源蛋白的编码序列、3’非编码区、终止子、f1 ori、ampr启动子、ampr基因、ori、rop基因、laci启动子、laci的编码序列。具体地举例如，质粒dna中包括以下功能元件：t7启动子、5’非编码区、信号肽的编码序列、外源蛋白megfp的编码序列、3’非编码区、t7终止子、f1 ori、ampr启动子、ampr基因、ori、rop基因、laci启动子、laci的编码序列。
[0420]
另一些具体实施方式中，质粒dna中包括以下功能元件：启动子、5’非编码区、信号肽的编码序列、纯化标签的编码序列、多克隆位点(mcs)、外源蛋白的编码序列、3’非编码区、终止子、f1 ori、ampr启动子、ampr基因、ori、rop基因、laci启动子、laci的编码序列。具体地举例如，质粒dna中包括以下功能元件：t7启动子、5’非编码区、信号肽的编码序列、纯化标签的编码序列、mcs、外源蛋白megfp的编码序列、3’非编码区、lac4终止子或t7终止子、f1 ori、ampr启动子、ampr基因、ori、rop基因、laci启动子、laci的编码序列。
[0421]
质粒的基本结构构建及将外源蛋白的编码基因插入到质粒载体的方法，可采用本领域常规技术手段，这里不再赘述。作为举例，可以参考cn108690139a、cn107574179a、cn108949801a等专利文献。作为举例，质粒的基本结构还可以参阅中国专利申请文献cn 201910460987.8的附图。
[0422]
本发明中，编码非外源蛋白的dna模板的浓度可以参考上述编码外源蛋白的dna模板的用量，根据所需的该非外源蛋白的表达量确定。所述非外源蛋白，指并非目的表达蛋白，而是为了促进反应进行而合成的翻译产物。
[0423]
1.3.2.外源mrna模板
[0424]
本发明还可以采用外源的mrna模板代替外源dna模板，或者采用外源mrna模板与外源dna模板的混合物，加入到上述cfps(mg )体系中，进行体外蛋白合成反应，合成mrna模板所编码的外源蛋白。
[0425]
1.3.3.体外核酸扩增(体外核酸扩增技术、体外核酸扩增方法)
[0426]“体外核酸扩增”，是在体外对核酸进行复制的过程。
[0427]
用于本发明的体外蛋白合成体系的核酸模板，包括编码外源蛋白的核酸模板，还可选地包括编码其它蛋白的核酸模板，均可采用体外核酸扩增技术用于制备模板原料，也可以在体外蛋白合成反应过程中包括核酸扩增过程。
[0428]
可采用的体外核酸扩增技术没有特别限制，可以是非等温扩增，也可以是等温扩增(也称为恒温扩增)。包括但不限于聚合酶链式反应技术(pcr扩增技术)、恒温扩增技术、常温扩增技术、室温扩增技术等。其中，恒温扩增技术优选常温扩增技术。
[0429]
其中，恒温扩增技术可参考下述文献中公开的恒温扩增技术：“j kim et al.isothermal dna amplification in bioanalysis:strategies and applications[j].bioanalysis,2011,3(2):227
–
239”、“gill p et al.nucleic acid isothermal amplification technologies—a review[j].nucleosides,nucleotides,and nucleic acids,2008,27(3)224-243”、“yong-joo jeong,kkothanahreum park and dong-eun kim.isothermal dna amplification in vitro:the helicase-dependent amplification system[j].cell.mol.life sci.,2009,66:3325
–
3336”、“吕蓓等.体外核酸快速扩增技术的发展和不断创新[j].中国生物工程杂志,2011,31(3):91-96”、“汪琳等.核酸恒温扩增技术研究进展[j].生物技术通讯,2011,22(2)”等文献及其引用文献。具体地，可用于本发明技术手段的的核酸恒温扩增方法包括但不限于：环介导恒温扩增法/环介导的等温扩增(lamp)、链替代扩增法/链置换扩增法(sda)、依赖核酸序列的扩增法(nasba)、滚环扩增法(rca)、切口酶核酸恒温扩增法(切口酶扩增反应，near)、依赖解旋酶的恒温扩增法(hda)、转录依赖的扩增法、杂交捕获法、转录介导的扩增法(tma)、重组酶介导扩增法(raa)、重组酶聚合酶扩增法(rpa)等。优选方式之一为滚环扩增法。
[0430]
可用于本发明的体外核酸扩增方法，特别是常温扩增方法没有特别限制，现有技术中体外无细胞体系可采用的常温扩增技术均作为参考纳入本发明的范围，包括但不限于滚环扩增技术(rca)、组合酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification，rpa)、链置换扩增技术(sda)、解旋酶依赖性扩增技术(helicase dependent amplification，hda)、3sr技术(self-sustained sequence replication)等等。下述参考文献中所公开的体外核酸扩增方法(特别是常温扩增方法)，均可用作本发明的技术手段，
并且均作为参考纳入本发明，这些参考文献包括但不限于：“nicole e.gregorio,max z.levine and javin p.oza.a user's guide to cell-free protein synthesis[j].methods protoc.2019,2,24”、“y lu.advances in cell-free biosynthetic technology[j].current developments in biotechnology and bioengineering,2019,chapter 2,23-45”、“y lu.cell-free synthetic biology:engineering in an open world[j].synthetic and systems biotechnology,2017,2,23-27”等文献及其直接引用或间接引用文献。
[0431]
本发明的体外核酸扩增还可采用smart扩增法(smap)、单引物等温扩增(spia)、指数扩增反应(expar)、热稳定的hda(thda)、多重置换扩增(mda)、限制性辅助rca等扩增技术。
[0432]
本发明的体外核酸扩增反应可以在有利于反应的一个特定温度或温度范围内持续进行。本发明的任一种常温扩增技术也允许在温度有小幅度波动的条件下进行。本发明的任一种常温扩增技术的反应条件也允许在可接受的温度范围内波动。
[0433]
1.4.孵育反应(体外蛋白合成反应)
[0434]
将编码外源蛋白的核酸模板(优选为dna模板)加入到所述cfps(mg )体系中，孵育反应一段时间，表达合成所述外源蛋白。
[0435]
进行体外蛋白合成反应的条件，根据具体的体外无细胞蛋白合成体系确定，可参考已报道的反应条件，包括但不限于cn106978349a、cn108535489a、cn108642076a等文献记载的反应条件。体外蛋白合成反应可以在有利于反应的一个特定温度或温度范围内持续进行。优选方式之一，整个反应时间内，混合液的摄氏温度的上下变化幅度小于25％(举例如少于20％，少于15％，少于10％，少于5％)和/或整个反应时间内混合液的温度上下变化幅度小于15℃(举例如小于10℃，小于5℃，小于2℃，或小于1℃)。优选采用常温条件进行体外蛋白合成反应。所述常温条件优选室温至37℃，具体地，优选20～37℃。优选方式之一为25～37℃。另优选方式之一为20～30℃。已报道的适于常温条件的常温蛋白合成方法或者等温蛋白合成方法均可用于实施本发明的技术方案。
[0436]
所述反应时间可根据原料使用量(如反应底物量、预期获得的蛋白表达量等)、蛋白合成反应效率等因素综合确定。
[0437]
实施方式之一，所述反应时间为1～72h。
[0438]
另实施方式之一，所述反应时间为3～24h。
[0439]
另实施方式之一，所述反应时间为3～21h。
[0440]
另实施方式之一，所述反应时间为6～21h。
[0441]
所述反应时间还可选自下述任一个时间长度，或任两个时间长度之间的时间长度：3h、4h、5h、6h、7h、8h、9h、10h、11h、12h、13h、14h、15h、16h、17h、18h、19h、20h、21h、22h、23h、24h、36h、48h、72h；所述时间长度范围包括两个端点。
[0442]
对外源蛋白表达量的测定，可以借鉴测试细胞提取物中蛋白含量的方法，可以根据外源蛋白的特点选择适合的方法。比如，实施例3-15中，采用紫外吸收法测定rfu值进而测算外源蛋白的合成量。
[0443]
2.本发明第二方面提供一种体外蛋白合成试剂盒，所述体外蛋白合成试剂盒包括：
[0444]
(i)第一方面所述含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(cfps(mg )体系)；
[0445]
(ii)可选地包括编码外源蛋白的核酸模板；
