一种与植物耐逆性相关的GmNTF2B-1蛋白及其编码基因与应用的制作方法

一种与植物耐逆性相关的gmntf2b-1蛋白及其编码基因与应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种与植物耐逆性相关的gmntf2b-1蛋白及其编码基因与应用。


背景技术：

2.土壤干旱是影响植物生长和发育的重要环境因子。在干旱等胁迫条件下，植物能够在分子、细胞和整体水平上做出相应的调整，以最大程度上减少环境所造成的伤害并得以生存。许多基因受胁迫诱导表达，这些基因的产物不仅能够直接参与植物的胁迫应答，而且能够调节其它相关基因的表达或参与信号传导途径，从而使植物避免或减少伤害，增强对胁迫环境的抗性。与胁迫相关的基因产物可以分为两大类：第一类基因编码的产物包括离子通道蛋白、水通道蛋白、渗透调节因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜碱等)合成酶等直接参与植物胁迫应答的基因产物；第二类基因编码的产物包括参与胁迫相关的信号传递和基因表达调节的蛋白因子。他们在植物胁迫应答的基因表达调控中起着重要作用。


技术实现要素：

3.本发明所要解决的技术问题是如何调控植物耐逆性。
4.为解决上述技术问题，本发明首先提供了一种与植物耐逆性相关的蛋白质。
5.本发明所提供的与植物耐逆性相关的蛋白质来源于大豆属大豆(glycine max)，名称为gmntf2b-1，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：
6.a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
7.b)在序列表中序列1所示的蛋白质的n端或/和c端连接标签得到的融合蛋白；
8.c)将序列表中序列1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
9.d)与a)-c)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
10.其中，序列表中序列1由123个氨基酸残基组成。
11.上述b)中的蛋白质gmntf2b-1，所述标签具体如表1所示。
12.表1、标签的序列
13.标签残基序列poly-arg5-6(通常为5个)rrrrrpoly-his2-10(通常为6个)hhhhhhflag8dykddddkstrep-tag ii8wshpqfekc-myc10eqkliseedl
14.上述c)中的蛋白质gmntf2b-1，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/
或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
15.上述a)或b)或c)或d)的蛋白质gmntf2b-1可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
16.为解决上述技术问题，本发明又提供了与gmntf2b-1蛋白质相关的生物材料。
17.本发明提供的与gmntf2b-1蛋白质相关的生物材料为下述a1)至a12)中的任一种：
18.a1)编码gmntf2b-1蛋白质的核酸分子；
19.a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；
20.a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；
21.a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；
22.a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；
23.a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；
24.a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；
25.a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；
26.a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
27.a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
28.a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
29.a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
30.上述生物材料中，a1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：
31.1)其编码序列是序列表中序列2所示的cdna分子或序列表中序列3所示的基因组dna分子；
32.2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码gmntf2b-1蛋白质的cdna分子或基因组dna分子；
33.3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码gmntf2b-1蛋白质的cdna分子或基因组dna分子。
34.其中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
35.本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码gmntf2b-1的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的gmntf2b-1的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码gmntf2b-1且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
