一种杧果萜烯合成酶基因TPS2及其应用的制作方法

一种杧果萜烯合成酶基因tps2及其应用
技术领域
1.本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种杧果萜烯合成酶基因tps2及其应用，尤其是涉及一种杧果中催化萜类化合物合成的杧果萜烯合成酶基因(terpene synthase 2，tps2)及其编码蛋白和应用。


背景技术：

2.杧果为漆树科杧果属常绿果树，是著名的热带水果，素有“热带国王”之美誉，是我国热区重要的水果产业之一，也是我国热带地区农民的重要经济来源之一。杧果果实外观美丽、香气浓郁、风味佳美，深受消费者喜爱，杧果的香味是芒果风味品质的重要指标，香味物质变化与杧果品质密切相关。随着人民生活水平的不断提高，对农产品品质的要求越来越高，风味品质要求也随之提高。随着资源的进化和品种驯化，杧果果实的某些香味逐渐减退或失去，而且许多杧果在后熟过程中，香味释放不完全，这些都对杧果风味品质产生较大影响，对杧果的商品价值也产生一定影响。香味物质的形成还与产地、栽培管理措施、采收成熟度、贮藏条件，以及品种不同等均有关系。已报道的芒果中挥发性成分约有500多种，其中萜类化合物有150多种，约占总挥发物的28％，是杧果中最丰富的一类挥发性化合物，其在忙果风味形成方面起重要作用。
3.萜类化合物是植物次生代谢物中最大的一类，其在植物与环境因子的互作中发挥重要作用，如吸引昆虫传粉、参与植物间接防御反应，也是植物香味的重要成分，还具有重要的药用和保健价值。萜类化合物的生物合成途径通常被分为3个阶段：c5前体异戊烯基二磷酸酯(isopentenyl diphosphate,ipp)及其双键异构体二甲基烯丙基二磷酸酯(dimethylallyl diphosphate,dmapp)生成阶段；直接前体法尼基二磷酸(farnesyl diphosphate,fpp)、牻牛儿基二磷酸(geranyl diphosphate，gpp)、橙花二磷酸(neryl diphosphate，npp)、牻牛儿基牻牛儿基二磷酸(geranylgeranyl diphosphate,ggpp)等生成阶段；萜类生成及修饰阶段(氧化还原、酰化、糖基化等)。其中，前两个阶段已经比较清楚，且为所有的萜类化合物所共享。第三个阶段决定了萜类化合物结构多样性，是植物次生代谢研究的重点领域。杧果中萜类化合物是由萜烯合成酶(tps)催化形成，但参与其生物合成途径中的相关功能基因均未得以揭示，该基因及其编码的蛋白序列尚不清楚，因此，获得萜烯合成酶基因并进行功能验证，对于了解杧果中萜类香味物质形成意义重大。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于一种杧果萜烯合成酶基因tps2及其编码蛋白和制备方法。
5.本发明的目的还在于提供一种包含上述杧果萜烯合成酶基因tps2的重组表达载体、重组表达工程菌和重组杧果萜烯合成酶tps2。
6.本发明的最后一个目的在于提供上述杧果萜烯合成酶基因tps2、编码蛋白、重组表达载体、重组工程菌或重组杧果萜烯合成酶tps2在调控橙花二磷酸(neryl diphosphate，npp)合成萜类化合物方面的应用。
7.本发明的上述第一个目的可以通过以下技术方案来实现：一种杧果萜烯合成酶基因tps2，它的核苷酸序列如seq id no：1所示。
8.一种杧果萜烯合成酶tps2，它的氨基酸序列如seq id no：2所示。
9.该杧果萜烯合成酶基因tps2的制备方法，包括以下步骤：将红象牙杧果果肉的总rna反转录成cdna，以cdna为模板，用如seq id no：3和seq id no：4所示的引物对进行pcr扩增获得。
10.具体的：
11.本发明通过红象牙杧果基因组测序结果进行分析，设计一对特异引物(pf正向引物:5
’‑
ccgcgcggcagccatatggaacaaacgaaacattgtcat
‑3’
，和pr反向引物:5
’‑
gtggtggtgctcgagttatataggtttgatgagtaaagagaggatt
‑3’
，对杧果果肉样品cdna进行pcr扩增，获得了催化杧果果肉中gpp与npp合成萜类化合物的功能基因cds序列(全长1707bp)，tps2基因的cds序列具体如seq id no：1所示的核苷酸序列。
12.本发明的上述第二个目的可以通过以下技术方案来实现：一种重组表达载体，包括上述的杧果萜烯合成酶基因tps2和表达载体。
13.优选的，所述表达载体为pet28a。
14.具体的，所述重组表达载体为pet28a
‑
tps2。