[0446]
(iii)标签或说明书。
[0447]
所述cfps(mg )体系能够与所述编码外源蛋白的核酸模板共同提供合成外源蛋白所需的翻译相关元件。
[0448]
所述编码外源蛋白的核酸模板可以由使用者进行配套设计后提供，再与试剂盒(i)提供的cfps(mg )体系配套适用。
[0449]
优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板作为参比对照。
[0450]
优选地，所述cfps(mg )体系的各组分以固体、半固体、液体、乳液、悬浊液、或其组合方式置于一个或多个容器中。所述干粉的优选方式之一为冻干粉或真空干燥粉末。所述液体包括纯净物、溶液。
[0451]
优选方式之一，所述(k1)与所述(k2)分别独立包装。
[0452]
所述固体，比如粉末(或称干粉)或颗粒。
[0453]
所述半固体，比如膏状体。
[0454]
所述液体，可以为纯净物或混合物。
[0455]
所述乳液，指不相容液相的混合体系，也称乳浊液。
[0456]
所述悬浊液，指不相容液相与固体的混合体系。
[0457]
优选地，所述(i)中具有独立分装的细胞提取物。
[0458]
利用所述体外蛋白合成试剂盒，可以进行体外蛋白合成反应，合成外源蛋白。
[0459]
优选方式之一，所述试剂盒的各组分共同构成水性溶液。所述试剂盒包括一个盛放所述水性溶液的容器。
[0460]
优选方式之一，所述试剂盒的各组分分装为干粉(如冻干粉、真空干燥粉末)和液态试剂两个部分。所述试剂盒包括两个容器，一个盛放干粉组分，一个盛放液态试剂组分。所述液态试剂包括一切含有液相的体系，可以为均一体系也可以为混合体系，包括但不限于纯净物、溶液、乳液、悬浊液、其组合形式。
[0461]
优选方式之一，所述试剂盒包括分别包括以下组分的分装容器：(a)细胞提取物；(b)能量系统；(c)可选地，核酸模板；(d)缓冲液；(e)可选地，ph调节组分；(f)可选地，若干个其它固态组分；(h)可选地，若干个其它液态组分。其中，组分(a)、(b)、(c)各自独立地为干粉或水性溶液。其中，组分(c)、(e)、(f)各自独立地有或无。此处的“若干个”表示1个、2个或更多个。外源镁离子可分装于(d)、(e)、(f)、(h)中一个或多个容器中，也可分装于其它容器中。
[0462]
当试剂盒中含有液态试剂时，优选其中包括防冻剂组分。
[0463]
优选方式之一，所述试剂盒的各组分分装为干粉、缓冲液、其它液态试剂，可选地包括溶剂水。
[0464]
优选方式之一，以下各组分可以分别分装或者以适当组合方式分装在不同的容器中：细胞提取物(含有内源性表达的rna聚合酶，可选地含有内源性表达的dna聚合酶)、外源镁离子(至少包括葡萄糖酸镁)、能量系统、合成rna的底物、合成蛋白的底物、拥挤剂、外源钾离子、缓冲液，还可选地包括以下任一种外源组分或其适当组合的分装容器：编码外源蛋白的核酸模板、其它外源镁离子、外源添加的rna聚合酶、编码rna聚合酶的外源dna模板、外
源添加的dna聚合酶、编码rna聚合酶的外源dna模板、其它dna扩增相关元件、合成dna的底物、翻译相关元件、rna扩增相关元件、rna酶抑制剂、抗氧化剂或还原剂、防冻剂、海藻糖、反应促进剂、消泡剂、烷烃、水性溶剂。所述细胞提取物优选地含有转运rna(trna)、核糖体(ribosome)。所述rna聚合酶独立地更优选为t7 rna聚合酶。所述dna聚合酶独立地更优选为phi29 dna聚合酶。所述细胞提取物优选为真核细胞提取物，更优选为克鲁维酵母细胞提取物，更优选为乳酸克鲁维酵母细胞提取物。当提供dna聚合酶时，可以通过内源方式、外源方式或其组合方式，通常地也一并提供合成dna的底物。
[0465]
优选方式之一，以下各组分可以分别分装或者以适当组合方式分装在不同的容器中：细胞提取物(来源细胞没有内源性整合rna聚合酶的编码序列/编码基因、也没有内源性整合dna聚合酶的编码序列/编码基因)、外源添加的rna聚合酶、能量系统、合成rna的底物、合成蛋白的底物、拥挤剂、外源镁离子(至少包括葡萄糖酸镁)、外源钾离子、缓冲液，还可选地包括以下任一种组分或其适当组合的分装容器：编码外源蛋白的核酸模板、其它外源镁离子、编码rna聚合酶的外源dna模板、外源添加的dna聚合酶、编码dna聚合酶的外源dna模板、其它dna扩增相关元件、合成dna的底物、翻译相关元件、rna扩增相关元件、rna酶抑制剂、抗氧化剂或还原剂、防冻剂、海藻糖、反应促进剂、消泡剂、烷烃、水性溶剂。所述细胞提取物优选地含有转运rna、核糖体。所述rna聚合酶独立地更优选为t7 rna聚合酶。所述dna聚合酶独立地更优选为phi29 dna聚合酶。所述细胞提取物优选为真核细胞提取物，更优选为克鲁维酵母细胞提取物，更优选为乳酸克鲁维酵母细胞提取物。
[0466]
3.本发明第三方面提供一种外源蛋白的合成方法，所述合成方法包括以下步骤：
[0467]
(i)提供本发明第一方面提供的所述cfps(mg )体系；
[0468]
(ii)添加编码外源蛋白的核酸模板，进行孵育反应，合成所述外源蛋白；
[0469]
所述cfps(mg )体系能够与所述编码外源蛋白的核酸模板共同提供合成外源蛋白所需的翻译相关元件；
[0470]
还可选地包括步骤(iii)：分离或/和检测所述外源蛋白。
[0471]
所述孵育反应，指进行体外蛋白合成反应，至少包括翻译过程(此时核酸模板可以仅包括mrna模板)，可选地包括转录过程、核酸复制过程(dna或/和rna的复制过程)。
[0472]
优选方式之一，采用编码外源蛋白的dna模板，相应地，孵育反应包括转录和翻译过程。
[0473]
分离或/和检测步骤
[0474]
所述外源蛋白的合成方法还可选地包括分离或/和检测所述外源蛋白的步骤。所述分离或/和检测方法，采用常规技术方法即可实现。
[0475]
通过检测、计算，可获得包括但不限于产量、纯度、分子量、蛋白功能等方面的结果。
[0476]
4.第二方面和第三方面中，各自独立地包括但不限于以下几种优选方式：
[0477]
(1)优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板含有能够被所述cfps(mg )体系所识别的启动子元件。
[0478]
(2)优选方式之一，所述cfps(mg )体系含有细胞提取物，所述编码外源蛋白的核酸模板含有所述细胞提取物能够识别的启动子元件。例如，细胞提取物中含有内源性表达的、与核酸模板上启动子元件相对应的rna聚合酶。
[0479]
(3)优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板中含有t7启动子，所述cfps(mg )体系包括t7 rna聚合酶。
[0480]
(4)优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板中含有t7启动子，所述cfps(mg )体系含有细胞提取物，所述细胞提取物含有内源性表达的t7 rna聚合酶。
[0481]
(5)优选地，所述编码外源蛋白的核酸模板含有能够启动外源蛋白的基因转录程序的t7启动子，也即外源蛋白的基因转录过程由核酸模板上的t7启动子启动。
[0482]
(6)优选方式之一，所述编码外源蛋白的核酸模板含有能够启动外源蛋白的基因转录程序的t7启动子，所述cfps(mg )体系包括t7 rna聚合酶。
[0483]
(7)优选方式之一，t7启动子位于核酸模板外源蛋白的编码序列的上游，启动外源蛋白的转录程序，所述cfps(mg )体系包括细胞提取物，所述细胞提取物含有内源性表达的t7 rna聚合酶。
[0484]
第二方面和第三方面中，所述编码外源蛋白的核酸模板各自独立地为dna模板、mrna模板、或者其组合；所述编码外源蛋白的核酸模板各自独立地优选为dna模板。
[0485]
5.本发明第四方面提供第一方面所述含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(cfps(mg )体系)的应用，应用于蛋白合成方面。所述应用于蛋白合成方面，包括但不限于，应用于蛋白制造，或者应用于基于蛋白合成的检测等方面。
[0486]
所述cfps(mg )体系的应用领域包括但不限于生物医药、分子生物、医学、体外检测、医疗诊断、再生医学、生物工程、组织工程、干细胞工程、基因工程、聚合物工程、表面工程、纳米工程、化妆品、食品、食品添加剂、营养剂、农业、饲料、生活用品、洗涤、环境、化学染色、荧光标记等领域。
[0487]
6.本发明第五方面提供葡萄糖酸镁在第一方面所述含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系中，或者在第二方面所述体外蛋白合成试剂盒中，或者在第三方面所述外源蛋白的合成方法中的应用。
[0488]
