小麦热胁迫相关蛋白TaANK及其编码基因与应用的制作方法

小麦热胁迫相关蛋白taank及其编码基因与应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种小麦热胁迫相关蛋白taank及其编码基因与应用。


背景技术：

2.非生物胁迫，如干旱、高温和盐渍环境因素严重影响小麦生长发育和产量。解析小麦在逆境胁迫下的应答与信号传导机制，提高小麦的耐胁迫能力，成为小麦遗传研究及小麦品种改良的重要任务之一。
3.植物在逆境胁迫下会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。
4.在干旱、高盐和低温等环境胁迫的逆境条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。目前发现植物响应胁迫信号网络主要有植物激素信号途径、脂质体信号途径、mapk信号途径、ros信号途径以及气孔信号途径。这些信号网络系统将植物的激素调节、新陈代谢、能量供应以及生长发育密切联系在一起。这说明植物对胁迫的适应，不仅依赖于耐逆相关基因的表达，还依赖于胁迫诱导引发的各种信号通路的综合调控作用。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子，如蛋白激酶、转录因子等。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种小麦热胁迫相关蛋白taank及其编码基因与应用。
6.第一方面，本发明保护taank蛋白或其相关生物材料在调控植物热胁迫抗性中的应用；所述相关生物材料为能够表达所述taank蛋白的核酸分子或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系或抑制所述核酸分子表达的物质；
7.所述taank蛋白为如下任一所示蛋白质：
8.(a1)氨基酸序列为seq id no.2的蛋白质；
9.(a2)将seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；
10.(a3)与(a1)-(a2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且具有相同功能的蛋白质；
11.(a4)在(a1)-(a3)中任一所限定的蛋白质的n端和/或c端连接蛋白标签后得到的
融合蛋白。
12.所述taank蛋白来源于麦类小麦属(triticum aestivum l.)。
13.上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
14.上述蛋白质中，所述标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
15.上述生物材料中，所述核酸分子是如下任一所述的dna分子：
16.(b1)seq id no.1所示的dna分子；
17.(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码所述taank蛋白的dna分子；
18.(b3)与(b1)或(b2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述taank蛋白的dna分子。
19.所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m napo4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1
×
ssc，0.1％sds中漂洗；也可为：在6
×
ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2
×
ssc，0.1％sds和1
×
ssc，0.1％sds各洗膜一次。
20.上述生物材料中，所述重组载体具体可为将seq id no.1所示的dna片段插入pwmb110载体的bamhi酶切位点间得到的重组载体。
21.上述生物材料中，所述重组菌可为将上述重组载体导入农杆菌菌株中得到的。所述农杆菌菌株具体可为农杆菌菌株eha105。
22.上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。
23.上述生物材料中，所述抑制所述核酸分子表达的物质具体可为rnai干扰载体。所述rnai干扰载体具体可为将seq id no.3与smai和saci酶切的pwmb110载体连接得到的rnai干扰载体。
