一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用与流程

1.本发明属于基因工程和分子生物学技术领域，具体涉及一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法及其应用。


背景技术：

2.生物传感技术是利用基因工程手段对菌株进行改造，使得该微生物在感应特定化合物或者特定化合物在微生物中的代谢产物后，微生物发生可以被检测的变化，从而达到对特定化合物进行检测的目的。这种生物传感器主要由感应元件和报告元件两部分构成，其中感应元件可特异性地感应靶标化合物，感应元件是负责基因转录的启动子、核糖体结合位点、终止子、转录调控因子等；而报告元件可在感应元件的作用下产生感应信号，一般常用的报告元件包括各种荧光蛋白和荧光素酶，分别产生各种颜色荧光和自发光等可以被检测的感应信号。这种生物传感技术被广泛应用于特定化合物的检测，其中包括2,4
‑
dnt。2,4
‑
dnt是爆炸物有效成份tnt分解后产生的一种挥发性物质，由于其较高的挥发性能，常被用作检测爆炸物存在的特征化学物质。以色列科学家shimshon belkin曾报道一种检测2,4
‑
dnt的大肠杆菌生物传感器，这个生物传感器主要是由爆炸物分子2,4
‑
dnt的感应元件yqjf启动子和gfp报告元件两部分组成，对于2,4
‑
dnt的检测可达到0.01 mg/l（new biotechnology, 2020, 59, 65
‑
73），目前处于国际领先水平。然而，无论是依赖荧光蛋白产生的荧光还是依赖荧光素酶的自发光都需要仪器进行信号的采集和处理，依赖荧光蛋白产生荧光时更是需要使用仪器进行特定波长的光激发，无法达到肉眼可以观察到的程度。
3.洋葱伯克霍尔德氏菌中的dnt操纵子（dntabdeg）表达的蛋白能够降解2,4
‑
dnt，其中dnta与dntb蛋白能够将2,4
‑
dnt降解为一种红色物质2
‑
羟基
‑5‑
甲基苯醌，使培养基的颜色变为肉眼可见的红色。因此我们利用这个操纵子中的dnta、dntb两个基因构建一种生物传感器，这种生物传感器可以感应爆炸物分子2,4
‑
dnt，并将其降解为肉眼可见的红色物质。此外，我们还通过启动子串联和优化rbs的方法来提高生物感应器性能，使之能够更高效的实现颜色变化，从而达到可视化检测的目的。


技术实现要素：

4.为了实现爆炸物分子的可视化检测，本发明提供了一种利用爆炸物分子降解途径基因合成生物感应器的制备方法及其在爆炸物分子可视化检测中的应用。
5.为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：本发明提供了一种利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：（1）克隆爆炸物分子降解基因，纯化回收后，与pacycduet
‑
1质粒同时双酶切，然后将质粒酶切片段与爆炸物分子降解基因片段以2:1的质量比进行连接，连接产物转化感受态细胞，于含抗生素的lb 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p
‑
dntab；
（2）扩增启动子yqjf基因片段，纯化回收后，酶切启动子yqjf基因片段和重组质粒p
‑
dntab，然后将质粒酶切片段与启动子yqjf基因片段以25:1的质量比进行连接，连接产物转化感受态细胞，于含抗生素的lb 固体平板上筛选阳性克隆，得到重组质粒p
‑
yqjf
‑
dntab；（3）对重组质粒p
‑
yqjf
‑
dntab的rbs进行预测优化，得到rbs优化序列插入到重组质粒p
‑
yqjf
‑
dntab上，得到重组质粒p
‑
yqjf
‑
rbs
‑
dntab；（4）将所述重组质粒p
‑
yqjf
‑
dntab或重组质粒p
‑
yqjf
‑
rbs
‑
dntab分别转化感受态细胞，筛选到的阳性克隆，得到工程菌株；（5）将所述工程菌株于含抗生素的lb液体培养基活化，再转接至m9培养基中培养，得到可视化生物感应器。
6.进一步的，所述爆炸物分子降解基因的核苷酸序列如seq id no.1所示，其来源于伯克霍尔德氏菌burkholderia cepacia，包括dnta基因、orf基因、dntb基因。
7.进一步的，所述启动子yqjf基因的核苷酸序列如seq id no.2所示，其来源于大肠杆菌escherichia coli。
8.进一步的，所述rbs优化序列为rbs1和rbs2，其核苷酸序列如下：rbs1：gtttgcccagggaagtagttaagaaaggaggtcttttt；rbs2：aaggtatgagcttatgcgcc。
