一种新型的抗肿瘤转换受体T细胞的制作方法

一种新型的抗肿瘤转换受体t细胞
技术领域
1.本发明属于肿瘤的免疫治疗领域，具体涉及一种新型的抗肿瘤转换受体t细胞。


背景技术：

2.近年来，细胞过继免疫治疗(adoptive cellular immunotherapy,aci)在血液系统肿瘤和实体肿瘤治疗中的应用研究引起了人们的普遍关注。特别是car
‑
t(chimeric antigen receptor t cell)在血液系统恶性肿瘤的临床治疗取得显著疗效，比如靶向cd19的car
‑
t已经批准用于治疗急性淋巴细胞白血病(all)和复发或难治型大b细胞淋巴瘤。然而，car
‑
t技术针对实体瘤无法取得与血液肿瘤同样的疗效，其原因是实体瘤具有更为复杂的免疫抑制微环境，包括乏氧、低营养的代谢环境、pd
‑
l1/pd
‑
1等介导免疫抑制的通路等。
3.目前以pd
‑
1和pd
‑
l1为靶点的免疫检查点抑制剂药物在临床上获得重大进展，通过阻断pd
‑
1和pd
‑
l1免疫检查点通路，恢复t细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。但是由于晚期肿瘤患者t细胞的数量有限，并且t细胞杀伤肿瘤细胞时缺少共刺激信号，导致t细胞在杀伤肿瘤细胞时因耗竭而死亡，因而大大限制了pd
‑
1和pd
‑
l1为靶点的抗体药物的临床疗效。
4.研究一种可以增强t细胞的增殖和扩增能力，适用于实体瘤治疗的产品具有重要意义。


技术实现要素：

5.本发明要解决的问题是：提供一种新型的抗肿瘤转换受体t细胞(pdl1/cd28 t细胞)及其制备方法和应用。转换受体t细胞可通过与pdl1结合来传递激活信号(来自转换受体下游的cd28分子)而不是抑制信号，进而逆转pdl1通路对t细胞的免疫抑制，进一步增强t细胞的杀伤能力和增殖活性。
6.本发明技术方案如下：
7.一种pd
‑
l1抗体，其氨基酸序列如seq id no.5～8任一所示。
8.一种基因片段，它编码氨基酸序列如seq id no.5～8任一所示蛋白。
9.如前述的基因片段，所述基因片段的序列如seq id no.1～4任一所示。
10.一种抗肿瘤转换受体，其序列依次包括如下4部分：
11.(1)靶向细胞膜的信号肽段；
12.(2)抗pd
‑
l1单链抗体段；
13.(3)cd28跨膜段；
14.(4)cd28胞内段；
15.所述部分(2)的序列如seq id no.5～8任一所示。
16.如前述的抗肿瘤转换受体，所述部分(2)的序列如seq id no.5所示。
17.如前述的抗肿瘤转换受体，所述部分(1)的序列如seq id no.15所示；
18.和/或，所述部分(3)的序列如seq id no.17所示；
19.和/或，所述部分(4)的序列如seq id no.18所示。
20.如前述的抗肿瘤转换受体，所述部分(2)和部分(3)之间还有连接肽段，优选地，所述连接肽段序列如seq id no.16所示。
21.如前述的抗肿瘤转换受体，序列如seq id no.14所示。
22.编码前述抗肿瘤转换受体的基因片段。
23.一种重组病毒，所述病毒携带前述基因片段。
24.如前述的重组病毒，所述病毒为慢病毒。
25.一种重组t细胞，所述t细胞携带前述基因片段和/或前述抗肿瘤转换受体。
26.前述的pd
‑
l1抗体、抗肿瘤转换受体、重组病毒或t细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
27.如前述的用途，所述肿瘤为实体瘤；优选的，所述实体瘤为肺癌、黑色素瘤、膀胱癌、肾癌、肝癌、鼻咽癌、食管癌、宫颈癌、乳腺癌或胃癌。
28.本发明的有益效果：
29.本发明的抗肿瘤转换受体，缩短了pd
‑
l1抗体的长度，可将pd
‑
l1对t细胞的抑制信号转化为激活信号，增强t细胞的活性和增殖能力，使其具备治疗实体瘤的能力。
30.显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
31.以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
32.图1为重组慢病毒载体phblv
‑
ef1a
‑
αpd
‑
l1
‑
cd28
‑
t2a
‑
mcherry结构示意图。
33.图2为慢病毒转染293t细胞的检测结果图，其中，a为倒置显微镜观察图，b为荧光显微镜观察图。
34.图3为慢病毒感染t细胞的检测结果图。
35.图4为αpdl1/cd28 t细胞、空载t细胞、对照t细胞与cd3抗体 pd
‑
l1蛋白作用24小时后cd69的表达情况。