7.下面结合具体实施例和附图1-16，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于阐述说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先按照、参考上文所述的具体实施方式指引的条件，然后可通常地按照常规条件，例如“sambrook等人，分子克隆：实验室手册(new york:cold spring harbor laboratorypress,1989)”、《无细胞蛋白合成实验手册》“edited by alexander s.spirin and james r.swartz.cell-free protein synthesis:methods and protocols[m].2008”等文献中所述的实验条件，或者按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则本发明中提及的百分比和份数是重量百分比和重量份数。
[0489]
如无特别说明，则本发明实施例中所用的材料和试剂均为市售产品。
[0490]
本发明以乳酸克鲁维酵母(kluyveromyces lactis，简写为k.lactis或kl)作为实施例2-15的细胞提取物来源。本发明的实施例3-15均采用乳酸克鲁维酵母的改造菌株制备细胞提取物。需要说明的是，同样的设计和分析、实验方法也适用于本文所述的其它细胞提取物来源，包括但不限于，例如原核细胞(如大肠杆菌)，例如其它酵母细胞，例如植物细胞、昆虫细胞、动物细胞(如哺乳动物细胞，具体如鼠源、兔源、猴源、人源等)等其它真核细胞。
[0491]
本发明实施例中采用的质粒表达载体仅用于具体阐述本发明的实施方式，并非限定本发明的范围；其它可用于实施本发明的质粒载体包括但不限于现有商业途径可购买的
常见质粒载体，举例如：pet系列质粒、pgem系列质粒等。
[0492]
实施例3-15的体外无细胞蛋白合成体系中的各组分的浓度，外源dna模板的浓度，未特别标明的，均为终浓度；所述终浓度指所述cfps(mg )体系与外源dna模板构成的体外蛋白合成反应混合物中的起始浓度。
[0493]
实施例3-15中使用的四种镁源试剂，包括葡萄糖酸镁(分子量414.61)、l-谷氨酸镁(分子量388.61，四水合物)、醋酸镁(分子量214.45，四水合物)、l-天门冬氨酸镁(分子量324.54，二水合物)，每个分子均只提供一个镁原子，并提供两个酸根基团。需要说明的是，在反应混合体系中，镁离子和酸根残基的络合方式并不限于原料中的比例。
[0494]
本发明实施例中，均设置了阴性对照组(nc组)，至少不添加外源dna模板，其它反应条件与实施例中的实验组一致。反应3h、18～24h后，rfu值不超过20，可忽略，部分nc组的实验结果数据未在图表中显示。
[0495]
实施例1制备编码外源蛋白megfp的核酸模板
[0496]
1.1质粒构建：构建表达megfp的质粒载体，进行体外dna扩增，制备编码外源蛋白megfp的质粒。
[0497]
选取增强型绿色荧光蛋白的突变体(megfp)作为外源蛋白，作为目的表达产物。其中，megfp为增强型绿色荧光蛋白的a206k突变体，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
[0498]
选取质粒载体。采用针对乳酸克鲁维酵母细胞提取物设计的人工构建质粒载体，该人工构建质粒载体含有t7启动子、lac4终止子、5’utr和3’utr等功能元件。该质粒载体可以联合含有内源性表达的t7 rna聚合酶的乳酸克鲁维酵母细胞提取物，构建成体外无细胞蛋白合成体系，在体外表达各种外源蛋白。
[0499]
采用pcr扩增、同源片段重组方法，将含有megfp的编码基因的dna片段插入到质粒载体中，构建成表达megfp的质粒载体，记为质粒d2p-megfp(简记为pd2p-megfp)，共6056bp。质粒经基因测序确认正确。其中，编码megfp的基因序列如seq id no.1所示。
[0500]
所述pd2p-megfp质粒的图谱如图1所示，其结构元件组成如表2所示。
[0501]
表2编码外源蛋白megfp的质粒(pd2p-megfp)的结构元件说明
[0502][0503]
1.2体外dna扩增(dna复制过程)
[0504]
进行dna扩增。扩增体系各组分的终浓度分别为：1
×
phi29反应缓冲液(成分包括200mm tris-hcl,20mm mgcl2,10mm(nh4)2so4,10mm kcl,ph7.5)，4mm二硫苏糖醇(dtt)，0.1mg/ml牛血清白蛋白(bsa)，0.5mm脱氧核苷三磷酸混合物(dntps)，2～5μm随机引物，0.004～0.006mg/ml phi29 dna聚合酶，1.14ng/μl上述质粒(pd2p-megfp，作为模板)。将上述的反应体系混匀后，放置在室温过夜反应20小时，或者放置在37℃反应2小时，获得dna模板。测定260nm处od值，计算核酸浓度，反应液冷冻或冷藏备用，作为后续实施例中的核酸模板。
[0505]
实施例2制备细胞提取物
[0506]
本发明的实施例2-15均采用乳酸克鲁维酵母的改造菌株制备细胞提取物。
[0507]
细胞提取物的来源选取酵母细胞，具体为乳酸克鲁维酵母细胞(kluyveromyces lactis,k.lactis)。采用基于乳酸克鲁维酵母菌株atcc8585的改造菌株；采用cn109423496a所记载的方法，将t7 rna聚合酶的编码基因整合到乳酸克鲁维酵母的基因组中，获得改造菌株，使其可以内源性表达t7 rna聚合酶；以改造菌株培养出细胞原料，然后制备细胞提取物。根据对照实验比较，在不加入任何外源rna聚合酶的情况下，没有内源性整合t7 rna聚合酶的编码基因的乳酸克鲁维酵母体系，几乎不能进行体外蛋白合成反应；经上述内源性整合改造后，在不加入任何外源rna聚合酶的情况下可以实现外源蛋白的高效表达，可以作为外源添加方式的替代方式，且能够达到传统体外蛋白合成体系的蛋白合成水平(传统体外蛋白合成体系中，采用未进行t7 rna聚合酶内源性改造的菌株制备细胞
提取物，并在合成体系中添加外源t7 rna聚合酶)。本发明，添加葡萄糖酸镁作为外源镁离子的优化方法，对于未进行t7 rna聚合酶内源性改造的菌株(包括但不限于乳酸克鲁维酵母菌株)的体外蛋白合成体系同样适用，能取得相同或相类似的优化效果。
[0508]
乳酸克鲁维酵母细胞提取物的制备过程采用常规技术手段，参考cn109593656a记载的方法制备。制备步骤概括而言，包括：提供经发酵培养的乳酸克鲁维酵母细胞的适量原料，用液氮将细胞速冻，将细胞打碎，离心收集上清液，即可得到细胞提取物。
[0509]
所得乳酸克鲁维酵母细胞提取物中的蛋白浓度为20～40mg/ml。实施例3-15中，细胞提取物的添加量，如无特别说明，均指反应混合体系中的体积百分比。
[0510]
表3实施例3-15使用以下乳酸克鲁维酵母细胞提取物(k.lactis lysate)
[0511]
实施例编号来源细胞提取物编号实施例3乳酸克鲁维酵母yy1904291实施例4乳酸克鲁维酵母yy1904291实施例5乳酸克鲁维酵母cm191107实施例6乳酸克鲁维酵母cm191205实施例7乳酸克鲁维酵母cm191107实施例8乳酸克鲁维酵母cm191107实施例9乳酸克鲁维酵母cm191107实施例10乳酸克鲁维酵母cm191107实施例11乳酸克鲁维酵母cm191107实施例12乳酸克鲁维酵母cm191107实施例13乳酸克鲁维酵母yy1904281实施例14乳酸克鲁维酵母yy1904281实施例15乳酸克鲁维酵母yy1904281
[0512]
实施例3比较葡萄糖酸镁与醋酸镁对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0513]
3.1含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源rna聚合酶)
[0514]
每个体系体积为100μl，在平底的细胞培养板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。
[0515]
实验组(葡萄糖酸镁提供外源镁离子，记为gluconate组)：各组分的终浓度分别为：28.3mm ph8.0三羟甲基氨基甲烷(hcl调节ph值)，45.0mm醋酸钾，1.30mm二硫苏糖醇(dtt)，2.1％(w/v)pfg8000，6.0mm葡萄糖，0.076g/ml玉米糊精，1.62mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的终浓度均为1.62mm)，1.80mm碳酸氢钾，二十种氨基酸混合物(终浓度分别为：甘氨酸14.7mm、丙氨酸2.48mm、缬氨酸10.66mm、亮氨酸1.83mm、异亮氨酸4.77mm、苯丙氨酸3.75mm、脯氨酸1.74mm、色氨酸1.64mm、丝氨酸0.82mm、酪氨酸0.20mm、半胱氨酸6.17mm、蛋氨酸2.76mm、天冬酰胺3.36mm、谷氨酰胺0.63mm、苏氨酸0.83mm、天冬氨酸0.93mm、谷氨酸1.43mm、赖氨酸8.93mm、精氨酸4.49mm和组氨酸4.47mm)，60％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物(yy1904291)，22.4mm磷酸三钾，0.25～32mm的葡萄糖酸镁。
[0516]