24.所述应用具体可体现为：所述taank蛋白或能够表达所述taank蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量提高，植物热胁迫抗性提高；所述taank蛋白或能够表达所述taank蛋白的核酸分子在所述植物中的活性和/或表达量降低，植物热胁迫抗性降低。所述热胁迫抗性提高具体可体现为热胁迫条件下存活率提高和/或脯氨酸含量提高和/或mda含量降低。所述热胁迫抗性降低具体可体现为热胁迫条件下存活率降低和/或脯氨酸含量降低和/或mda含量提高。所述热胁迫条件具体可为42℃。
25.第二方面，本发明保护一种提高植物热胁迫抗性的方法，包括使受体植物中taank蛋白的表达量和/或活性提高的步骤。
26.所述taank蛋白如前文所示。所述热胁迫抗性提高具体可体现为热胁迫条件下存活率提高和/或脯氨酸含量提高和/或mda含量降低。
27.第三方面，本发明保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：向受体植物中导入能够表达taank蛋白的核酸分子，得到所述taank蛋白表达量提高的转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比热胁迫抗性提高。
28.所述“向受体植物中导入能够表达taank蛋白的核酸分子”是通过向所述受体植物中导入含有所述taank蛋白的编码基因的表达载体实现的。
29.所述taank蛋白的编码基因是如下任一所述的dna分子：
30.(b1)seq id no.1所示的dna分子；
31.(b2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码所述taank蛋白的dna分子；
32.(b3)与(b1)或(b2)限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且编码所述taank蛋白的dna分子。
33.所述表达载体具体可为将seq id no.1所示的dna片段插入pwmb110载体的bamhi酶切位点间得到的重组载体。
34.第四方面，本发明保护前文任一所述的taank蛋白或其相关生物材料，或，前文任一所述的方法在植物育种中的应用。所述育种的目的是为了选育热胁迫抗性高的植物。
35.第五方面，本发明保护方法a或方法b。
36.所述方法a为降低植物热胁迫抗性的方法，包括使受体植物中taank蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。
37.所述方法b为培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制或沉默受体植物中编码taank蛋白的核酸分子的表达，得到所述taank蛋白表达量降低的转基因植物；所述转基因植物与所述受体植物相比热胁迫抗性降低。
38.所述taank蛋白如前文所述。
39.所述“抑制或沉默受体植物中编码taank蛋白的核酸分子的表达”可通过向受体植物中导入rnai干扰载体实现。所述rnai干扰载体具体可为将seq id no.3与smai和saci酶切的pwmb110载体连接得到的rnai干扰载体。
40.前文任一所述植物为双子叶植物或单子叶植物；
41.进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；
42.更进一步地，所述禾本科植物为小麦。
43.所述小麦具体可为小麦品种fielder。
44.本发明的实验证明，将taank基因导入小麦中得到的转基因小麦，其对以上热胁迫的抗性高于受体小麦fielder，rnai干扰小麦的热胁迫的耐受性低于受体小麦fielder。本发明提供的蛋白和基因为人为控制抗逆和耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育抗逆性和耐逆性增强的植物中发挥重要的作用。
附图说明
45.图1为过表达和rnai干扰taank载体构建示意图。
46.图2为过表达taank小麦pcr阳性检测。
47.图3为过表达taank小麦qrt-pcr表达量检测。
48.图4为taank-rnai小麦pcr阳性检测。
49.图5为taank-rnai小麦qrt-pcr表达量检测。
50.图6为转基因taank小麦热胁迫表型鉴定。
51.图7为转基因taank小麦热胁迫生理指标测定。
52.图8为taank亚细胞定位。
具体实施方式
53.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。
54.下述实施例中的普通小麦(triticum aestivum l.)品种小白麦记载于文献“孙海桃等，小麦tadreb6转录因子互作蛋白的筛选，中国农业科学，2011,44(22)：4740-4747.”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用；公众也可从国家种质资源库获得(编号为zm242)。