36.图5为αpdl1/cd28 t细胞、空载t细胞、对照t细胞与cd3抗体 pd
‑
l1蛋白作用24小时后4
‑
1bb的表达情况。
37.图6为αpdl1/cd28 t细胞、空载t细胞、对照t细胞在不同条件下作用24小时后上清中il2、ifnγ、tnfα的分泌情况。
38.图7为αpdl1/cd28 t细胞、空载t细胞、对照t细胞在不同条件下刺激48小时后的凋亡情况。
39.图8为αpdl1/cd28 t细胞、空载t细胞、对照t细胞在不同条件下刺激48小时后的记忆表型情况。
40.图9为cell proliferation dye标记的αpdl1/cd28 t细胞、空载t细胞、对照t细胞在cd3抗体 pd
‑
l1蛋白作用后不同时间点的增殖情况。
41.图10为αpdl1/cd28 t细胞、空载t细胞、对照t细胞在不同条件下刺激后的cd107a分泌情况。
42.图11为各组t细胞与pdl1结合力的检测结果。
43.图12为各组t细胞经条件刺激后的活化指标的表达结果。
44.图13为各组t细胞经条件刺激后记忆表型的结果。
45.图14为各组t细胞经条件刺激后cd107a分泌的结果。
具体实施方式
46.本发明具体实施方式中使用的原料、设备均为已知产品，通过购买市售产品获得。
47.实施例1、抗肿瘤转换受体t细胞的制备
48.一、慢病毒构建
49.1.构建慢病毒载体质粒
50.1.1设计pd
‑
l1抗体基因序列
51.共4条，分别为：
52.第一条pd
‑
l1抗体基因序列(seq id no.1)：
53.caggtgcagctggtggagtctgggggaggcttggtgcaggctggggggtctctgagactctcctgtgtagcctctggaagtatcagcagtttcgacgcagtgctctggtaccgccgggctccagggaagcagcgcgattgggtcgcaacttcttttaccgccggtcacacaatctatgaagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaggaacacggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaaactgaggacacaggcgactattattgtaatgcgaggcgactaggtgcgcactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctcagaacccaagacaccaaaaccacaagac
54.第二条pd
‑
l1抗体基因序列(seq id no.2)：
55.gaggtgcagctggtggagtccggaggaggactggtgcagcctggcggctccctgagactgagctgcgtggctagcggctctcatcttagcttcgacgccgtgctgtggtacaggcaggctcctggcaagcagcgggattgggtggccaccagcttcacagctggctatactatctacgaggactctgtgaagggcaggttcaccatctcccgcgataacgctaagaatacagtgtatctgcagatgaactctctgcgcgccgaggacacagccgtgtactattgtaatgccaggcggctgggcgctcattattggggccagggcaccctggtgacagtgtcttcc
56.第三条pd
‑
l1抗体基因序列(seq id no.3)：
57.gaggtgcagctggtggagtccggaggaggactggtgcagcctggcggctccctgagactgagctgcgtggctagcggctctgtttccagcttcgacgccgtgctgtggtacaggcaggctcctggcaagcagcgggattgggtggccaccagcttcacagctggttataccatctacgaggactctgtgaagggcaggttcaccatctcccgcgataacgctaagaatacagtgtatctgcagatgaactctctgcgcgccgaggacacagccgtgtactattgtaatgccaggcggctgggcgctcattattggggccagggcaccctggtgacagtgtcttcc
58.第四条pd
‑
l1抗体基因序列(seq id no.4)：