36.这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
37.上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
38.上述生物材料中，a2)所述的含有编码gmntf2b-1的核酸分子的表达盒(gmntf2b-1基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达gmntf2b-1的dna，该dna不但可包括启动gmntf2b-1转录的启动子，还可包括终止gmntf2b-1转录的终止子。进一步的，所述表达盒还
可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子；组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(nos终止子)、花椰菜花叶病毒camv 35s终止子、tml终止子及豌豆rbcs e9终止子。
39.可用现有的表达载体构建含有所述gmntf2b-1基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pahc25、pbin438、pcambia1302、pcambia2300、pcambia2301、pcambia1301、pcambia1300、pbi121、pcambia1391-xa或pcambia1391-xb(cambia公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3
′
端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mrna加工或基因表达的dna片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mrna前体的3
′
端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3
′
端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是atg起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(gus基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptii基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的epsps基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
40.上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。在本发明中，所述重组表达载体具体可为重组质粒16318hgfp-gmntf2b-1、pcambia1302-gmntf2b-1、pcambia3301-gmntf2b-1或pcambia1305-gmntf2b-1promoter。
41.进一步的，所述16318hgfp-gmntf2b-1为将gmntf2b-1基因插入16318hgfp的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表中序列2所示的dna片段插入16318hgfp的bamhⅰ酶切位点之间得到的重组质粒。所述pcambia1302-gmntf2b-1为将gmntf2b-1基因插入pcambia1302的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表中序列2所示的dna片段插入pcambia1302的ncoi酶切位点之间得到的重组质粒。所述pcambia3301-gmntf2b-1为将gmntf2b-1基因插入pcambia3301的多克隆位点得到的重组质粒，优选为将序列表中序列2所示的dna片段插入pcambia3301的nco i和bste ii酶切位点之间得到的重组质粒。所述pcambia1305-gmntf2b-1promoter为将pcambia1305载体的nco i酶切位点之间的35s启动子替换为序列表中序列4自5'端第1-2000位核苷酸所示的dna片段后得到的重组质粒。
42.上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
43.上述生物材料中，所述转基因植物细胞系均不包括繁殖材料。
44.为解决上述技术问题，本发明还提供了gmntf2b-1蛋白质或上述生物材料的新用途。
45.本发明提供了上述gmntf2b-1蛋白质或上述生物材料在调控植物耐逆性中的应用。
46.本发明还提供了gmntf2b-1蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性提高的转基因植物中的应用。
47.本发明还提供了gmntf2b-1蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。
48.本发明还提供了gmntf2b-1蛋白质或上述生物材料在调控植物生长中的应用。
49.上述应用中，所述调控为提高或促进。
50.上述gmntf2b-1蛋白质在作为核转运蛋白中的应用也属于本发明的保护范围。
51.上述应用中，所述耐逆性为耐旱性。所述提高植物耐旱性具体体现在如下(1)-(7)中任一种：(1)在干旱处理下，提高植物存活率；(2)在干旱处理下，提高植物根干重；(3)在干旱处理下，提高植物根表面积；(4)在干旱处理下，降低植物根和/叶片中的过氧化氢含量；(5)在干旱处理下，降低植物叶片受损伤面积比例；(6)在干旱处理下，降低植物叶片中的超氧阴离子自由基含量；(7)在干旱处理下，降低植物根系的相对电导率。所述干旱处理可为peg处理或控水处理。
52.上述应用中，所述植物为双子叶植物。所述双子叶植物具体可为大豆；所述大豆具体可为willimas82。