阳性对照组(醋酸镁提供外源镁离子，记为acetate组)：终浓度为1～6mm的醋酸镁代替实验组中葡萄糖酸镁提供外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成
反应的实验条件与实验组完全一致。
[0517]
空白对照组(blank control group，bc组)：不加任何外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0518]
阴性对照组(negative control group，nc组)：不加任何外源镁离子，后续不加外源dna模板，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0519]
3.2进行体外蛋白合成反应：nc组不添加外源dna模板；向上述实验组、阳性对照组、空白对照组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中，分别加入编码megfp的dna模板(经上述实施例1中1.2进行体外扩增获得，终浓度56.9ng/μl)，混匀后，所有体系均放置在室温环境(18～30℃)中，摇床反应过夜，分别在3h、20～24h的时间点取样进行荧光蛋白活性测试。
[0520]
需要说明的是，3.1和3.2中所述终浓度均基于添加了dna模板的体外蛋白反应混合物而言。如无特别说明，实施例4-15中的终浓度也作相同解释。
[0521]
3.3荧光蛋白活性测定：反应结束后，将待测样品立即放置于infinite f200tecan多功能酶标仪，检测荧光信号强弱，以相对荧光单位值(relative fluorescence unit,rfu)作为活性单位。rfu值的大小能够反映megfp蛋白合成量的多少，megfp的质量体积浓度c(单位μg/ml)与rfu值之间的换算关系为：在本发明的测试范围内，c与rfu之间基本符合线性关系。
[0522]
分别对各反应体系的取样进行荧光测试。样品处理：4000转/分钟，4℃离心1分钟。将待测样品放置于infinite f200 tecan多功能酶标仪，采用的检测波长激发波长/发射波长(ex/em):488nm/507nm，测定相对荧光单位值(rfu)。
[0523]
3.4实验结果：如图4所示，横坐标标记为“组别-镁离子浓度值”，其中镁离子浓度值以mm为单位。图4中在3h、22h两个取样时间点，gluconate组均在加入2mm葡萄糖酸镁时具有较高的蛋白表达量，且均显著高于采用传统的外源镁离子供源醋酸镁(acetate组)的最适镁离子浓度时的最高蛋白表达量。
[0524]
3h时，gluconate组的最高蛋白表达量的rfu值(2mm，rfu值为1496
±
113)，相比于acetate组的最高蛋白表达量的rfu值(3mm，rfu值为1245
±
76)，提高20.2％。
[0525]
过夜22h时，gluconate组的最高蛋白表达量的rfu值(2mm，1587
±
328)，相比于acetate组的最高蛋白表达量的rfu值(3mm，rfu值为1448
±
266)，提高9.6％。
[0526]
阴性对照组的rfu值可以忽略(均值低于20)，图中未显示。
[0527]
实施例4考察葡萄糖酸镁含量对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0528]
4.1含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源rna聚合酶)
[0529]
每个体系体积为100μl，在平底的细胞培养板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。
[0530]
单一镁源实验组(单一镁源，记为gluconate组)：各组分的终浓度分别为：28.3mm ph8.0三羟甲基氨基甲烷(hcl调节ph值)，38.6mm醋酸钾，1.12mm二硫苏糖醇，1.8％(w/v)pfg8000，6.0mm葡萄糖，0.065g/ml玉米糊精，1.39mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的终浓度
均为1.39mm)，1.54mm碳酸氢钾，二十种氨基酸混合物(终浓度分别为：甘氨酸13.18mm、丙氨酸2.22mm、缬氨酸9.53mm、亮氨酸1.64mm、异亮氨酸4.27mm、苯丙氨酸3.35mm、脯氨酸1.55mm、色氨酸1.46mm、丝氨酸0.73mm、酪氨酸0.18mm、半胱氨酸5.52mm、蛋氨酸2.47mm、天冬酰胺3.00mm、谷氨酰胺0.56mm、苏氨酸0.74mm、天冬氨酸0.83mm、谷氨酸1.28mm、赖氨酸7.99mm、精氨酸4.01mm和组氨酸4.00mm)，70％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物(yy1904291)，20.4mm磷酸三钾，2.6～6.1mm葡萄糖酸镁；外源镁离子中葡萄糖酸镁的摩尔百分比为100％。
[0531]
混合镁源实验组(葡萄糖酸镁和醋酸镁共同提供外源镁离子，记为mix(gluconate acetate)组)：外源镁离子为葡萄糖酸镁和醋酸镁的混合物，葡萄糖酸镁的终浓度固定为1.61mm，醋酸镁的终浓度为0.25～4.0mm，相应地，葡萄糖酸镁所占的摩尔百分比为86.6％～28.7％；其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0532]
阴性对照组(negative control group，nc组)：不加任何外源镁离子，后续不加外源dna模板，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0533]
4.2进行体外蛋白合成反应：nc组不添加外源dna模板；向上述单一镁源实验组、混合镁源实验组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度56.9ng/μl编码megfp的dna模板(采用上述实施例1中1.2的方法进行体外扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在室温环境(18～30℃)中，摇床反应过夜，分别在3h、20～24h的时间点取样进行荧光蛋白活性测试。
[0534]
4.3荧光蛋白活性测定：采用实施例3中3.3的方法，测定样品中所合成的外源荧光蛋白megfp的rfu值。
[0535]
4.4实验结果：如图5所示，横坐标以“镁离子总浓度(葡萄糖酸镁百分比)”的方式标注。图5中在3h、22h两个取样时间点，单一镁源的gluconate组均在加入3.6mm葡糖糖酸镁时具有高的蛋白表达量，3h时rfu值为2404
±
161，22h时rfu值为3436
±
25；混合镁源实验组均在镁离子总浓度3.6mm且葡萄糖酸镁摩尔百分比44.6％时具有最高的蛋白表达量，3h时rfu值为1650
±
90，22h时rfu值为2491
±
226。
[0536]
外源镁离子浓度为3.6mm时，单一镁源的gluconate组(葡萄糖酸镁浓度100％)的蛋白合成量高于混合镁源实验组(葡萄糖酸镁浓度44.6％)，3h时rfu值提高45.7％，22h时rfu值提高37.9％。可见对于葡萄糖酸镁和醋酸镁的混合镁源，葡萄糖酸镁含量增加对蛋白合成量有利。此外，根据混合镁源的实验数据可知，外源蛋白合成量(以rfu值指示)的最佳条件，既需要一定的镁离子总浓度，还需要一定的葡萄糖酸镁比例；镁离子总浓度过低或过高，葡萄糖酸镁比例过低，都会导致蛋白合成能力下降。
[0537]
阴性对照组的rfu值可以忽略(均值低于20)，图中未显示。
[0538]
实施例5比较葡萄糖酸镁与谷氨酸镁对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0539]
5.1含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源rna聚合酶)
[0540]
每个体系体积为100μl，在平底的细胞培养板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。
[0541]
实验组(记为gluconate组)：各组分的终浓度分别为：9.78mm ph8.0三羟甲基氨基
甲烷(采用hcl调节ph，tris-hcl)，80mm醋酸钾，15mm葡萄糖，320mm麦芽糊精(以葡萄糖单位计量)，24mm的磷酸钾，1.8mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的终浓度均为1.8mm)，0.7mm的氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，每种氨基酸的终浓度均为0.7mm)，80mm醋酸钾，2％(w/v)聚乙二醇8000，0.06g/ml海藻糖，80％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物(cm191107)，0.5～8mm葡萄糖酸镁。
[0542]