55.下述实施例中的pwmb110载体、gfp载体pjit16318和小麦品种fielder记载于文献“xiao-yu cui,yuan gao,jun guo,tai-fei yu,wei-jun zheng,yong-wei liu,jun chen,zhao-shi xu and you-zhi ma*.bes/bzr transcription factor tabzr2 positively regulates drought responses by activation of tagst11.plant physiology.2019,180:605
–
620”中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
56.实施例1、taank的克隆
57.一、植物材料的处理
58.将水培生长10天左右的小白麦(triticum aestivum cv.xiaobaimai)三叶期整株幼苗用液氮速冻，-80℃保存备用。
59.二、总rna的提取
60.采用trizol法(tiangen)提取步骤一获得的处理后的小白麦幼苗叶片的总rna。
61.三、cdna的获得
62.第一链cdna合成用反转录酶xl(amv)。采用smart法合成ds cdna，pcr产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。通过设计合适的引物序列在小麦cdna文库进行扩增获得seq id no.1。seq id no.1也可以通过人工合成的方式获得。
63.具体扩增的引物为：
64.taank-f2:5
’-
tgtcacatctgaagcgttgg-3’；
65.taank-r5:5
’-
tagtagtgccagtttccaat-3’。
66.将seq id no.1所示的基因命名为taank基因，其开放阅读框架为自seq id no.1的5
′
端第1-642位核苷酸，将该基因编码的蛋白命名为taank蛋白，该蛋白的氨基酸序列为seq id no.2，由213个氨基酸残基组成。
67.实施例2、转基因taank小麦的获得及其耐逆性分析
68.一、转taank小麦的获得
69.1、过表达taank重组载体的构建
70.(1)taank基因的扩增
71.以从小麦扩增并回收的包含taank片段为模板，采用引物taank-110f和taank-110r进行扩增，得到pcr产物。引物序列如下，引物末端分别引入bamhi酶切识别位点并用下划线标注：
72.taank-110f：5'-cgactctagaggatccatgtatgcggaccagatc-3'；
73.taank-110r：5'-gggtacccggggatccctacgctctggattccaa-3'。
74.将pcr产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳,并将该pcr产物进行测序，结果表明该pcr产物具有seq id no.1。
75.采用agarose gel dna purification kit ver.2.0(takara公司，code no.:dv807a)回收纯化pcr产物。
76.(2)用限制性内切酶bamhi酶切pwmb110载体，回收载体骨架；将酶切产物和载体骨架连接，得到连接产物；
77.(3)将步骤(2)获得的连接产物热击转化top10菌株(tiangen，cb104-03)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆提取质粒进行测序。
78.测序结果表明，该质粒为将seq id no.1所示的dna片段插入pwmb110载体的bamhi酶切位点间得到的载体，并将该质粒命名为pwmb110-taank，pwmb110-taank重要元件信息如图1a所示。
79.2、rnai干扰taank重组载体的构建
80.(1)taank rnai干扰载体构建的具体操作为：人工合成seq id no.1中的第445-639位核苷酸序列和它的反向互补序列，中间为146bp的玉米alcohol dehydrogenase(adh)基因序列作为内含子，5’端加上smai酶切位点，3’端加上saci酶切位点，其中片段合成由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成，具体合成序列片段如seq id no.3所示。
81.(2)将pwmb110载体用smai和saci酶切，采用agarose gel dnapurification kit ver.2.0(takara公司，code no.:dv807a)回收酶切产物。并将(1)中人工合成的片段seq id no.3与smai和saci酶切的pwmb110载体连接，构建成taank-pwmb110-rnai干扰载体，taank-pwmb110-rnai干扰载体重要元件信息如图1b所示。