53.为解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育耐逆性提高的转基因植物的方法。
54.本发明提供的培育耐逆性提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中gmntf2b-1蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物。
55.上述方法中，所述提高受体植物中gmntf2b-1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达gmntf2b-1蛋白质。
56.上述方法中，所述过表达的方法为将gmntf2b-1蛋白质的编码基因导入受体植物；
57.所述gmntf2b-1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列2所示的dna分子。
58.在本发明的一个实施方式中，gmntf2b-1蛋白质的编码基因通过重组质粒pcambia3301-gmntf2b-1导入受体植物中。所述重组质粒pcambia3301-gmntf2b-1为在pcambia3301载体的nco i和bste ii酶切位点之间插入了序列表中序列2所示的dna片段后得到的载体。
59.上述方法中，所述耐逆性为耐旱性。所述转基因植物的耐逆性高于所述受体植物体现在如下x1)-x7)中任一种：
60.x1)转基因植物根系和/或叶片中的过氧化氢含量低于受体植物；
61.x2)转基因植物的根表面积大于受体植物；
62.x3)转基因植物的存活率高于受体植物；
63.x4)转基因植物的根干重高于受体植物；
64.x5)转基因植物的叶片受损伤面积比例低于受体植物；
65.x6)转基因植物叶片的超氧阴离子自由基含量低于受体植物；
66.x7)转基因植物根系的相对电导率低于受体植物。
67.为了解决上述技术问题，本发明最后提供了一种促进植物生长发育的方法。
68.本发明提供的促进植物生长发育的方法包括提高受体植物中gmntf2b-1蛋白质的
含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的生长发育水平高于所述受体植物。
69.上述方法中，所述提高受体植物中gmntf2b-1蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体植物中过表达gmntf2b-1蛋白质。
70.上述方法中，所述过表达的方法为将gmntf2b-1蛋白质的编码基因导入受体植物；
71.所述gmntf2b-1蛋白质的编码基因的核苷酸序列是序列表中序列2所示的dna分子。
72.在本发明的一个实施方式中，gmntf2b-1蛋白质的编码基因通过重组质粒pcambia1302-gmntf2b-1导入受体植物中。所述重组质粒pcambia1302-gmntf2b-1为在pcambia1302载体的nco i酶切位点之间插入了序列表中序列2所示的dna片段后得到的载体。
73.上述方法中，所述转基因植物的生长发育水平高于所述受体植物体现在如下y1)或y2)中任一种：
74.y1)转基因植物的根长长于受体植物；
75.y2)转基因植物的根表面积大于受体植物。
76.上述方法中，携带有所述编码基因的表达载体可通过使用ti质粒、ri质粒、植物病毒载体、直接dna转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。
77.上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含将所述gmntf2b-1基因转化受体植物得到的第一代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。
78.上述方法中，所述植物为双子叶植物。所述双子叶植物具体可为大豆；所述大豆具体可为栽培种willimas82。
79.实验证明本发明的gmntf2b-1在干旱诱导下表达，编码的蛋白定位到细胞核上。本发明的gmntf2b-1可以提高植物的耐旱性、促进植物生长发育，为人为控制耐逆相关基因的表达提供了基础，将在培育耐逆性增强的植物育种中发挥重要的作用。
附图说明
80.图1为gmntf2b-1受干旱胁迫诱导表达的荧光实时定量(real-time)pcr结果。
81.图2为gmntf2b-1在拟南芥原生质体中的定位结果。a：16318hgfp空载体对照；b：gmntf2b-1定位于细胞核中。
82.图3为gmntf2b-1在正常条件下对大豆发状根生长的影响。a：转空载体大豆发状根的表型；b：转gmntf2b-1大豆发状根的表型；c：正常条件下，转空载体大豆发状根和转gmntf2b-1大豆发状根根系总根长的统计分析；d：正常条件下，转空载体大豆发状根和转gmntf2b-1大豆发状根根系表面积的统计分析；e：转空载体大豆发状根根尖分生区纵剖面；f：转gmntf2b-1大豆发状根根尖分生区纵剖面。其中，35s∷gfp为转空载体大豆发状根；gmntf2b-1pro∷gmntf2b-1-gfp为转gmntf2b-1大豆发状根。
83.图4为gmntf2b-1对大豆耐旱性的影响。a：转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆干旱