阳性对照组(positive group，记为pc组，也记为glutamate组)：终浓度为2～9mm的谷氨酸镁代替实验组中葡萄糖酸镁提供外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0543]
空白对照组(blank control group，bc组)：不加任何外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0544]
阴性对照组(negative control group，nc组)：不加任何外源镁离子，后续不加外源dna模板，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0545]
5.2进行体外蛋白合成反应：nc组不添加外源dna模板；向上述实验组、阳性对照组、空白对照组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度11.9ng/μl编码megfp的dna模板(采用上述实施例1中1.2的方法进行体外扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在室温环境(18～30℃)中，摇床反应过夜，分别在3h、20～24h的时间点取样进行荧光蛋白活性测试。
[0546]
5.3荧光蛋白活性测定：采用实施例3中3.3的方法，测定样品中所合成的外源荧光蛋白megfp的rfu值。
[0547]
5.4实验结果：如图6所示，横坐标标记为“组别-镁离子浓度值”，其中镁离子浓度值以mm为单位。采用谷氨酸镁作为镁源的pc组中，在镁离子浓度8mm时蛋白合成量达到峰值。采用葡萄糖酸镁作为镁源时，5～8mm范围内，蛋白合成量均高于pc组的峰值，3h时rfu值比pc组峰值提高16.9％～52.4％，20h时rfu值比pc组峰值提高15.9％～57.7％。此外，采用葡糖糖酸镁作为镁源时，在4mm时rfu值基本达到pc组峰值的一半(3h时达到45.3％，20h时达到53.4％)，在4.5mm时rfu值基本达到pc组峰值的80％以上(3h时和20h时分别达到83.3％、83.6％)。
[0548]
实施例6比较葡萄糖酸镁与谷氨酸镁对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0549]
6.1含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源rna聚合酶)
[0550]
每个体系体积为100μl，在平底的细胞培养板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。
[0551]
实验组(记为gluconate组)：各组分的终浓度分别为：9.78mm ph8.0三羟甲基氨基甲烷(采用hcl调节ph，tris-hcl)，80mm醋酸钾，15mm葡萄糖，320mm麦芽糊精(以葡萄糖单位计量)，24mm的磷酸钾，1.8mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的终浓度均为1.8mm)，0.7mm氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和
组氨酸，每种氨基酸的终浓度均为0.7mm)，80mm醋酸钾，2％(w/v)聚乙二醇8000，0.06g/ml海藻糖，80％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物(cm191205)、1～10mm葡萄糖酸镁。
[0552]
阳性对照组(positive group，记为pc组，还记为glutamate组)：终浓度为2～11mm的谷氨酸镁代替实验组中葡萄糖酸镁提供外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0553]
空白对照组(blank control group，bc组)：不加任何外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0554]
阴性对照组(negative control group，nc组)：不加任何外源镁离子，后续不加外源dna模板，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0555]
6.2进行体外蛋白合成反应：nc组不添加外源dna模板；向上述实验组、阳性对照组、空白对照组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度11.9ng/μl编码megfp的dna模板(采用上述实施例1中1.2的方法进行体外扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在室温环境(18～30℃)中，摇床反应过夜，分别在3h、19h的时间点取样进行荧光蛋白活性测试。
[0556]
6.3荧光蛋白活性测定：采用实施例3中3.3的方法，测定样品中所合成的外源荧光蛋白megfp的rfu值。
[0557]
6.4实验结果：如图7所示，横坐标标记为“组别-镁离子浓度值”，其中镁离子浓度值以mm为单位。gluconate组在3mm葡萄糖酸镁时rfu值达到峰值(3h和19h均为峰值)，pc组在4mm谷氨酸镁时rfu读数达到峰值(3h和19h均为峰值)。gluconate组的rfu值相比于pc组的最高rfu值，可提高30％以上。gluconate组的rfu峰值，在3h时相比于pc组峰值提高26.7％，在19h时相比于pc组峰值提高33.4％。此外，在19h时，gluconate组中2mm葡萄糖酸镁浓度时，rfu值相比于pc组峰值的提高程度也能达到20.9％。
[0558]
实施例7考察不同镁源对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0559]
7.1含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源rna聚合酶)
[0560]
每个体系体积为100μl，在平底的细胞培养板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。
[0561]
实验组(记为gluconate组)：各组分的终浓度分别为：9.78mm ph8.0三羟甲基氨基甲烷(采用hcl调节ph，tris-hcl)，80mm醋酸钾，15mm葡萄糖，320mm麦芽糊精(以葡萄糖单位计量)，24mm的磷酸钾，1.8mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的终浓度均为1.8mm)，0.7mm氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，每种氨基酸的终浓度均为0.7mm)，80mm醋酸钾，2％(w/v)聚乙二醇8000，0.06g/ml海藻糖，80％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物(cm191107)，外源镁离子总浓度3mm；其中，外源镁离子构成方式如表4所示。
[0562]
表4外源镁离子的提供方式
[0563][0564]
其中，mix-i为葡萄糖酸镁与醋酸镁的混合镁源，mix-ii为葡萄糖酸镁与谷氨酸镁的混合镁源，mix-iii为醋酸镁与谷氨酸镁的混合镁源。mix-i(25％)、mix-i(50％)等的括号中的数字对应葡萄糖酸镁的摩尔百分含量。
[0565]
空白对照组(blank control group，bc组)：不加任何外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0566]
阴性对照组(negative control group，nc组)：不加任何外源镁离子，后续不加外源dna模板，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0567]
7.2进行体外蛋白合成反应：nc组不添加外源dna模板；向上述实验组、空白对照组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度16.6ng/μl编码megfp的dna模板(采用上述实施例1中1.2的方法进行体外扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在室温环境(18～30℃)中，摇床反应过夜，分别在3h、20～24h的时间点取样进行荧光蛋白活性测试。
[0568]
7.3荧光蛋白活性测定：采用实施例3中3.3的方法，测定样品中所合成的外源荧光蛋白megfp的rfu值。
[0569]