15.本发明还提供了一种重组表达工程菌，将杧果萜烯合成酶基因tps2构建到表达载体pet28a上，用所得重组表达载体转化bl21(de3)，筛选阳性菌株构建大肠杆菌工程菌，得到重组表达工程菌。
16.本发明还提供了一种重组杧果萜烯合成酶tps2，包括用上述的重组表达载体转化寄主细胞，培养转化体，从培养物中获得杧果重组萜烯合成酶tps2。
17.优选的，所述寄主细胞为大肠杆菌。
18.此外，除了重组表达载体、重组表达工程菌和重组杧果萜烯合成酶tps2之外，还可以是包括所述杧果萜烯合成酶基因tps2的表达盒、转基因细胞系等。
19.本发明的上述最后一个目的可以通过以下技术方案来实现：上述的杧果萜烯合成酶基因tps2、杧果萜烯合成酶tps2、重组表达载体、重组表达工程菌或重组杧果萜烯合成酶tps2在调控橙花二磷酸npp合成萜类化合物方面的应用。
20.本发明可实现杧果萜烯合成酶基因tps2、所述基因的编码蛋白(杧果萜烯合成酶tps2)、含有所述杧果萜烯合成酶基因tps2的表达盒、重组表达载体、重组表达工程菌、重组杧果萜烯合成酶基因tps2等在调控tps合成萜类化合物中的应用之外，还可以在基因工程、细胞工程等生物合成技术中的应用；进一步的，还可以利用基因工程技术进行杧果品种改良，以期获得特殊香味或者香味浓郁品种。
21.本发明具有如下优点：本发明针对杧果中功能基因研究基础薄弱的现状，首次从杧果中克隆得到催化橙花二磷酸npp底物合成萜类化合物的杧果萜烯合成酶基因tps2，该基因为杧果萜类化合物合成路径中的关键基因之一，为今后利用基因工程或细胞工程技术在杧果育种中的应用提供了重要的理论依据，具有广阔的应用前景和极大的经济价值。
附图说明
22.图1是实施例1中tps2蛋白酶促反应产物的tic图。
具体实施方式
23.以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sam brook等分子克隆实验手册(sam brook j&r ussell dw，molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
24.实施例1杧果萜烯合成酶基因tps2的克隆
25.根据前期红象牙杧果基因组测序结果(基因组数据库中的基因id：mango029560，红象牙基因组数据已存入big genome sequence archive数据库，登录号为prjca002248)进行分析，设计一对特异引物(pf正向引物:5
’‑
ccgcgcggcagccatatggaacaaacgaaacattgtcat
‑3’
和pr反向引物:5
’‑
gtggtggtgctcgagttatataggtttgatgagtaaagagaggatt
‑3’
分别如seq id no：3所示和seq id no：4所示)，采用天根rnaprep pure kit总rna提取试剂盒从红象牙杧果果肉中提取总rna，并反转录合成cdna，利用上述引物pf和pr从反转录得到的cdna中扩增出如seq id no：1所示的杧果中催化萜类化合物生成的tps2基因的cds序列，tps2基因的cds序列全长1707bp。
26.具体步骤如下：
27.(1)将新鲜红象牙杧果果肉用液氮冷却研磨，称取100mg粉末加入液氮预冷的2ml离心管中，并加入天根rnaprep pure kit总rna试剂盒裂解液，涡旋混匀后静置10min；
28.(2)根据天根rnaprep pure kit总rna试剂盒操作说明书步骤红象牙果肉的总rna；
29.(3)从红象牙果肉中提取的总rna为模板，利用反转录酶试剂盒primescript
tm rt master mix(购自宝生物工程大连有限公司)将其反转录合成cdna第一条链，反应条件按照试剂盒说明书进行；
30.(4)利用上述引物pf和pr从rna反转录得到的cdna中扩增出植物中催化生成单萜合酶基因tps2的植物cds序列；
31.(5)反应条件：95℃预变性3min；95℃30sec，55℃30sec，72℃2min，35个循环；72℃延伸10min；试剂添加体系参照制造商说明书。
32.(6)将扩增获得的pcr产物采用进行切胶回收，切胶回收具体方法参照gel extraction kit(omega)试剂盒制造商说明书。
33.tps2基因orf序列具体如下所示：