9.进一步的，所述优化方法包括以下步骤：（1）利用pcr克隆重组质粒p
‑
yqjf
‑
dntab，使p
‑
yqjf
‑
dntab质粒线性化，扩增启动子yqjf基因，再利用平末端连接的方式连接p
‑
yqjf
‑
dntab质粒片段和启动子yqjf基因片段，从而使两个yqjf启动子串联在一起，得到重组质粒p
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
dntab；（2）选择两种较高强度的rbs1和rbs2序列，分别设计引物，将rbs1和rbs2序列分别插入到p
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
dntab质粒上，得到重组质粒p
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs1
‑
dntab和p
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs2
‑
dntab。
10.进一步的，所述步骤（5）中将工程菌株于含氯霉素的lb液体培养基中，过夜培养活化，再转接至m9培养基中培养至od
600
为0.2，得到可视化生物感应器。
11.进一步的，所述利用启动子串联方法能够加强爆炸物分子降解基因dntab的启动。
12.进一步的，所述rbs优化能够增强核糖体的结合效率，从而增强爆炸物分子降解基因dntab的翻译过程，更快的降解2,4
‑
dnt，产生颜色物质。
13.本发明还提供了所述的利用爆炸物分子降解基因合成可视化生物感应器的制备方法中制备得到的可视化生物感应器。
14.本发明还提供了所述的可视化生物感应器在用于爆炸物分子的可视化检测中的应用。
15.进一步的，所述可视化生物感应器的使用方法为：将可视化生物感应器培养活化后，加入待测样品后进行共培养，肉眼观察培养液颜色，红色越明显则待测样品中爆炸物分子的浓度越高。
16.进一步的，所述可视化检测使用白色酶标板进行。
17.进一步的，所述爆炸物分子为2,4
‑
dnt。
18.进一步的，所述生物感应器能够感应不同浓度的爆炸物分子，从而产生不同程度
的颜色反应，根据2,4
‑
dnt降解后产生的2
‑
羟基
‑5‑
甲基苯醌，该物质表现为肉眼可见的红色，肉眼观察颜色的变化达到可视化检测爆炸物分子的目的。
19.进一步的，所述生物感应器能够将爆炸物分子浓度与爆炸物分子降解后产生的2
‑
羟基
‑5‑
甲基苯醌的量进行偶联。
20.本发明还提供了所述的可视化生物感应器在用于制备提高爆炸物分子检测可视度的生物制剂中的应用。
21.本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：1、本发明将含有爆炸物分子降解基因的报告质粒作为基础质粒，通过连接启动子yqjf，得到重组质粒后，再利用启动子串联和优化rbs的方法对重组质粒进行改良，得到了一种能够感应爆炸物分子的生物感应器，该生物感应器能够响应不同浓度的爆炸物分子，降解产生不同浓度的2
‑
羟基
‑5‑
甲基苯醌代谢物（该物质为红色），进而只需通过肉眼观察红色的强烈程度即可达到检测爆炸物分子的目的，无需仪器进行信号检测，使用方便、简单。
22.2、本发明将爆炸物分子降解基因与感应特定化合物的感应元件进行连接，构建的可降解爆炸物分子产生红色降解物的生物传感器，获得可视化生物感应系统，可以实现对爆炸物的可视化检测，且该检测方法可直接通过肉眼观察结果，方便快捷、在爆炸物检测中安全性高，因此本发明的降解2,4
‑
dnt产生红色降解物的生物感应器具有很大的应用前景。
附图说明
23.图1为构建的载体p
‑
dntab的质粒图谱。
24.图2为构建的载体p
‑
yqjf
‑
dntab的质粒图谱。
25.图3为构建的载体p
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
dntab的质粒图谱。
26.图4为构建的载体p
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs
‑
dntab的质粒图谱。
27.图5为 e.coli (p
‑
yqjf
‑
dntab)重组菌株在白色酶标板中的检测结果。
28.图6为串联启动子方法优化的e.coli (p
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
dntab)重组菌株在白色酶标板中的检测结果。
29.图7为优化rbs1的e.coli (p