7.4实验结果：如图8所示。采用单一镁源，3h时，3mm葡萄糖酸镁(gluconate)的rfu值分别是醋酸镁(acetate)、谷氨酸镁(glutamate)的14.3倍、2.9倍；20h时，3mm葡萄糖酸镁(gluconate)的rfu值分别是醋酸镁(acetate)、谷氨酸镁(glutamate)的18.9倍、2.8倍。3h和20h时，对于葡萄糖酸镁与醋酸镁的混合镁源，葡萄糖酸镁的含量越高，体系的蛋白合成量(rfu值指示)越高。20h时，对于葡萄糖酸镁与谷氨酸镁的混合镁源，葡萄糖酸镁的含量越高，体系的蛋白合成量越高。3h时，mix-i(25％)组、mix-ii(25％)组、mix-i(50％)组、mix-ii(50％)组的rfu值分别达到gluconate组的27.5％、66.6％、56.5％、80.2％。20h时，mix-i(25％)组、mix-ii(25％)组、mix-i(50％)组、mix-ii(50％)组、mix-i(75％)组、mix-ii(75％)组的rfu值分别达到gluconate组的25.5％、62.4％、53.5％、79.8％、58.9％、82.4％。
[0570]
实施例8考察不同镁源对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0571]
8.1含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源rna聚合酶)
[0572]
每个体系体积为100μl，在平底的细胞培养板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。
[0573]
实验组：各组分的终浓度分别为：9.78mm ph8.0三羟甲基氨基甲烷(采用hcl调节ph，tris-hcl)，80mm醋酸钾，15mm葡萄糖，320mm麦芽糊精(以葡萄糖单位计量)，24mm的磷酸钾，1.8mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的终浓度均为1.8mm)，0.7mm氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，每种氨基酸的终浓度均为0.7mm)，80mm醋酸钾，2％(w/v)聚乙二醇8000，0.06g/ml海藻糖，80％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物(cm191107)，2～12mm葡萄糖酸镁。
[0574]
阳性对照组1(positive group，记为pc1组，还记为ace组)：终浓度为2～16mm的醋酸镁代替实验组中葡萄糖酸镁提供外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0575]
阳性对照组2(positive group，记为pc2组，还记为glut组)：终浓度为2～10mm的谷氨酸镁代替实验组中葡萄糖酸镁提供外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0576]
空白对照组(blank control group，bc组)：不加任何外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0577]
阴性对照组(negative control group，nc组)：不加任何外源镁离子，后续不加外源dna模板，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0578]
8.2进行体外蛋白合成反应：nc组不添加外源dna模板；向上述实验组、pc1组、pc2组、空白对照组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度40.4ng/μl编码megfp的dna模板(采用上述实施例1中1.2的方法进行体外扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在室温环境(18～30℃)中，摇床反应过夜，分别在3h、20～24h的时间点取样进行荧光蛋白活性测试。
[0579]
8.3荧光蛋白活性测定：采用实施例3中3.3的方法，测定样品中所合成的外源荧光蛋白megfp的rfu值。
[0580]
8.4实验结果：如图9所示，横坐标标记为“组别-镁离子浓度值”，其中镁离子浓度值以mm为单位。图9中在3h、22h两个取样时间点，gluc组均在加入4mm葡糖糖酸镁时具有最高的蛋白表达量(3h时rfu值为910
±
14，22h时rfu值为1430
±
56)。
[0581]
3h时，gluc组的最高rfu值，相比于ace组的最高rfu值(14mm，rfu值为659
±
21)提高38.1％，相比于glut组的最高rfu值(6mm，rfu值为810
±
55)提高12.4％。
[0582]
20h时，gluc组的最高rfu值，相比于ace组16mm的rfu值(1006
±
52)提高42.2％，相比于glut组的最高rfu值(6mm，rfu值为1095
±
34)提高30.6％。
[0583]
阴性对照组的rfu值可以忽略(均值低于15)，图中未显示。
[0584]
实施例9考察不同镁源对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0585]
9.1含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源rna聚合酶)
[0586]
每个体系体积为100μl，在平底的细胞培养板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。
[0587]
实验组(记为gluc组)：各组分的终浓度分别为：9.78mm ph8.0三羟甲基氨基甲烷(采用hcl调节ph，tris-hcl)，80mm醋酸钾，15mm葡萄糖，320mm麦芽糊精(以葡萄糖单位计量)，24mm的磷酸钾，1.8mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的终浓度均为1.8mm)，0.7mm氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，每种氨基酸的终浓度均为0.7mm)，80mm醋酸钾，2％(w/v)聚乙二醇8000，0.06g/ml海藻糖，80％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物(cm191107)，2～10mm葡萄糖酸镁。
[0588]
阳性对照组1(positive group，记为pc1组，还记为ace组)：终浓度为6～24mm的醋酸镁代替实验组中葡萄糖酸镁提供外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0589]
阳性对照组2(positive group，记为pc2组，还记为glut组)：终浓度为2～12mm的谷氨酸镁代替实验组中葡萄糖酸镁提供外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0590]
空白对照组(blank control group，bc组)：不加任何外源镁离子，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0591]
阴性对照组(negative control group，nc组)：不加任何外源镁离子，后续不加外源dna模板，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0592]
9.2进行体外蛋白合成反应：nc组不添加外源dna模板；向上述实验组、pc1组、pc2组、空白对照组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度40.4ng/μl编码megfp的dna模板(采用上述实施例1中1.2的方法进行体外扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在室温环境(18～30℃)中，摇床反应过夜，分别在3h、20～24h的时间点取样进行荧光蛋白活性测试。
[0593]
9.3荧光蛋白活性测定：采用实施例3中3.3的方法，测定样品中所合成的外源荧光蛋白megfp的rfu值。
[0594]
9.4实验结果：如图10-11所示，其中0mm对应bc组。图10中在3h时，gluc组在加入6mm葡糖糖酸镁时具有最高的蛋白表达量，rfu值为829
±
6；图11中在20h时，gluc组在加入6mm葡糖糖酸镁时具有最高的蛋白表达量，rfu值为1333
±
12。
[0595]
3h时，gluc组的最高rfu值，相比于ace组的最高rfu值(17mm，rfu值为511
±
19)提高62.3％，相比于glut组的最高rfu值(7mm，rfu值为594
±
33)提高39.5％。gluc组在5～6mm葡萄糖酸镁的rfu值高于ace组的rfu峰值和glut组的rfu峰值。
[0596]
20h时，gluc组的最高rfu值，相比于ace组17mm的rfu值(993
±
26)提高34.3％，相比于glut组的最高rfu值(7mm，rfu值为957
±
37)提高39.3％。gluc组在4.5～6mm葡萄糖酸镁的rfu值高于ace组的rfu峰值和glut组的rfu峰值。
[0597]