处理第5天(干旱处理方式为控水)的表型；b：转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆干旱处理第6天的表型；c：转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的发状根表型；d：干旱处理后，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的存活率；e：干旱处理后，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的根表面积；f：干旱处理后，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的根干重；g：转gmntf2b-1大豆发状根和转空载体大豆发状根中的gmntf2b-1相对表达量；h：干旱处理后，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的叶片dab染色结果；i：干旱处理后，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的叶片nbt染色结果；j和k分别为h和i的局部放大；l：干旱处理后，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的叶片中过氧化氢含量；m：干旱处理后，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的叶片受损伤比例。其中，wt为转空载体大豆；gmntf2b-1pro∷gmntf2b-1为转gmntf2b-1大豆。
84.图5为干旱处理条件下的根部活性氧含量的定性和定量实验。a：正常条件下，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的根系dab染色结果；b：干旱处理后，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的根系dab染色结果；c：干旱处理后，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的根系过氧化氢含量；d：干旱处理后，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的根系相对电导率。
85.图6为转空载体大豆发状根和转gmntf2b-1大豆发状根的阳性检测和土壤含水量、水势的测定。a：转空载体大豆发状根和转gmntf2b-1大豆发状根的阳性检测；b：干旱处理过程中，土壤含水量的变化；c：干旱处理过程中，土壤水势的变化。
86.图7为大豆发状根验证gmntf2b-1的表达是否受干旱诱导。a：正常条件下，转pcambia1305大豆发状根中的报告基因gus的表达情况；b：正常条件下，转pcambia1305-gmntf2b-1promoter大豆发状根中的报告基因gus的表达情况；c：20％peg模拟干旱条件下，转pcambia1305大豆发状根中的报告基因gus的表达情况；d：20％peg模拟干旱条件下，转pcambia1305-gmntf2b-1promoter大豆发状根中的报告基因gus的表达情况；e：a、b、c和d这四种情况下gus基因的相对表达量。
具体实施方式
87.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
88.下述实施例中所使用的试剂配方如下：
89.表1、纤维素酶解液配方
[0090][0091]
表2、peg4000溶液配方
[0092]
1peg40001g2水0.75ml30.8m mannitol0.625ml41m cacl20.25ml
[0093]
表3、w5溶液配方
[0094][0095]
表4、mmg溶液配方
[0096][0097]
表5、wi溶液配方
[0098][0099]
表6、gm(germination medium)萌发培养基
[0100][0101][0102]
表7、im(infection medium)侵染培养基配方
[0103][0104]
表8、ccm(co-cultivated medium)共培养培养基配方
[0105][0106]
表9、rim(root induction medium)根诱导培养基
[0107][0108]
下述实施例中所使用的试剂盒来源如下：
[0109]
dab染液试剂盒：产品名称：dab显色试剂盒；商品货号：da010；商品品牌：solarbio；规格：2
×
10ml。
[0110]
nbt染液试剂盒：产品名称：nbt显色试剂盒；商品货号：i023-1-1；商品厂家：南京建成生物工程研究所有限公司；规格：2
×
10ml。
[0111]
过氧化氢含量测定试剂盒：产品名称：过氧化氢测定试剂盒(比色法)；商品货号：a064-1-1；商品厂家：南京建成生物工程研究所有限公司；规格：50管/48样。
[0112]
gus染色试剂盒：产品名称：gus染色试剂盒；商品货号：rtu4032；商品厂家：中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。
[0113]
下述实施例中的16318hgfp载体、pcambia3301载体和农杆菌k599菌株均记载于文献“gao,y.,ma,j.,zheng,j.c.,chen,j.,chen,m.,zhou,y.b.,et al.(2019)the elongation factor gmef4 is involved in the response to drought and salt tolerance in soybean.int j mol sci.20(12).doi:10.3390/ijms20123001.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0114]
下述实施例中的pcambia1302载体、pcambia1305载体均记载于文献“li,b.,liu,y.,cui,x.y.,fu,j.d.,zhou,y.b.,zheng,w.j.,et al.(2019)genome-wide characterization and expression analysis of soybean tga transcription factors identified a novel tga gene involved in drought and salt tolerance.front plant sci.doi:10.3389/fpls.2019.00549.”中，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
[0115]
实施例1、gmntf2b-1蛋白及其编码基因的获得及gmntf2b-1表达特性分析