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs1
‑
dntab)重组菌株在白色酶标板中的检测结果。
30.图8为优化rbs2的e.coli (p
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs2
‑
dntab)重组菌株在白色酶标板中的检测结果。
具体实施方式
31.下面结合具体的实施例对本发明做进一步说明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于下述的具体实施例。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过购买获得的常规产品。
32.实施例1：基因的获得和载体的构建1、基因的获得将一种来源于伯克霍尔德氏菌r34（burkholderia cepacia）的dntab，其核苷酸序
列如seqidno.1所示，包括dnta基因、orf基因、dntb基因，由华大基因公司化学合成至puc
‑
57载体上，获得puc
‑
dntab载体。
33.将yqjf启动子基因，其核苷酸序列如seqidno.2所示，由华大基因公司化学合成至puc
‑
57载体上，获得puc
‑
yqjf载体。
34.2、p
‑
dntab表达载体的构建以puc
‑
dntab为模版，引物dntab
‑
f和引物dntab
‑
r，进行聚合酶链式反应（pcr），扩增dntab片段，其pcr扩增体系如下所示：pcr程序为：95
º
c3min；30循环
×
（95
º
c15s，58
º
c15s，72
º
c4min）；72
º
c5min；16
º
c∞。引物序列如下所示：dntab
‑
f：5
’‑
gaattcatggaactggtagtagaacccc
‑3’
（seqidno.3）；dntab
‑
r：5
’‑
gcggccgcttaggcagctacgaccgatg
‑3’
（seqidno.4）。
35.pcr产物利用胶回收纯化试剂盒（vazyme，货号dc301
‑
01）进行胶回收纯化。
36.利用限制性内切酶1ecor
і
（takara，货号1611）和限制性内切酶2noti（takara，货号1615）双酶切pacycduet
‑
1质粒和dntab扩增片段，其酶切体系为：质粒或pcr产物3μg10
×
q.cutbuffer10μl限制性内切酶15μl限制性内切酶25μl超纯水补至100μl酶切体系置于37
º
c孵育1h，进行胶回收纯化。
37.利用dna连接酶进行连接，连接体系如下所示：质粒酶切片段100ngpcr产物酶切片段50ng10
×
t4dnaligasebuffer2μlt4dnaligase0.5μl超纯水补至20μl连接体系置于22
º
c孵育90min。连接产物转化e.colidh5α感受态，涂布到含
34 mg/l氯霉素的lb 固体平板上，pcr筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p
‑
dntab（图1），再通过限制性酶切和测序进行鉴定。
38.3、p
‑
yqjf
‑
dntab表达载体的构建以puc
‑
yqjf为模版，引物yqjf
‑
f和引物yqjf
‑
r，进行聚合酶链式反应（pcr），扩增yqjf片段，其pcr扩增体系如下所示：pcr程序为：95
º
c 3 min；30循环
×
（95
º
c 15 s，55
º
c 15 s，72
º
c 30 s）；72
º
c 5 min；16
º
c ∞。引物序列如下所示：yqjf
‑
f：5
’‑
acagccaggatccgaattccggttttggcgtatggagcgcctgg
‑3’
（seq id no.5）；yqjf
‑
r：5
’‑
ctaccagttccatgaattcgccactcaggctgctgattgttt
‑3’ꢀ
（seq id no.6）。
39.pcr产物利用胶回收纯化试剂盒（vazyme，货号dc301
‑
01）进行胶回收纯化。
40.利用限制性内切酶ecor
і
（takara，货号1611）酶切p
‑
dntab质粒，其酶切体系为：质粒3μg10
×
q.cutbuffer10μl限制性内切酶5μl超纯水补至50μl酶切体系置于37
ꢀº
c孵育1h，进行胶回收纯化。
41.利用无缝克隆将yqjf片段克隆p
‑
dntab质粒上，其体系如下所示：连接体系置于50
ꢀº
c孵育30 min。连接产物转化e. coli dh5α感受态，涂布到含34 mg/l卡那霉素的lb 固体平板上，pcr筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p