阴性对照组的rfu值可以忽略(均值低于15)，图中未显示。
[0598]
实施例10考察不同镁源对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0599]
10.1含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源rna聚合酶)
[0600]
每个体系体积为100μl，在平底的细胞培养板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。
[0601]
实验组：各组分的终浓度分别为：9.78mm ph8.0三羟甲基氨基甲烷(采用hcl调节ph，tris-hcl)，80mm醋酸钾，15mm葡萄糖，320mm麦芽糊精(以葡萄糖单位计量)，24mm磷酸钾，1.8mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的终浓度均为1.8mm)，0.7mm氨基酸混合物(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸，每种氨基酸的终浓度均为0.7mm)，80mm醋酸钾，2％(w/v)聚乙二醇8000，0.06g/ml海藻糖，80％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物(cm191107)，外源镁离子6mm；其中，外源镁离子的提供方式如表5所示。
[0602]
表5外源镁离子的提供方式
[0603][0604]
其中，mix-i为葡萄糖酸镁与醋酸镁的混合镁源，mix-ii为葡萄糖酸镁与谷氨酸镁的混合镁源。mix-i(25％)、mix-i(50％)等的括号中的数字对应葡萄糖酸镁的摩尔百分含量。
[0605]
阴性对照组(negative control group，nc组)：不加任何外源镁离子，后续不加外源dna模板，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0606]
10.2进行体外蛋白合成反应：nc组不添加外源dna模板；向上述实验组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度40.4ng/μl编码megfp的dna模板(采用上述实施例1中1.2的方法进行体外扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在室温环境(18～30℃)中，摇床反应过夜，分别在3h、20～24h的时间点取样进行荧光蛋白活性测试。
[0607]
10.3荧光蛋白活性测定：采用实施例3中3.3的方法，测定样品中所合成的外源荧光蛋白megfp的rfu值。
[0608]
10.4实验结果：如图12所示。20h时，对于葡萄糖酸镁与醋酸镁的混合镁源，葡萄糖酸镁的含量越高，体系的蛋白合成量(rfu值指示)越高。3h和20h时，对于葡萄糖酸镁与谷氨酸镁的混合镁源，葡萄糖酸镁的含量越高，体系的蛋白合成量越高。
[0609]
实施例11考察不同镁源对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0610]
除镁离子总浓度为5mm，且外源镁离子的提供方式不同之外，实施例11的其余实验参数与实施例10相同。
[0611]
其中，本实施例中外源镁离子的提供方式如表6所示。
[0612]
表6外源镁离子的提供方式
[0613][0614]
其中，mix-i为葡萄糖酸镁与醋酸镁的混合镁源，mix-ii为葡萄糖酸镁与谷氨酸镁的混合镁源，mix-iii为醋酸镁与谷氨酸镁的混合镁源。mix-i(25％)、mix-i(50％)等的括号中的数字对应葡萄糖酸镁的摩尔百分含量。
[0615]
其中，nc组不加dna模板；bc组加入与其它体系等量的dna模板。
[0616]
实验结果如图13所示。3h和22h时，对于葡萄糖酸镁与醋酸镁的混合镁源，葡萄糖酸镁的含量越高，体系的蛋白合成量(rfu值指示)越高。22h时，对于葡萄糖酸镁与谷氨酸镁的混合镁源，葡萄糖酸镁的含量越高，体系的蛋白合成量越高。
[0617]
采用单一镁源时，3h时，3mm葡萄糖酸镁(gluconate)的rfu值分别是醋酸镁(acetate)、谷氨酸镁(glutamate)的65.5倍、3.45倍；22h时，3mm葡萄糖酸镁(gluconate)的rfu值分别是醋酸镁(acetate)、谷氨酸镁(glutamate)的67.1倍、3.65倍。
[0618]
比较3个含有50％葡萄糖酸镁的组mix-i(50％)、mix-iii、mix-ii(50％)，分别含谷氨酸镁0％、25％、50％，3h和22h时蛋白合成量(rfu值)均随谷氨酸镁含量的增加而增大。
[0619]
还比较两个含有25％萄糖酸镁的组mix-i(25％)、mix-ii(25％)，以及含有75％萄糖酸镁的组mix-i(75％)、mix-ii(75％)，结果显示，mix-ii混合体系的蛋白合成量均高于mix-i的混合体系。
[0620]
3h时，mix-i(25％)组、mix-ii(25％)组、mix-i(50％)组、mix-ii(50％)组的rfu值分别达到gluconate组的10.4％、58.4％、28.1％、93.7％。20h时，mix-i(25％)组、mix-ii(25％)组、mix-i(50％)组、mix-ii(50％)组、mix-i(75％)组、mix-ii(75％)组的rfu值分别达到gluconate组的20.1％、52.3％、38.8％、74.9％、66.9％、80.9％。
[0621]
实施例12考察葡萄糖酸镁与天门冬氨酸镁对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力
的影响
[0622]
除外源镁离子的提供方式不同之外，实施例12的其余实验参数与实施例10相同。
[0623]
其中，本实施例中外源镁离子的提供方式如表7所示。
[0624]
表7外源镁离子的提供方式
[0625][0626]
其中，gluconate的数据与gluc-6为同一组数据。
[0627]
其中，mix为葡萄糖酸镁与l-天门冬氨酸镁的混合镁源。
[0628]
其中，nc组不加外源镁离子也不加dna模板；bc组不加外源镁离子，但加入与其它体系等量的dna模板。
[0629]
其中，mix-i(25％)、mix-i(50％)等的括号中的数字对应葡萄糖酸镁的摩尔百分含量。
[0630]
实验结果如图14所示。外源镁离子为2～8mm葡萄糖酸镁时，3h时在6mm处rfu值最高(446
±
49)，22h时在7mm处rfu值最高(1545
±
20)。外源镁离子为2～8mm l-天门冬氨酸镁镁时，3h时在5mm处rfu值最高(643
±
16)，22h时在5mm处rfu值最高(1846
±
134)。l-天门冬氨酸镁对应的rfu峰值高于葡萄糖酸镁。
[0631]
在本实施例中，l-天门冬氨酸镁对体系的蛋白合成能力具有更佳的促进效果。
[0632]
实施例13考察葡萄糖酸镁与天门冬氨酸镁的混合镁源对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0633]
13.1含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源rna聚合酶)
[0634]
每个体系体积为100μl，在平底的细胞培养板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。
[0635]
实验组i(记为gluc组)：各组分的终浓度分别为：25.0mm ph8.0三羟甲基氨基甲烷(hcl调节ph值)，34.1mm醋酸钾，1.0mm二硫苏糖醇(dtt)，1.6％(w/v)pfg8000，4.5mm葡萄糖，0.058g/ml玉米糊精，1.2mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的终浓度均为1.2mm)，1.4mm碳酸氢钾，二十种氨基酸混合物(终浓度分别为：甘氨酸5.12mm、丙氨酸0.86mm、缬氨酸3.70mm、亮氨酸0.64mm、异亮氨酸1.66mm、苯丙氨酸1.30mm、脯氨酸0.60mm、色氨酸0.57mm、丝氨酸0.29mm、酪氨酸0.07mm、半胱氨酸2.14mm、蛋氨酸0.96mm、天冬酰胺1.17mm、谷氨酰胺0.22mm、苏氨酸0.29mm、天冬氨酸0.32mm、谷氨酸0.48mm、赖氨酸3.10mm、精氨酸1.56mm和组氨酸1.55mm)，41.0mg/ml海藻糖，5.8％(v/v)角鲨烷，63％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物(yy1904291)，24.5mm磷酸三钾，1.80mm葡萄糖酸镁。
[0636]
实验组ii(记为asp组)：除镁离子采用终浓度为1～28mm的l-天门冬氨酸镁外，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与上述实验组i完全一致。
[0637]