[0116]
一、gmntf2b-1蛋白及其编码基因的获得
[0117]
将沙土中生长14天左右的williams 82大豆幼苗，用液氮速冻，-80℃保存备用。采用trizol法(tiangen)提取大豆叶片总rna，第一链cdna合成用反转录酶xl(amv)。采用smart法合成ds cdna，pcr产物进行1.0％琼脂糖凝胶电泳检测。
[0118]
通过5’race和3’race的方法获得gmntf2b-1基因全长cdna序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示，编码由123个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白命名为gmntf2b-1，该蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。gmntf2b-1基因的基因组序列如序列表中序列3所示。
[0119]
二、实时荧光定量pcr分析gmntf2b-1的表达特性
[0120]
1、胁迫处理
[0121]
取正常生长条件下的大豆幼苗(两片真叶即可)进行以下处理：
[0122]
(1)干旱处理：将长势一致的土培的大豆幼苗取出吸干根上的水分，置于干燥的滤纸上，干旱处理1小时、3小时、6小时、12小时、24小时后取出材料，用液氮速冻，-80℃保存备用。
[0123]
(2)对照处理：直接取未经任何处理的大豆幼苗-80℃冻存作为对照(0小时)。
[0124]
2、rna的提取
[0125]
采用trizol法(tiangen)提取大豆叶片总rna。
[0126]
3、cdna的获得
[0127]
将纯化的rna反转录为cdna。
[0128]
4、实时荧光定量pcr
[0129]
将cdna稀释50倍后用作q-rt-pcr的模板。用基因3
′
端非编码区的特异引物对对样品进行q-rt-pcr扩增，分析基因对各种处理的应答情况，以actin作为内参基因。引物序列如下：
[0130]
目标基因：f:5
’-
gtggagcactactacagcac-3’；
[0131]
r:5
’-
ggtggagattgagtggtggc-3’；
[0132]
内参基因：f:5
’-
cggtggttctatcttggcatc-3’；
[0133]
r:5
’-
gtctttcgcttcaataacccta-3’。
[0134]
q-rt-pcr在abi 7000实时荧光定量pcr仪上进行，一次平行试验设3次重复。利用livak kj和schmittgen td(2001)报道的方法，即2-δδct
计算相对表达量。δδc
t
＝(c
t.target
－c
t.actin
)
time x
－(c
t.target
－c
t.actin
)
time 0
。time x表示任意时间点，time 0
表示经actin校正后1倍量的目标基因表达。
[0135]
结果见图1。在干旱处理条件下，gmntf2b-1的表达量在处理后1h明显升高，处理后8h达到峰值，其数值是处理前的6倍左右，处理后12h表达量开始出现缓慢回落。由此可见，gmntf2b-1明显受干旱诱导表达。
[0136]
实施例2、gmntf2b-1亚细胞定位分析
[0137]
一、表达载体的构建
[0138]
1、gmntf2b-1基因的克隆
[0139]
根据gmntf2b-1基因序列设计引物gmntf2b-1-16318hgfp-f和gmntf2b-1-16318hgfp-r，引物末端分别引入bamh i酶切识别位点，以大豆cdna为模板pcr扩增gmntf2b-1。引物序列如下：
[0140]
gmntf2b-1-16318hgfp-f：5
’-
tatctctagaggatccatggatccagacgcg-3’；
[0141]
gmntf2b-1-16318hgfp-r：5
’-
tgctcaccatggatcctgcatagtttaa-3’。
[0142]
pcr扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用agarose gel dna purification kit ver.2.0回收纯化1.6kb左右的条带。
[0143]
2、重组表达载体的构建
[0144]
①
用限制性内切酶bamh i酶切步骤1回收纯化的pcr产物，回收酶切产物。
[0145]
②
用限制性内切酶bamh i酶切16318hgfp载体，回收载体骨架。
[0146]
③
将步骤
①
的酶切产物和步骤
②
的载体骨架连接，得到重组质粒16318hgfp-gmntf2b-1。
[0147]
④
将步骤
③
的连接产物电击转化top10菌株(购自北京天根公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序。
[0148]
测序结果表明：重组质粒16318hgfp-gmntf2b-1为在16318hgfp载体的bamh i酶切位点之间插入了序列表中序列2所示的dna片段后得到的载体。
[0149]
二、拟南芥原生质体的转化
[0150]
1、土培室种植拟南芥(哥伦比亚生态型(col-0))。
[0151]
2、生长良好情况下，在未开花前取叶片制备原生质体。
[0152]
3、剪取中部生长良好的叶片，用刀片切成0.5-1mm宽的叶条。
[0153]
4、将切好叶条放入预先配好的酶解液中(每5-10ml酶解液大约需10-20片叶子)。用镊子使叶子完全浸入酶解液。
[0154]
5、真空泵于黑暗中(锡箔纸包裹)抽真空30分钟。此时可配制peg4000溶液，200μl和1000μl枪头去尖，使操作时吸打缓和，peg4000溶液一次配置可以保存五天，但是最好现用现配，每个样品需100μl peg4000溶液，可根据实验样品量调整溶液配置总量。
[0155]
6、在室温中无须摇动，继续黑暗条件下酶解(28℃、50rpm摇至少3h)。当酶解液变绿时轻轻摇晃培养皿促使原生质体释放出来。此时预冷一定量w5溶液。
[0156]
7、显微镜下检查溶液中的原生质体，拟南芥叶肉原生质体大小大约30-50μm。
[0157]