‑
yqjf
‑
dntab（图2），再通过测序进行鉴定。
42.实施例2：生物感应器的构建
将p
‑
yqjf
‑
dntab重组质粒转化escherichia coli bw25113 感受态细胞（购买自weidi biotechnology，货号dl2050），涂布到含34 mg/l氯霉素的lb固体平板上，通过pcr筛选获得阳性克隆，由此获得含有载体p
‑
yqjf
‑
dntab的工程菌株。
43.实施例3：生物传感器性能的优化串联yqjf启动子：以puc
‑
yqjf为模版，引物yqjf
‑
2f和引物yqjf
‑
2r，进行聚合酶链式反应（pcr），扩增yqjf片段，其pcr扩增体系如下所示：pcr程序为：95
º
c 3 min；30循环
×
（95
º
c 15 s，55
º
c 15 s，72
º
c 30 s）；72
º
c 5 min；16
º
c ∞。引物序列如下所示：yqjf
‑
2f：5
’‑
cggttttggcgtatggagcgcct
‑3’
（seq id no.7）；yqjf
‑
2r：5
’‑
gccactcaggctgctgattgtt
‑3’ꢀ
（seq id no.8）。
44.pcr产物利用胶回收纯化试剂盒（vazyme，货号dc301
‑
01）进行胶回收纯化。
45.以p
‑
yqjf
‑
dntab为模版，引物yqjf
‑
dntab
‑
f和引物yqjf
‑
dntab
‑
r，进行聚合酶链式反应（pcr），扩增p
‑
yqjf
‑
dntab载体片段，使载体线性化，其pcr扩增体系如下所示：pcr程序为：95
º
c 3 min；30循环
×
（95
º
c 15 s，55
º
c 15 s，72
º
c 30 s）；72
º
c 8 min；16
º
c ∞。引物序列如下所示：yqjf
‑
dntab
‑
f：5
’‑
gaattcatggaactggtagtag
‑3’
（seq id no.9）；
yqjf
‑
dntab
‑
r：5
’‑
gccactcaggctgctgattgtttt
‑3’ꢀ
（seq id no.10）。
46.pcr产物利用胶回收纯化试剂盒（vazyme，货号dc301
‑
01）进行胶回收纯化。
47.利用dna连接酶进行平末端连接，连接体系如下所示：质粒片段100ngpcr产物片段50ng10
×
t4dnaligasebuffer2μlt4dnaligase0.5μl50%peg4000solution2μl超纯水补至20μl连接体系置于22
ꢀº
c孵育 90 min。连接产物转化e. coli dh5α感受态，涂布到含34 mg/l氯霉素的lb 固体平板上，pcr筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒p
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
dntab（图3），再通过测序进行鉴定。
48.优化rbs区域：选择两种较高强度的rbs1和rbs2序列，其核苷酸序列如下：rbs1：gtttgcccagggaagtagttaagaaaggaggtcttttt（seq id no.11）；rbs2：aaggtatgagcttatgcgcc（seq id no.12）。
49.华大基因公司化学合成yqjf
‑
yqjf
‑
rbs至pmv载体上，获得pmv
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs1和pmv
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs2载体。以pmv
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs1为模版，引物yqjf
‑
rbs1
‑
f和引物yqjf
‑
rbs1
‑
r，进行聚合酶链式反应（pcr），扩增yqjf
‑
yqjf
‑
rbs1片段，pcr扩增体系如下所示：pcr程序为：95
º
c 3 min；30循环
×
（95
º
c 15 s，55
º
c 15 s，72
º
c 30 s）；72
º
c 5 min；16
º
c ∞。引物序列如下所示：yqjf
‑
rbs1
‑
f：5
’‑
acagccaggatccgaattccggttttggcgtatggagcgcctgg
‑3’
（seq id no.13）；yqjf
‑
rbs1
‑
r：5
’‑