59.gaggtgcagctggtggagtccggaggaggactggtgcagcctggcggctccctgagactgagctgcgtggctagcggctctgatgtgagcttcgacgccgtgctgtggtacaggcaggctcctggcaagcagcgggattgggtggccaccagcttcacagctggctgggagatctacgaggactctgtgaagggcaggttcaccatctcccgcgataacgctaagaatacagtgtatctgcagatgaactctctgcgcgccgaggacacagccgtgtactattgtaatgccaggcggctgggcgctcattattggggccagggcaccctggtgacagtgtcttcc
60.对应的氨基酸序列：
61.第一条pd
‑
l1抗体(seq id no.5)：
62.qvqlvesggglvqaggslrlscvasgsissfdavlwyrrapgkqrdwvatsftaghtiyedsvkgrfti
srdnarntvylqmnslktedtgdyycnarrlgahywgqgtqvtvssepktpkpqd
63.第二条pd
‑
l1抗体(seq id no.6)：
64.evqlvesggglvqpggslrlscvasgshlsfdavlwyrqapgkqrdwvatsftagytiyedsvkgrftisrdnakntvylqmnslraedtavyycnarrlgahywgqgtlvtvss
65.第三条pd
‑
l1抗体(seq id no.7)：
66.evqlvesggglvqpggslrlscvasgsvssfdavlwyrqapgkqrdwvatsftagytiyedsvkgrftisrdnakntvylqmnslraedtavyycnarrlgahywgqgtlvtvss
67.第四条pd
‑
l1抗体(seq id no.8)：
68.evqlvesggglvqpggslrlscvasgsdvsfdavlwyrqapgkqrdwvatsftagweiyedsvkgrftisrdnakntvylqmnslraedtavyycnarrlgahywgqgtlvtvss
69.1.2合成αpd
‑
l1
‑
cd28基因片段
70.通过全基因合成方法，合成将pd
‑
l1抗体基因序列分别与信号肽、cd28铰链段、cd28跨膜段、cd28胞内段相连接的dna序列，顺序为信号肽
‑
pd
‑
l1抗体
‑
cd28铰链段
‑
cd28跨膜段
‑
cd28胞内段。
71.以第一条pd
‑
l1抗体基因所对应αpd
‑
l1
‑
cd28为例，其dna序列(seq id no.9)为：
[0072][0073]
注：小写非斜体部分(seq id no.10)为信号肽段；大写加粗部分为抗pd
‑
l1段序列；小写斜体部分(seq id no.11)为cd28铰链(hinge)段，起连接作用；划线部分(seq id no.12)为cd28跨膜段；大写斜体部分(seq id no.13)为cd28胞内段。
[0074]
第一条αpd
‑
l1
‑
cd28基因片段编码的蛋白序列(seq id no.14)为：
[0075]
注：小写非斜体部分(seq id no.15)为信号肽段；大写加粗部分为抗pd
‑
l1段序列；小写斜体部分(seq id no.16)为cd28铰链(hinge)段，起连接作用；划线部分(seq id no.17)为cd28跨膜段；大写斜体部分(seq id no.18)为cd28胞内段。
fragment)的孔板中，加入慢病毒浓缩液(感染复数＝30)，并加入促感试剂hitransg a(上海吉凯基因医学科技股份有限公司，货号genechem revg004)，混匀后，置于37℃培养箱中培养。每隔2天进行一次t细胞传代，收获扩增的t细胞，命名为αpdl1/cd28t细胞。
[0095]
以下用实验例的形式对本发明αpdl1/cd28 t细胞的有益效果做进一步说明，因四种pdl1抗体序列结果相似，实验例1～8采用的pd
‑
l1抗体基因为seq id no.4所示基因。
[0096]
实验例1、αpdl1/cd28 t细胞感染效率的检测
[0097]
1、细胞准备
[0098]
αpdl1/cd28 t细胞、空载t细胞(在实施例1的基础上省略αpd
‑
l1
‑
cd28基因片段，转入慢病毒空载体)、对照t细胞。
[0099]
2、抗体检测
[0100]
分别向每种细胞悬液中加入终浓度为1μg/ml的biotinylated human pd
‑
l1蛋白，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，加入50μl 1：200pbs稀释的streptavidin apc conjugate(thermo fisher scientific公司，货号sa1005)，混匀后冰上避光孵育30分钟。用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，用200μl pbs缓冲液重悬细胞。用流式细胞仪分别对样本进行检测分析。