阴性对照组(negative control group，nc组)：不加任何外源镁离子，后续不加外源dna模板，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组i、实验组ii完全一致。
[0638]
13.2进行体外蛋白合成反应：nc组不添加外源dna模板；向上述实验组i、实验组ii的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度33ng/μl编码megfp的dna模板(采用上述实施例1中1.2的方法进行体外扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在室温环境(18～30℃)中，摇床反应过夜，分别在3h、20～24h的时间点取样进行荧光蛋白活性测试。
[0639]
13.3荧光蛋白活性测定：采用实施例3中3.3的方法，测定样品中所合成的外源荧光蛋白megfp的rfu值。
[0640]
13.4实验结果(未附图)：21h时，采用1～28mm l-天门冬氨酸镁时，在4mm处具有最高rfu值(2030
±
44)。而采用1.80mm葡萄糖酸镁在21h时rfu值为2970
±
32，比l-天门冬氨酸镁的最高值高出46.3％。
[0641]
实施例14考察葡萄糖酸镁与天门冬氨酸镁的混合镁源对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0642]
14.1含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源rna聚合酶)
[0643]
每个体系体积为100μl，在平底的细胞培养板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。
[0644]
实验组：各组分的终浓度分别为：25.08mm ph8.0三羟甲基氨基甲烷(hcl调节ph值)，34.2mm醋酸钾，0.99mm二硫苏糖醇，1.6％(w/v)pfg8000，4.58mm葡萄糖，0.058g/ml玉米糊精，1.23mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的终浓度均为1.23mm)，1.37mm碳酸氢钾，二十种氨基酸混合物(终浓度分别为：甘氨酸4.18mm、丙氨酸0.70mm、缬氨酸3.02mm、亮氨酸0.52mm、异亮氨酸1.36mm、苯丙氨酸1.06mm、脯氨酸0.49mm、色氨酸0.46mm、丝氨酸0.23mm、酪氨酸0.06mm、半胱氨酸1.75mm、蛋氨酸0.78mm、天冬酰胺0.95mm、谷氨酰胺0.18mm、苏氨酸0.23mm、天冬氨酸0.93mm、谷氨酸0.41mm、赖氨酸2.53mm、精氨酸1.27mm和组氨酸1.27mm)，
41.1mg/ml海藻糖，6.0％(v/v)角鲨烷，60％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物(yy1904281)，28.5mm磷酸三钾，1.8mm葡萄糖酸镁，0～9mm l-天门冬氨酸镁。
[0645]
阴性对照组(negative control group，nc组)：不加任何外源镁离子，后续不加外源dna模板，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0646]
14.2进行体外蛋白合成反应：nc组不添加外源dna模板；向上述实验组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度34.2ng/μl编码megfp的dna模板(采用上述实施例1中1.2的方法进行体外扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在室温环境(18～30℃)中，摇床反应过夜，分别在3h、20～24h的时间点取样进行荧光蛋白活性测试。
[0647]
14.3荧光蛋白活性测定：采用实施例3中3.3的方法，测定样品中所合成的外源荧光蛋白megfp的rfu值。
[0648]
14.4实验结果：如图15所示。横坐标的括号外为镁离子总浓度，括号内为葡萄糖酸镁的摩尔百分比。镁离子总浓度为3.8mm时蛋白合成量最高，此时葡萄糖酸镁和l-天门冬氨酸镁的浓度相接近，而且，3h时rfu值为1805
±
186，22h时rfu值为3762
±
381。对比1.8(100％)和2.8(64.3％)的rfu值结果，虽然镁离子总浓度在增加，但随着葡萄糖酸镁比例的下降，rfu值反而下降。
[0649]
阴性对照组的rfu值可以忽略(均值低于20)，图中未显示。
[0650]
实施例15考察葡萄糖酸镁、天门冬氨酸镁、醋酸镁的混合镁源对体外蛋白合成体系的蛋白合成能力的影响
[0651]
15.1含外源镁离子的体外无细胞蛋白合成体系(不添加外源rna聚合酶)
[0652]
每个体系体积为100μl，在平底的细胞培养板中进行反应。每个样品设置3个平行样，计算均值和标准偏差(error bar)。
[0653]
实验组：各组分的终浓度分别为：21.48mm ph8.0三羟甲基氨基甲烷(hcl调节ph值)，29.3mm醋酸钾，1.4％(w/v)pfg8000，3.92mm葡萄糖，0.050g/ml玉米糊精，1.05mm核苷三磷酸混合物(腺嘌呤核苷三磷酸、鸟嘌呤核苷三磷酸、胞嘧啶核苷三磷酸和尿嘧啶核苷三磷酸，每种核苷三磷酸的终浓度均为1.05mm)，1.37mm碳酸氢钾，二十种氨基酸混合物(终浓度分别为：甘氨酸9.66mm、丙氨酸1.63mm、缬氨酸6.99mm、亮氨酸1.20mm、异亮氨酸3.13mm、苯丙氨酸2.46mm、脯氨酸1.14mm、色氨酸1.07mm、丝氨酸0.54mm、酪氨酸0.13mm、半胱氨酸5.86mm、蛋氨酸1.81mm、天冬酰胺2.02mm、谷氨酰胺0.41mm、苏氨酸0.54mm、天冬氨酸0.61mm、谷氨酸0.94mm、赖氨酸5.86mm、精氨酸2.94mm和组氨酸2.93mm)，50％(v/v)乳酸克鲁维酵母细胞提取物(yy1904281)，20.99mm磷酸三钾，36.3mg/ml海藻糖，2.99％(v/v)角鲨烷，1.54mm葡萄糖酸镁，1.87mm天门冬氨酸镁，1～5mm醋酸镁。
[0654]
阴性对照组(negative control group，nc组)：不加任何外源镁离子，后续不加外源dna模板，其它组分的种类与含量以及进行体外蛋白合成反应的实验条件与实验组完全一致。
[0655]
15.2进行体外蛋白合成反应：nc组不添加外源dna模板；向上述实验组的每个独立的体外无细胞蛋白合成体系中分别加入终浓度34.2ng/μl编码megfp的dna模板(采用上述实施例1中1.2的方法进行体外扩增获得)，混匀后，所有体系均放置在室温环境(18～30℃)中，摇床反应过夜，分别在3h、20～24h的时间点取样进行荧光蛋白活性测试。
[0656]
15.3荧光蛋白活性测定：采用实施例3中3.3的方法，测定样品中所合成的外源荧光蛋白megfp的rfu值。
[0657]
15.4实验结果：如图16所示。横坐标的括号外为镁离子总浓度，括号内为葡萄糖酸镁的摩尔百分比。葡萄糖酸镁和l-天门冬氨酸镁的镁离子总浓度达到3.41mm的基础上，随着醋酸镁的添加，外源蛋白的合成被抑制。3.41mm时rfu值最高，3h时rfu值为1992
±
133，22h时rfu值为4359
±
383。
[0658]
比较图15和图16。图15中镁离子总浓度为4.8mm(37.5％)时，仍有相当高的蛋白表达量，3h时rfu值(1580.5
±
131)达到3.8(47.4％)时rfu值(1805
±
186)的87.6％，22h时rfu值(3350
±
108)达到3.8(47.4％)时rfu值的89.1％。而在图15中，仅仅添加1mm醋酸镁使镁离子总浓度增加到4.41mm，蛋白合成量就受到相当的抑制，3h时rfu值仅为3.41mm时的35.6％，22h时rfu值仅为3.41mm时的30.9％。可见，体系对葡萄糖酸镁和天门冬氨酸镁的耐受度高于醋酸镁，体系对醋酸镁浓度更敏感。
[0659]
综上所述，采用葡萄糖酸镁提供外源镁离子，过夜反应后：最高蛋白表达量相对于醋酸镁可提高40％以上，相对于l-谷氨酸镁可提高55％以上。启动体外蛋白合成反应的早期，3h时：最高蛋白表达量相对于醋酸镁可提高60％以上；相对于l-谷氨酸镁可提高50％以上。葡萄糖酸镁相比于传统的醋酸镁、谷氨酸镁，具有普遍的提高蛋白合成能力的效果；在某些实施例中，葡萄糖酸镁对应的蛋白合成量还高出l-天门冬氨酸镁45％以上。在混合镁源体系中，特别是葡萄糖酸镁与传统的醋酸镁、谷氨酸镁的混合体系中，蛋白合成量随葡萄糖酸镁含量的增加而增大。此外，在一些实施例中，葡萄糖酸镁与谷氨酸镁的混合镁源体系优于葡萄糖酸镁与醋酸镁的混合镁源体系。
[0660]
上述仅为本发明的部分优选实施例，本发明并不仅限于上述实施例的内容。对于本领域中的技术人员来说，在本发明技术方案的构思范围内或指导、启示下，可以有各种变化和更改，所作的任何具有等同技术效果的变化和更改，均在本发明保护范围之内。
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