actaccagttccatgaattcaaaaagacctcctttcttaac
‑3’ꢀ
（seq id no.14）。
50.pcr产物利用胶回收纯化试剂盒（vazyme，货号dc301
‑
01）进行胶回收纯化。
51.利用限制性内切酶ecor
і
（takara，货号1611）酶切p
‑
dntab质粒，其酶切体系为：质粒3μg10
×
q.cutbuffer10μl
限制性内切酶5μl超纯水补至50μl酶切体系置于37
ꢀº
c孵育1h，进行胶回收纯化。
52.利用无缝克隆将yqjf
‑
yqjf
‑
rbs1片段克隆p
‑
dntab质粒上，其体系如下所示：连接体系置于50
ꢀº
c孵育30 min。连接产物转化e. coli dh5α感受态，涂布到含34 mg/l卡那霉素的lb 固体平板上，pcr筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pmv
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs1（图4），再通过测序进行鉴定。
53.以pmv
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs2为模版，引物yqjf
‑
rbs2
‑
f和引物yqjf
‑
rbs2
‑
r，进行聚合酶链式反应（pcr），扩增yqjf
‑
yqjf
‑
rbs2片段，pcr扩增体系如下所示： pcr程序为：95
º
c 3 min；30循环
×
（95
º
c 15 s，55
º
c 15 s，72
º
c 30 s）；72
º
c 5 min；16
º
c ∞。引物序列如下所示：yqjf
‑
rbs1
‑
f：5
’‑
acagccaggatccgaattccggttttggcgtatggagcgcctgg
‑3’
（seq id no.13）；yqjf
‑
rbs2
‑
r：5
’‑
ctaccagttccatgaattcggcgcataagctcataccttgc
‑3’ꢀ
（seq id no.15）。
54.pcr产物利用胶回收纯化试剂盒（vazyme，货号dc301
‑
01）进行胶回收纯化。
55.利用限制性内切酶ecor
і
（takara，货号1611）酶切p
‑
dntab质粒，其酶切体系为：质粒3μg10
×
q.cutbuffer10μl限制性内切酶5μl超纯水补至50μl酶切体系置于37
ꢀº
c孵育1h，进行胶回收纯化。
56.利用无缝克隆将yqjf
‑
yqjf
‑
rbs2片段克隆p
‑
dntab质粒上，其体系如下所示：
连接体系置于50
ꢀº
c孵育30 min。连接产物转化e. coli dh5α感受态，涂布到含34 mg/l卡那霉素的lb 固体平板上，pcr筛选阳性克隆，从阳性克隆中提取重组质粒pmv
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs2（图4），再通过测序进行鉴定。
57.实施例4：可视化检测爆炸物分子的应用白色酶标板检测：挑取实施例2获得的工程大肠杆菌和实施例3获得的优化的工程大肠杆菌单菌落于10 ml含有34 mg/l氯霉素的lb液体培养基中，于37
º
c摇床过夜培养活化，再转接至100 ml m9培养基中，培养至od
600
为0.2，分别转移至96孔白色酶标板的孔中，每孔200 μl中，分别设置不加2,4
‑
dnt的对照组，加入终浓度为25 mg/l、50 mg/l的2,4
‑
dnt两个实验组，每组3个平行，于37℃震荡培养，按照不同培养时间分别拍照。
58.结果如图5表明，在利用p
‑
yqjf
‑
dntab质粒构建的生物传感器检测时，加入2,4
‑
dnt的瓶/管中培养液比不加2,4
‑
dnt的对照组红色更明显，而且2,4
‑
dnt浓度越高，红色越明显；图6
‑
8显示在p
‑
yqjf
‑
dntab质粒构建的生物传感器基础上进行优化的生物传感器比未优化的生物传感器能够更高效的产生红色代谢物。其中，以优化rbs2的e.coli (p
‑
yqjf
‑
yqjf
‑
rbs2
‑
dntab)重组菌株构建的爆炸物分子生物感应器产生的红色代谢物可视化最为明显（图8）。说明本发明构建并且进行启动子串联和rbs优化的工程菌株作为一种感应爆炸物分子的生物传感器，能够更高效的感应dnt而产生肉眼可见的红色代谢物，而且dnt浓度越高，红色越明显，结果表明这种降解2,4
‑
dnt产生颜色反应的生物传感器检测爆炸物分子的效果非常显著。
59.以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。