[0101]
3、结果
[0102]
结果如图3所示。检测结果表明，αpdl1/cd28 t细胞中识别pd
‑
l1的比例为71.7％，而空载t细胞、对照t细胞几乎不能识别pd
‑
l1；αpdl1/cd28 t细胞表达rfp的比例为75.5％，空载t细胞表达rfp的比例为89％，对照t细胞不表达rfp。
[0103]
4、结论
[0104]
本发明的αpdl1/cd28 t细胞可较好地识别pd
‑
l1。
[0105]
实验例2、αpdl1/cd28 t细胞活化状态的表型分析
[0106]
1、方法
[0107]
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的cd3抗体(miltenyi公司，货号170
‑
076
‑
309)和/或25μg/ml的pd
‑
l1蛋白(sino biological公司，货号10084
‑
h05h)，4℃过夜。
[0108]
分别取实施例1获得的慢病毒感染t细胞(即αpdl1/cd28 t细胞)和空载t细胞、对照t细胞种入各孔中，每孔细胞数为2
×
105，置于37℃孵箱内培养。
[0109]
24h后收集各孔细胞，用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，再用100μl洗涤缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液。
[0110]
1)cd69的检测：分别向细胞悬液的样本中，加入pe
‑
cy7标记的小鼠抗人cd69单抗(购自美国bd biosciences公司，产品货号为557745)5μl，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入200μl pbs缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪分别对各样本进行检测。
[0111]
2)4
‑
1bb的检测：分别向细胞悬液的样本中，加入apc标记的小鼠抗人4
‑
1bb单抗(购自美国bd biosciences公司，产品货号为550890)5μl，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入400μl pbs缓冲液重悬细胞，用流式细胞仪分别对各样本进行检测。
[0112]
2、结果
[0113]
cd69和4
‑
1bb的检测结果如图4、图5所示。可见，cd3抗体刺激后，各组t细胞cd69、4
‑
1bb表达均有提高；但经cd3抗体 pd
‑
l1蛋白作用后，αpdl1/cd28 t细胞cd69、4
‑
1bb的表达进一步升高，但空载t细胞、对照t细胞cd69、4
‑
1bb的表达下降。
[0114]
3、结论
[0115]
cd3抗体可诱导t细胞活化，cd69、4
‑
1bb是t细胞活化的标志物，而pd
‑
l1蛋白可结合t细胞表面的pd
‑
1，抑制t细胞活化。
[0116]
本实验例结果表明，αpdl1/cd28 t细胞能够将pd
‑
l1蛋白的抑制性信号转变为激活信号，提高t细胞对pd
‑
l1阳性肿瘤的杀伤能力。
[0117]
实验例3、αpdl1/cd28 t细胞分泌细胞因子的检测
[0118]
1、方法
[0119]
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的cd3抗体(miltenyi公司，货号170
‑
076
‑
309)和/或25μg/ml的pd
‑
l1蛋白(sino biological公司，货号10084
‑
h05h)，4℃过夜。
[0120]
分别取实施例1获得的慢病毒感染t细胞(即αpdl1/cd28 t细胞)和空载t细胞、对照t细胞种入各孔中，每孔细胞数为2
×
105，置于37℃孵箱内培养。
[0121]
取培养24h后的培养上清，采用elisa试剂盒(thermo fisher scientific公司，货号77
‑
7025、88
‑
7316)检测培养上清中il2、ifnγ、tnfα的含量。
[0122]
2、结果
[0123]
细胞因子检测结果如图6所示，经cd3抗体 pd
‑
l1蛋白作用后，相较于空载t细胞、对照t细胞，αpdl1/cd28 t细胞培养上清中il2、ifnγ、tnfα显著升高。
[0124]
3、结论
[0125]