34.atggaacaaacgaaacattgtcattctcaacaaccaaatctgtattgccagctgaagcccgaagcctcagatattatacagcccagaagtaattcttccagttataaaccaagcatttggaaatatgattttatacagtctcttgataccaaatatgaggaagagggatataaactccgggctcagacgttgaaagagaaggtgaaacgcttgtttggtgaatccatagacgttttagcaaagctagaattgattgacaacatctggaaactcggcctgtccactctctttgaggaggaaattcatgaagctttagataacatagcttctattcagaataacaactcttgtgtagaagaagacctttatactaccgctttatgctttaggctcctcaggcagcatggctatgaaatttcagaagatatctttactggcttcgtggatgaaaagggttcattctcaacggcaaaatgtagagatgctaaaggattgatcgaactttttgaagcctcccatctggctttagaaggtgaaaccactttggacaaggctaaagtgttctcaattgcaaccctgaaatatatccatttttctactaatttggatagtgaacttgccgagaaaatagcccgtgctttggaacttccattgcatcgaagagtgccgtggtttgaagtcagatggcacataaacgcttatgagaataacaaacaaatgatgaacacaagtttattagagttggcaaaacttaactttattagggttcaagccacactccaaaatgatcttagggaggtttcaaggtggtggaggaatctgggcctg
attgaaaatctaaacttctcaagggatcgactggttgaaagcttcatgtgcgcagtgggccttctttatgacactgagttcagatcttttagaaaatggctcacaaaagtcgttatcttcatactggtgatagatgatatctatgatatttatggttcattgcaagaactgcaatacttcaccaatgctgttgatagatgggattccaaggaaattgagcacctgccagagtgtatgaagatatcttttcaagcactgtatgacactaccaacgaaatggcttatgaaattcagaaggagaaaggctggaacgattctgccttaccccatttgaagaaagcgtgggctgatttttgtaaatcattattagtggaagcaaagtggtgcaacgaaggacatactccatctctacaggagtatttgaataatgcatggatttcttcatcaggctcgctgctttctgtccattcatttttgtcaacaatgaaagaggacacaaaggaaatgggacattttctcaggaaaaaccaggaactcctgtacaattcatctctagtaattcggctatgcaatgatctaggcacttcaacggctgagctagagagaggtgatgttgcttcatccatcctgtgttatatgagagaattggatgtatcagaggagaaagctcggagccatattaaagagaagataaataaatgttggataaatattaatggacattgtttcacccaatcatcttcgctgaaaccatttgtgaatattatcacaaactgtgcgcgtgtggcgcattgtctttaccagaatggagatggttttggagttcaggaccgtgatacaaaggatcaaatcctctctttactcatcaaacctatataa 1707，具体如seq id no：2所示。
35.氨基酸序列：
36.meqtkhchsqqpnlycqlkpeasdiiqprsnsssykpsiwkydfiqsldtkyeeegyklraqtlkekvkrlfgesidvlaklelidniwklglstlfeee
37.ihealdniasiqnnnscveedlyttalcfrllrqhgyeisediftgfvdekgsfstakcrdakglielfeashlalegettldkakvfsiatlkyihfst
38.nldselaekiaralelplhrrvpwfevrwhinayennkqmmntsllelaklnfirvqatlqndlrevsrwwrnlglienlnfsrdrlvesfmcavgllyd
39.tefrsfrkwltkvvifilviddiydiygslqelqyftnavdrwdskeiehlpecmkisfqalydttnemayeiqkekgwndsalphlkkawadfcksllv
