一种几丁质酶、其编码基因及应用的制作方法

1.本发明涉及采用基因工程手段获得一种几丁质酶及其制备方法，属于生物工程技术领域。


背景技术：

2.几丁质是由n
‑
乙酰氨基葡萄糖(glcnac)通过β
‑
1,4糖苷键连接形成的高聚物，在自然界中的含量仅次于纤维素。几丁质广泛存在于多种生物体中，如足纲动物的外骨骼、甲壳类动物外壳、真菌细胞壁等，是一种非常丰富的自然资源。全球生物生命活动每年会产生大约100亿吨的几丁质，其中海洋中每年可生物合成几丁质约10亿吨，虾和蟹作为海洋中最常见的甲壳类生物，它们的外壳中含有丰富的几丁质，是海洋几丁质的主要来源之一。天然几丁质性质稳定、溶解性差，不易被直接利用。尤其近年来，海水养殖和淡水养殖虾蟹快速发展使得几丁质产量剧增，餐桌残留几丁质未被充分利用而造成资源浪费，大量几丁质堆积还造成严重的环境污染问题。几丁寡糖是几丁质降解后形成的低聚合度(dp<10)的寡糖，因其具有良好的抗肿瘤、抗炎症、抗病毒以及抗菌功能而广泛应用于医药行业。此外，几丁寡糖因其能够提升机体免疫力、细胞修复、促进肠道益生菌增殖和抗氧化功能而被应用于食品和保健品行业。在农业中，几丁寡糖也被用作植物生长促进因子，增强植物抵抗力。目前降低几丁质聚合程度的方法主要是化学法和生物酶法，但是化学方法成本高，污染大且产物质量不稳定，最终的产率低而高耗能。而生物酶法降解难溶几丁质是一种较其它化学和物理方法更加安全可靠的一种措施，采用此法得到的低聚糖产物纯度更高，结构稳定，且不会造成环境危害。微生物中含有丰富的几丁质酶资源，微生物几丁质酶分为内切型和外切型两种，可将几丁质降解为不同聚合度的几丁寡糖，利用微生物几丁质酶降解几丁质生产几丁寡糖具有非常重要的实际意义。


技术实现要素：

3.本发明的主要目的是针对现有技术的不足，提供一种几丁质酶(命名为vbch01)。
4.编码该酶的核苷酸序列如下：(seq id no:1)
5.[0006][0007]
其中5’端66bp片段为编码信号肽序列。
[0008]
该酶的氨基酸序列如下：(seq id no:2)
[0009]
[0010]
[0011]
[0012][0013]
其中，n端22个氨基酸为信号肽序列。
[0014]
本发明的另一目的，在于提供一种几丁质酶的制备方法，它包括如下步骤：
[0015]
(1)基于弧菌(vibrio sp.mccc 1a18305)基因组测序数据分析获得几丁质酶基因vbch01。
[0016]
(2)设计并合成扩增去除信号肽编码序列的几丁质酶基因vbch01的引物，其序列如下：
[0017]
上游引物vbch01f:5
’‑
cgcggatccgccttcagctccgtcaatcga
‑3’
(seq id no:3)
[0018]
下游引物vbch01r:5
’‑
ccgctcgagaggcgtctggcactcggcc
‑3’
(seq id no:4)。
[0019]
(3)pcr扩增及重组质粒的构建：
[0020]
用vbch01f和vbch01r引物，以弧菌(vibrio sp.mccc 1a18305)的基因组dna为模板进行扩增。pcr扩增条件如下：95℃预变性4min；95℃解链30s，58℃退火30s，72℃延伸2min，30个循环。pcr产物经限制性内切酶bamhi和xhoi酶切后被连接到经同样限制性内切酶酶切的表达载体pet
‑
22b上，将连接产物转化大肠杆菌escherichia coli top10受体菌株，筛选含有几丁质酶基因的重组质粒，并进行双酶切和测序验证。
[0021]
(4)几丁质酶的表达与纯化：
[0022]
将含有几丁质酶基因的重组质粒转化入大肠杆菌e.coli bl21(de3)受体菌株，用iptg诱导几丁质酶蛋白表达，利用ni sepharose
tm
6fast flow试剂盒纯化蛋白。纯化后的几丁质酶的sds
‑
page电泳检测结果如图1所示。
[0023]
本发明提供了一种几丁质酶，该酶最适ph为6.5左右，最适温度为50℃左右，在50℃下保温10min能保持90％左右的酶活力，在40℃和45℃下保温12h后酶活力仍无明显降低；ca
2
和k