82.3、重组菌的构建
83.(1)将步骤1、2获得的重组质粒pwmb110-taank，taank-pwmb110-rnai，分别转化农杆菌eha105(购自北京拜尔迪生物技术公司)，得到重组农杆菌。
84.(2)提取重组农杆菌的质粒送去测序，结果表明pwmb110-taank，taank-pwmb110-rnai重组菌均为阳性重组农杆菌，并将其分别命名为eha105/pwmb110-taan和eha105/taank-pwmb110-rnai。
85.4、转taank小麦的获得和检测
86.(1)将重组农杆菌eha105/pwmb110-taank，eha105/taank-pwmb110-rnai，分别接种于yep液体培养基中，28℃、200rpm培养约30小时；
87.(2)将步骤(1)获得的菌液转至yep液体培养基(含50μg/ml利福平及卡那)中，28℃、200rpm培养约14小时(菌液od600达到1.5-3.0)；
88.(3)收集步骤(2)获得的菌体，4℃、4000g离心10min，用10％蔗糖(含0.02％silwet)稀释至od600约为1.0；
89.(4)超净工作台内，用1ml注射器针头挑取农杆菌菌落，注射小麦品种fielder幼胚，然后将注射后的幼胚在无菌、高湿条件下培养，直至组培小麦苗长出，继续培养小麦苗，直至收获t0代taank过表达和rnai干扰小麦种子。
90.分别将t0代taank过表达，rnai干扰小麦种子播种、自交，直到得到t3代小麦。
91.(5)利用qrt-pcr，pcr和检测taank过表达和taankrnai干扰小麦阳性植株。
92.对于qrt-pcr检测taank过表达和taankrnai干扰小麦表达量具体操作如下:分别提取taank过表达，taankrnai干扰不同小麦株系和受体小麦叶片rna，反转录为cdna，以如下序列为引物进行qrt-pcr检测：
93.qrt-taank-f2：5'-ctgatgataaatggaagc-3'；
94.qrt-taank-r2：5'-cgcctggaaggtaatagaa-3'。
95.过表达株系的检测结果如图3所示，结果显示，过表达株系表达量均比fielder有明显提高，且#3和#4号表达量相对一致，此后命名为oe-3和oe-4以作为后续实验分析。rnai干扰株系的检测记过如图5所示，结果显示，干扰株系rnai-4和rnai-6表达量相对于fielder有明显降低，且表达量相似，此后命名为rnai-4和rnai-6以作为后续试验分析。
96.对于pcr检测，分别提取taank过表达和taankrnai干扰不同小麦株系和受体小麦叶片dna。
97.对于taank过表达植株pcr检测，以dna为模板，以如下序列为引物进行检测，采用pwmb110-taank质粒作为阳性对照。
98.110-jc-f：5'-ccctgttgtttggtgttacttctg-3'；
99.qrt-taank-r2：5'-cgcctggaaggtaatagaa-3'。
100.对于taank干扰植株pcr检测，以dna为模板，以如下序列为引物进行检测，采用taank-pwmb110-rnai干扰载体作为阳性对照。
101.110-jc-f：5'-ccctgttgtttggtgttacttctg-3'；
102.rnai-jianr:5'-ccaaggtatctaatcagccatc-3'。
103.结果如图2和图4所示，在阳性株系中均能检测到特异性条带，在受体fidler中没有特异性条带，说明上述均为阳性株系。
104.二、转空载体小麦的获得
105.采用pwmb110载体替代pwmb110-taank和taank-pwmb110-rnai干扰载体，转化小麦品种fielder，得到t3转空载体小麦(pwmb110)。
106.三、转taank小麦的耐逆性分析
107.1、分别将编号为oe-3和oe-4的t3代过表达taank小麦种子、编号为rnai-4和rnai-6的taankrnai干扰种子、t3转空载体小麦(pwmb110)及fielder种子在水培盘中正常生长5天，每个株系取24粒种子，然后在42℃恒温培养箱中进行热胁迫处理，分别在不同时间，包括6小时，8小时，10小时和12小时观察幼苗生长状态，并进行拍照，在热处理6小时时进行取样，并测定相关生理指标(脯氨酸含量、mda含量)。