40.eakwcneghtpslqeylnnawisssgsllsvhsflstmkedtkemghflrknqellynsslvirlcndlgtstaelergdvassilcymreldvseekar
41.shikekinkcwininghcftqssslkpfvniitncarvahclyqngdgfgvqdrdtkdqilsllikpi*，具体如seq id no：2所示。
42.实施例2杧果tps2表达载体构建与转化
43.选择载体pet28a进行酶切线性化，酶切位点为ndei与xhoi(购自neb)，酶切反应体系为(50μl体系)：
[0044][0045]
37℃
×
1h，65℃
×
20min，酶切反应产物进行切胶回收，切胶回收具体方法参照gel extraction kit(omega)试剂盒制造商说明书。
[0046]
将回收的目的产物使用in
‑
fusion克隆(购自clontech公司)连入表达载体pet28a，转化大肠杆菌感受态细胞bl21(de3)，筛选阳性克隆并测序，获得所需的全长基因，获得的含目的基因的表达载体命名为pet28a
‑
tps2。
[0047]
实施例3杧果tps2基因蛋白功能验证
[0048]
为分析芒果基因tps2编码蛋白的催化功能，本实施例对杧果tps2蛋白进行了大肠杆菌异源表达并得到纯化蛋白，通过体外饲喂该基因催化反应的前体化合物gpp、npp、fpp、ggpp检测产物的合成来验证其基因功能。
[0049]
具体步骤如下：
[0050]
(1)将实施例2中得到的重组菌株进行诱导表达；诱导条件为：iptg浓度1mm，诱导温度20℃，诱导时间10h；
[0051]
(2)将诱导得到的蛋白通过镍柱纯化，得到杧果tps2纯化蛋白，详细步骤参照制造商说明书；
[0052]
(3)纯化蛋白体外功能验证试验步骤如下：反应体积5ml，10μm
·
l
‑1底物(分别添加gpp、npp、fpp、ggpp四种底物，底物购买于echelon biosciences)，杧果tps2纯化蛋白50μg，内标化合物α
‑
terpinene 6.974
×
10
‑7g，反应缓冲液3ml，lysis buffer(ph7.5)补足至5ml；阴性对照中加入100℃加热5分钟的灭活的纯化蛋白50μg，其余组分同上。以上试剂均加入气质小瓶中密封，置于28℃，150rpm摇床反应40分钟。
[0053]
反应缓冲液为：15mm mopso，13％(v/v)甘油，1mm抗坏血酸，1μl
·
ml
‑1吐温20，1mm氯化镁，2mm dtt，调ph至7.5。
[0054]
(4)反应结束后，将固相微萃取纤维(supelco 50/30μm；car/pdms/dvb)插入气质小瓶中，室温下萃取30min。随后使用gc
‑
ms进行产物检测。
[0055]
gc
‑
ms条件为:气相色谱(agilent gc7890b；agilent msd5977a)采用hp
‑
5ms(agilent)毛细管柱(30m
×
0.25mm inner diameter with 0.25μm film thickness，膜厚0.25
‑
制片商m)。以氦气为载气，流速为1ml /min，分流比为20：1。进样口温度为250℃，离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃。升温程序为：初始温度60℃，保持1分钟，以4℃/min的速度升温至120℃；再以5℃/min的速度升温至200℃并保持3min。电离方式为ei，电子能量为70ev。质量扫描范围为35
‑
500m/z。
[0056]
(5)gc
‑
ms的检测结果使用masshunter软件进行分析，并从nist14.l库中对气体产物进行匹配，筛选出匹配分数在85以上，并且相对含量大于1％的物质列于表1。
[0057]
tps2蛋白酶促反应产物的tic图如图1所示。
[0058]
从表1与图1可看出，在异源表达分析中，tps2蛋白能催化橙花二磷酸(neryl diphosphate，npp)生成(1s)
‑
(1)
‑
β
‑
pinene为单一产物，不能催化gpp、fpp、ggpp生成相应的单萜烯、倍半萜烯和二萜烯。
[0059]
表1 tps2蛋白酶促反应的gc
‑
ms检测结果
[0060][0061]
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任
何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为准。