对该酶活性具有明显促进作用；该酶对胶体几丁质具有良好的底物特异性，其水解终产物主要是二糖和单糖，是一种外切型几丁质酶。
附图说明
[0024]
图1为纯化后的酶蛋白的sds
‑
page电泳；
[0025]
图2为不同ph对酶活力的影响；
[0026]
图3为不同温度对酶活力的影响；
[0027]
图4为酶在不同温度条件下的稳定性检测；
[0028]
图5为不同金属离子和有机溶剂对酶活力的影响；
[0029]
图6为酶对不同底物水解作用的效果；
[0030]
图7为酶的水解产物分析
具体实施方式
[0031]
实施例1几丁质酶的制备
[0032]
步骤如下：
[0033]
实验材料
[0034]
弧菌vibrio sp.mccc 1a18305(来源于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为1a18305，可通过购买方式得到)，大肠杆菌e.coli top10、大肠杆菌e.coil bl21(de3)和表达载体pet
‑
22b(购自novagen公司)；细菌基因组dna提取试剂盒(购自厦门精聚公司)；dna聚合酶(购自全式金公司)；限制性内切酶bamhi、xhoi和t4连接酶(购自takara公司)；lb培养基(每升含蛋白胨10g，酵母抽提物5g，nacl 10g)；结合缓冲液(500mm nacl,20mm磷酸氢二钠，20mm咪唑，ph 7.4)；漂洗缓冲液(500mm nacl,20mm磷酸氢二钠，50mm咪唑，ph 7.4)；洗脱缓冲液(500mm nacl,20mm磷酸氢二钠，500mm咪唑，ph 7.4)；1
×
pbs缓冲液(10mm磷酸盐，ph 7.2～7.4)；3，5－二硝基水杨酸(dns)、氨苄青霉素和溶菌酶(购自上海生工)；ni sepharose
tm
6fast flow试剂盒(购自美国ge公司)；透析袋md25(购自北京索莱宝公司)；几丁质和羧甲基纤维素(购自sigma公司)，壳聚糖(购自上海国药)。本发明中使用的含氨苄青霉素的lb培养基，其氨苄青霉素浓度均为100μg/ml。
[0035]
实验步骤
[0036]
(1)基于vbch01全长序列，设计并合成扩增去除信号肽编码序列的几丁质酶基因vbch01的引物，其序列如下：
[0037]
上游引物vbch01f:5
’‑
cgcggatccgccttcagctccgtcaatcga
‑3’
[0038]
下游引物vbch01r:5
’‑
ccgctcgagaggcgtctggcactcggcc
‑3’
[0039]
(2)pcr扩增及重组质粒的构建
[0040]
利用细菌基因组dna提取试剂盒提取弧菌vibrio sp.mccc 1a18305的基因组dna。以弧菌vibrio sp.mccc 1a18305基因组dna为模板，使用vbch01f和vbch01r引物进行扩增。扩增体系(50μl)如下：vbch01f(10μm)1μl，vbch01r(10μm)1μl，10
×
pfu pcr buffer 5μl，dntpmix(2.5mm)4μl，基因组dna 2μl，pfu dna polymerase 0.25μl，ddh2o 36.75μl。扩增条件如下：95℃预变性4min；95℃30s，58℃30s，72℃2min，30个循环。将pcr产物进行胶回收，对pet
‑
22b载体及相应的目的片段用限制性内切酶bamhi和xhoi进行酶切后，用t4连接酶进行连接；将连接产物与受体菌e.coli top10感受态混合，冰上放置30min，42℃热激90s后，加入950μl lb液体培养基，37℃、100rpm复苏45min，离心后涂布于含氨苄青霉素的lb固体培养基上，37℃过夜培养，筛选重组质粒，并对重组质粒进行双酶切和测序验证，获得去掉n
‑
端信号肽的几丁质酶的相关核苷酸序列。
[0041]
(3)基因的诱导表达及粗酶液的制备
[0042]
将重组质粒转化入e.coli bl21(de3)中，获得含有几丁质酶基因的重组菌株。将重组菌株接种于含100μg/ml氨苄青霉素的lb液体培养基中过夜培养，按1:100接种于500ml含氨苄青霉素的lb液体培养基中，37℃、250rpm培养至od
600
为0.6～0.8左右，加入iptg使其终浓度为1mmol/l进行诱导，20℃、200rpm条件下诱导表达12～16h，5000rpm离心10min收集菌体。将菌体重悬于30ml结合缓冲液中，加入适量溶菌酶于4℃静置裂解细胞壁后进行超声破碎细胞，超声破碎工作/间隙时间为3s/5s，待细胞破碎完成后于4℃、10000rpm离心20min分离上清液和沉淀，收集上清即得到粗酶液。
[0043]
(4)酶的纯化
[0044]
将制备的粗酶液加入至预先平衡好的ni sepharose
tm
6fast flow柱料，4℃混匀2h，然后将柱料和上清液混合物转移至纯化柱中，利用重力沉降分离柱料和上清液。之后用4ml漂洗缓冲液漂洗柱料3～4次，漂洗结束后用4ml的洗脱缓冲液洗脱4～5次，分管收集洗
脱液，对洗脱液进行sds
‑
page电泳检测其纯度。利用md25透析袋，用1
×
pbs缓冲液对洗脱液进行过夜透析以去除咪唑和高浓度的nacl，获得纯化好的酶液。
[0045]
实施例2几丁质酶的酶学性质
[0046]
(1)几丁质酶活性测定方法
[0047]
胶体几丁质制备：称取30.0g几丁质粉加入300ml浓盐酸中，搅拌均匀，然后加入500ml去离子水，搅拌均匀后于4℃静置24h，待几丁质自然沉淀之后，取出上清收集沉淀。用去离子水反复重悬沉淀、离心收集，去除胶体几丁质上多余的盐酸，直至ph值约为7.0左右，4℃保藏备用。
[0048]
采用dns法测定还原糖含量。将20μl稀释的酶液和200μl 1％胶体几丁质底物混合，在50℃条件下反应2h。反应完成后加入500μl dns试剂，煮沸5min，立即置于冰水中冷却，短暂离心后取上清，测定od
540
值(以灭活酶液作为对照)，根据标准曲线计算还原糖量和酶活力。酶活力单位定义：在上述测定条件下，每分钟生成1μmol还原糖所需酶量定义为一个酶活力单位(u)。
[0049]
(2)酶的作用ph
[0050]
将稀释的酶液在50℃下，以不同缓冲液(100mm na
‑
acetate缓冲液，ph 3.5～6.0；100mm na
‑
phosphate缓冲液，ph 6.0～8.0；100mm tris
‑
hcl缓冲液，ph 7.0～9.0；100mm glycine
‑
naoh，ph 9.0～10.0)配制的1％的胶体几丁质作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同ph下该酶的相对活力。结果表明，该酶的最适ph为6.5，在ph 5.5～6.5范围内酶活性较高，酶活力能够达到80％以上，当ph值大于6.5时酶活力明显下降，结果见图2。
[0051]
(3)酶的作用温度
[0052]
将稀释的酶液在20～60℃范围内，以100mm na
‑
phosphate(ph 6.5)缓冲液配制的1％的胶体几丁质作为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算不同温度下的相对酶活力。结果表明，在ph为6.5时，该几丁质酶的最适反应温度为50℃，在40～50℃范围内酶活力较高，结果见图3。
[0053]
(4)酶在不同温度条件下的稳定性
[0054]
将酶液在不同温度(40℃、45℃、50℃)下保温，40℃和45℃下每隔2h取一次样，50℃下每10min取一次样，取样后与na
‑
phosphate(ph 6.5)缓冲液配制的1％的胶体几丁质反应进行酶活测定，以未经处理的酶的活力为100％，计算不同处理的酶的相对活力。结果表明，该酶在40℃和45℃条件下保温12h后，酶活力无明显降低；在50℃下保温10min后，酶活力保持90％左右，在50℃下保温20min分钟后，酶活力仍保留60％左右，结果见图4。
[0055]
(5)金属离子及有机溶剂对酶活力的影响
[0056]
在50℃、ph 6.5条件下，在反应体系中分别加入终浓度为1mm/1％(v/v)或5mm/5％(v/v)的不同金属离子和有机溶剂，然后测定酶活，以未添加任何金属离子或有机溶剂条件下的相对酶活力为100％，计算不同金属离子和有机溶剂影响下的酶的相对活力。结果表明，ca
2
对该酶活性具有明显促进作用，k