108.脯氨酸含量测定方法：利用苏州科铭生物技术有限公司脯氨酸(pro)含量测试盒(comin公司，code no.:pro-2-y)进行脯氨酸含量测定。称取约0.1g组织，加入1ml提取液，进行冰浴匀浆；之后置90℃振荡提取10min；10000g，25℃离心10min，取上清，冷却后待测。分光光度计预热30min以上，调节波长至520nm，蒸馏水调零。取0.5ml样本 0.5ml试剂一 0.5ml试剂二于有盖试管中，置沸水浴中保温30min，每10min振荡一次。待冷却后，在试管中加入1ml试剂三，振荡30s，静置片刻，使色素转至试剂三中；吸取0.8ml-1ml上层溶液于1ml玻璃比色皿中，于520nm波长处比色，记录吸光值a，并计算脯氨酸含量。
109.mda含量测定：利用苏州科铭生物技术有限公司丙二醛(mda)测试盒(comin公司，code no.:mda-2-y)进行mda含量测定。称取约0.1g组织，加入1ml提取液，进行冰浴匀浆。
8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。吸取0.6ml试剂一于1.5ml离心管中，再加入0.2ml样本,混匀。95℃水浴中保温30min，置于冰浴中冷却，10000g，25℃，离心10min。吸取上清液于200μl玻璃比色皿中，测定532nm和600nm处的吸光度，记为a532和a600并计算mda含量。
110.表型观察结果如图6所示。结果显示，编号为oe-3和oe-4的t3代过表达taank小麦在42℃条件下处理后，长势优于fielder，而rnai-4和rnai-6的taankrnai干扰小麦幼苗在热处理条件下，表现为叶片萎蔫，且部分死亡。
111.胁迫相关生理指标如图7所示。结果显示，过表达taank小麦在热处理后的存活率及脯氨酸含量均显著高于fielder，而mda含量显著低于fielder。taankrnai干扰小麦的存活率和脯氨酸含量显著低于fielder，而mda含量显著高于fielder。正常条件下taank过表达，taankrnai干扰和fielder小麦幼苗在表型和生理指标上无明显差别。受体fielder和t3转空载体小麦(pwmb110)在各项数据无显著差异。
112.上述结果表明，在小麦中过表达taank可显著提高转基因小麦的耐热性。
113.实施例3、taank亚细胞定位分析
114.一、taank-gfp载体构建
115.设计带有bamhi酶切位点的引物利用taank-pwmb110载体为模板扩增带有接头的线性片段，同时用bamhi酶将gfp载体酶切，并回收骨架。利用infusion酶将taank克隆到gfp载体上，得到taank-gfp重组载体。具体引物如下：
116.taank-gfp-f：5
’-
tatctctagaggatccatgtatgcggaccagatc-3’；
117.taank-gfp-r：5
’-
tgctcaccatggatcccgctctggattccaaggc-3’。
118.二、小麦原生质体的制备
119.1、配制15ml酶解液置于小烧杯中。
120.2、取长势良好的小麦fielder幼苗(生长1周左右)10株，将茎以上部分切成细条，置于酶解液中。
121.3、将小烧杯用锡箔纸包好，抽真空15min，然后在25℃，50rpm的摇床上避光放置约5h，至叶片细胞完全裂解。
122.4、用筛子(100目)过滤裂解液，去除杂质，将滤好的滤液(枪尖要被剪掉约3厘米)分装于2.0ml离心管中，4℃离心，100g，2min，加速度设置为2。
123.5、弃上清，用预冷的w5溶液轻轻混匀原生质体，4℃离心，100g，1min，加速度设置为2。
124.6、弃上清，用预冷的w5溶液轻轻混匀原生质体，在冰上静置30min。
125.7、室温离心，100g离心1min，加速度设置为2，弃上清。每管沉淀用0.5ml mmg溶液轻轻悬浮(本步骤及以下操作在23℃进行)。
126.8、取20μg质粒加入100μl原生质体。轻轻混匀后加入110μl peg/ca溶液轻柔混匀。置于25℃加热块中，避光转化25min。其中所用质粒为重组质粒taank-gfp,该重组质粒表达taank与gfp的融合蛋白，并由35s强启动子启动，由nos强终止子终止。
127.9、加入440μl w5溶液，以终止反应。23℃离心，100g离心1min，加速度设为2。
128.10、弃上清，加1ml w5溶液轻柔混匀，置于23℃培养箱中避光培养10-16h。
129.11、在共聚焦显微镜下观察绿色荧光。
130.表1酶解液
[0131][0132]
注：上述各物质混合于水中后，冷却至室温，加入cacl2，使cacl2在酶解液中的浓度为1m。
[0133]
表2 w5溶液
[0134][0135][0136]
注：用koh调ph至5.8。
[0137]
表3 peg4000溶液
[0138][0139]
表4 mmg溶液
[0140][0141]
注：用koh调ph至5.6。
[0142]
定位结果如图8所示。结果显示，taank-gfp位于细胞核中。