il2、ifnγ、tnfα是t细胞活化后产生的可增强nk细胞活性的因子，cd3抗体和pd
‑
l1作用下，αpdl1/cd28 t细胞分泌细胞因子提高，利于抗肿瘤治疗。
[0126]
实验例4、αpdl1/cd28 t细胞的凋亡表型检测
[0127]
1、方法
[0128]
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的cd3抗体(miltenyi公司，货号170
‑
076
‑
309)和/或25μg/ml的pd
‑
l1蛋白(sino biological公司，货号10084
‑
h05h)，4℃过夜。
[0129]
分别取实施例1获得的慢病毒感染t细胞(即αpdl1/cd28 t细胞)和空载t细胞、对照t细胞种入各孔中，每孔细胞数为2
×
105，置于37℃孵箱内培养。
[0130]
48h后收集各孔细胞，用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，再用100μl洗涤缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液。
[0131]
采用annexin v/pi细胞凋亡试剂盒进行流式染色，用流式细胞仪分别对各样本进行检测分析。
[0132]
2、结果
[0133]
结果如图7所示，经cd3抗体 pd
‑
l1蛋白作用后，相较于空载t细胞、对照t细胞，αpdl1/cd28 t细胞早期凋亡、晚期凋亡的比例均有下降。
[0134]
3、结论
[0135]
本发明的αpdl1/cd28 t细胞寿命长，相比普通t细胞能长期地发挥抗肿瘤作用。
[0136]
实验例5、αpdl1/cd28 t细胞的记忆表型检测
[0137]
1、方法
[0138]
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的cd3抗体(miltenyi公司，货号170
‑
076
‑
309)和/或25μg/ml的pd
‑
l1蛋白(sino biological公司，货号10084
‑
h05h)，4℃过夜。
[0139]
分别取实施例1获得的慢病毒感染t细胞(即αpdl1/cd28 t细胞)和空载t细胞、对照t细胞种入各孔中，每孔细胞数为2
×
105，置于37℃孵箱内培养。
[0140]
48h后收集各孔细胞，用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，再用100μl洗涤缓冲液重悬细胞，得到细胞悬液。
[0141]
分别向细胞悬液的样本中，加入pe标记的小鼠抗人cd62l单抗(购自美国bd biosciences公司，产品货号为555544)20μl、percp
‑
cy5.5标记的小鼠抗人cd45ro单抗(购自美国bd biosciences公司，产品货号为560607)。冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入200μl pbs缓冲液重悬细胞。用流式细胞仪分别对各样本进行检测分析。
[0142]
2、结果
[0143]
如图8所示，经cd3抗体 pd
‑
l1蛋白作用后，αpdl1/cd28 t细胞的记忆表型有明显改变，t细胞明显减少，效应记忆和中央记忆t细胞明显增多。
[0144]
3、结论
[0145]
经cd3抗体 pd
‑
l1蛋白作用，αpdl1/cd28 t细胞能更多地转化为记忆表型t细胞，更迅速地发挥免疫功能，抗癌作用更强。
[0146]
实验例6、αpdl1/cd28 t细胞的增殖表型检测
[0147]
1、方法
[0148]
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的cd3抗体(miltenyi公司，货号170
‑
076
‑
309)和/或25μg/ml的pd
‑
l1蛋白(sino biological公司，货号10084
‑
h05h)，4℃过夜。
[0149]
分别取实施例1获得的慢病毒感染t细胞(即αpdl1/cd28 t细胞)和空载t细胞、对照t细胞种入各孔中，采用ebiosience cell proliferation dye(thermo fisher scientific公司，货号65
‑
0840)标记各组t细胞，种于包被好的板内，置于37℃孵箱内培养。
[0150]
分别于种板后第4、8天收集细胞，用洗涤缓冲液洗涤1次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入200μl pbs缓冲液重悬细胞。用流式细胞仪分别对各样本进行检测分析。