对酶活力也具有促进作用；较低浓度的mg
2
能够提升该酶活力，较高浓度的mg
2
则呈现出抑制作用；fe
2
、mn
2
、ni
2
、cu
2
、zn
2
、fe
3
和edta能够显著减低vbch01的酶活力，较高浓度的离子比低浓度离子的抑制效果更加明显；尿素对该酶活性影响不大；sds几乎完全抑制该酶活性；其它有机溶剂对该酶活力均呈现出抑制作
用，且浓度越高抑制效果越明显，结果见图5。
[0057]
(6)酶的底物特异性
[0058]
在50℃、ph 6.5条件下，分别以1％的胶体几丁质、粉末几丁质、壳聚糖和羧甲基纤维素为底物进行酶活测定，以最大酶活力为100％，计算几丁质酶水解不同底物的相对活力。结果表明该酶对胶体几丁质具有明显的水解活性，对其它三种底物水解活性极低或几乎没有活性，结果见图6。
[0059]
(7)水解产物分析
[0060]
采用薄层层析(tlc)法分析几丁质酶产物。将纯酶加入用不同ph缓冲液(na
‑
acetate缓冲液，ph 5.5和ph 6；na
‑
phosphate缓冲液，ph 6、ph 6.5、ph 7和ph 7.5；tris
‑
hcl缓冲液，ph 7)分别配制的1％胶体几丁质中，在50℃下完全反应72h，取反应上清进行薄层层析分析。展层剂为正丁醇：甲醇：25％氨水：水＝5:4:2:1(v:v:v:v)，显色剂为苯胺：二苯胺：丙酮：85％磷酸＝1:1:50:7.5(w:v:v:v)。结果显示，在na
‑
acetate和tris
‑
hcl缓冲液中，该酶水解胶体几丁质的最终产物主要是几丁二糖，该酶仅在ph 6的na
‑
phosphate缓冲液中水解终产物为几丁单糖，而在ph 6.5、ph 7和ph 7.5的na
‑
phosphate缓冲液中水解终产物为几丁二糖，结果见图7。上述结果显示该酶属于一种外切型几丁质酶。