[0151]
2、结果
[0152]
如图9所示，经cd3抗体 pd
‑
l1蛋白作用后，αpdl1/cd28 t细胞增殖染料峰左移。
[0153]
3、结论
[0154]
经cd3抗体 pd
‑
l1蛋白作用后，αpdl1/cd28 t细胞增殖能力提高。
[0155]
实验例7αpdl1/cd28 t细胞分泌cd107a的功能检测
[0156]
1、方法
[0157]
准备一块96孔板，每孔加入60μl包被液，包被液成分为1μg/ml的cd3抗体(miltenyi公司，货号170
‑
076
‑
309)和/或25μg/ml的pd
‑
l1蛋白(sino biological公司，货号10084
‑
h05h)，4℃过夜。
[0158]
分别取实施例1获得的慢病毒感染t细胞(即αpdl1/cd28 t细胞)和空载t细胞、对照t细胞种入各孔中，每孔加入5μl cd107a
‑
apc抗体混匀，500rpm离心3min，置于37℃孵箱内培养。
[0159]
1小时后，用无血清的培养基1:150比例稀释golgistop(购自美国bd biosciences公司，产品货号为554724)，按10μl/孔加入到96孔板中，混匀后置于37℃孵箱内培养。
[0160]
2.5小时后，从96孔板中吸出细胞制备单细胞悬液，加入cd3
‑
bv510、cd8
‑
fitc抗体染色，2μl/孔，冰上避光孵育30分钟后，用洗涤缓冲液洗涤两次，以300g离心5分钟，去除上清，然后加入200μl pbs缓冲液重悬细胞。用流式细胞仪分别对各样本进行检测分析。
[0161]
2、结果
[0162]
t细胞分泌cd107a检测结果如图10所示，相较于空载t细胞和对照t细胞，αpdl1/cd28 t细胞经cd3抗体 pdl1蛋白刺激后cd107a分泌显著增多，而空载t细胞和对照t细胞cd107a分泌在pdl1作用后受到抑制。
[0163]
3、结论
[0164]
αpdl1/cd28 t细胞具有更强的分泌cd107a的能力。
[0165]
实验例8αpdl1/cd28 t细胞与其它转换受体t细胞的功能实验对比
[0166]
1、方法
[0167]
转换受体t细胞已有文献报道，其转换受体结构为pd1
‑
cd28。通过慢病毒感染的方式同期制备αpdl1/cd28 t细胞、pd1/cd28 t细胞、空载t细胞，行实验例1、2、5、7，对αpdl1/cd28 t细胞和pd1/cd28 t细胞进行功能对比。
[0168]
2、结果
[0169]
各组t细胞与pdl1结合力的检测结果如图11所示。在αpdl1/cd28 t细胞、pd1/cd28 t细胞感染效率相当的情况下(红色荧光标签表达均约70％)，αpdl1/cd28 t细胞对pdl1的结合能力明显高于pd1
‑
cd28
‑
t细胞。
[0170]
各组t细胞经条件刺激后的活化指标的表达结果如图12所示。αcd3作用24h后，各组t细胞活化指标表达显著增加；随着pdl1剂量的提高，空载t细胞活化指标表达显著降低，而αpdl1/cd28 t细胞、pd1/cd28 t细胞活化指标表达进一步升高，表明其对pdl1抑制信号的转换作用。在αcd3 pdl1刺激的同等条件下，αpdl1/cd28 t细胞细胞的活化指标表达高于pd1
‑
cd28
‑
t细胞。
[0171]
各组t细胞经条件刺激后记忆表型的结果如图13所示。αcd3作用24h后，各组t细胞比例明显下降、中央记忆细胞比例增高；随着pdl1剂量的提高，空载t细胞比例增加、中央记忆t细胞比例降低，而αpdl1/cd28 t细胞和pd1/cd28 t细胞的比例持续下降、中央记忆t细胞比例持续升高。在αcd3 pdl1刺激的同等条件下，αpdl1/cd28 t细胞的比例低于pd1/cd28 t细胞，而中央记忆比例高于pd1/cd28 t细胞。
[0172]
各组t细胞经条件刺激后cd107a分泌的结果如图14所示。αcd3作用4h后，各组t细胞分泌cd107a显著增加；随着pdl1剂量的提高，空载t细胞107a显著降低，而αpdl1/cd28 t细胞和pd1/cd28 t细胞cd107a分泌进一步升高，表明其转换pdl1抑制信号的作用。在αcd3 pdl1刺激的同等条件下，αpdl1/cd28 t细胞的cd107a分泌高于pd1/cd28 t细胞。
[0173]
综上，本发明的αpdl1/cd28 t细胞，在经cd3抗体和pd
‑
l1蛋白作用后，将pd
‑
l1蛋白的抑制信号转化为激活信号，促进t细胞因子的分泌，减少t细胞凋亡，增加记忆表型t细
胞，提高t细胞增殖能力。相比普通t细胞，本发明的αpdl1/cd28 t细胞具备更强的抗肿瘤能力，具备治疗实体瘤的能力。