8、在过滤除去未溶解的叶片前用等量的w5溶液稀释含有原生质体的酶液。
[0158]
9、先用w5溶液润湿35-75μm的尼龙膜或60-100目筛子，然后用它过滤含有原生质体的酶解液。
[0159]
10、用30ml圆底离心管4℃、100g离心1-2min，沉淀原生质体，尽量去除上清。然后用10ml冰上预冷的w5溶液轻柔重悬原生质体。
[0160]
11、在冰上静至原生质体30分钟。
[0161]
以下操作在室温23℃下进行：
[0162]
12、100g离心8-10min，使原生质体沉淀。在不碰触原生质体沉淀的情况下尽量去除w5溶液。然后用适量mmg溶液(1ml)重悬原生质体，使之终浓度在2
×
105个/ml。
[0163]
13、加入10μl或者20μl dna(10-20微克约5-10kb的步骤一制备的重组质粒16318hgfp-gmntf2b-1)至2ml ep管中。同时以16318hgfp空载体作为对照。
[0164]
14、加入100μl原生质体(2
×
104个)，轻柔混合。
[0165]
15、加入110μl peg溶液，轻柔拍打离心管完全混合(每次大约可以转化6-10个样品)。
[0166]
16、诱导转化混合物20-30min(转化时间视实验情况而定，要表达量更高也许需要更长转化时间)。
[0167]
17、室温下用400-440μl w5溶液稀释转化混合液，然后轻柔颠倒摇动离心管使之混合完好，以终止转化反应。
[0168]
18、室温下100g离心2min，然后除上清。再加入1ml w5溶液悬浮清洗一次，100g离心2min，去上清。
[0169]
19、用1ml wi溶液轻柔重悬原生质体于多孔组织培养皿中。
[0170]
20、室温下(20-25℃)诱导原生质体18小时以上。之后在激光共聚焦显微镜下观察gfp标签表达。
[0171]
三、拟南芥原生质体镜检
[0172]
将暗培养18h之后的原生质体压片，然后在激光扫描共聚焦显微镜(bio-rad microradiance)(laser scanning confocal microscopy，lsmc)观察gfp(绿色荧光蛋白)荧光，并进行扫描照像。lscm的工作参数如下：ex＝488nm，em＝525
±
15nm，power＝10％，zoom7，中速扫描，frame512
×
512。软件为time-course和photoshop5.0。
[0173]
结果见图2。结果表明：相比于空载体对照在整个细胞内弥散的荧光信号，gmntf2b-1主要定位于细胞核中。
[0174]
实施例3、gmntf2b-1蛋白对大豆发状根生长的影响
[0175]
一、重组表达载体的构建
[0176]
1、gmntf2b-1基因的克隆
[0177]
根据gmntf2b-1基因的序列设计引物对(gmntf2b-1-1302-f和gmntf2b-1-1302-r)，引物末端分别引入nco i酶切识别位点，以大豆cdna为模板pcr扩增gmntf2b-1。引物序列如下：
[0178]
gmntf2b-1-1302-f：5
’-
gggactcttgaccatgatggatccagacgcg-3’；
[0179]
gmntf2b-1-1302-r：5
’-
tcagatctacccatggtgcatagtttaa-3’。
[0180]
pcr扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用agarose gel dna purification kit ver.2.0回收纯化1.6kb左右的条带。
[0181]
2、重组表达载体的构建
[0182]
①
用限制性内切酶nco i酶切步骤1回收纯化的pcr产物，回收酶切产物。
[0183]
②
用限制性内切酶nco i酶切pcambia1302载体，回收载体骨架。
[0184]
③
将步骤
①
的酶切产物和步骤
②
的载体骨架连接，得到重组质粒pcambia1302-gmntf2b-1。
[0185]
④
将步骤
③
的连接产物电击转化top10菌株(购自北京天根公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序。
[0186]
测序结果表明：重组质粒pcambia1302-gmntf2b-1为在pcambia1302载体的ncoi酶切位点之间插入了序列表中序列2所示的dna片段后得到的载体。
[0187]
二、转基因大豆发状根的获得及鉴定
[0188]
1、重组农杆菌制备：将重组质粒pcambia1302-gmntf2b-1转化农杆菌gv3101(北京博迈德生物技术有限公司)，得到重组农杆菌。
[0189]
2、豆子灭菌及培养：全程在通风橱操作，先取200粒豆子(品种williams82，中国农
业科学院种质库)置于直径15cm的培养皿中，放于密闭容器内。再取100ml bleech(花王漂白水，购买于北京双安商场地下精品超市)加入4ml浓盐酸(购买于西陇化工)，将混合液立即置于密闭容器内，密封静置16-18h。第二天将密闭容器中的豆子拿出来，放于超净台，打开培养皿盖子，风吹0.5-1h。将豆子摆放于含有gm培养基的培养皿中，10粒/皿，24℃，18h(光照)/6h(黑暗)，培养3-4天，看种子状态，胚根长至2cm左右就好。
[0190]
3、菌液培养：将步骤1获得的重组农杆菌接种于1ml的lb液体培养基(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素)中，28℃、300rpm培养约30小时，备用。2-3天后，取30μl菌液加至30ml lb液体培养基(含50mg/ml利福平，100mg/ml卡那霉素)中，培养至od
650
＝0.5-0.7。离心(4000rpm，10min)，加入im液体培养基(不加agar)，使菌液od
650
＝0.6。
[0191]
4、外植体的获取：将萌发3-5天的豆子，自下胚轴0.3-0.5cm处切下，将子叶一分为二切开，去除顶芽。
[0192]
5、转化及共培养：将步骤3获得的菌液和步骤4获得的外植体混合30min，摇动2-3次，期间将滤纸放在ccm上(1张/皿)。倒掉菌液，将子叶节置于几层滤纸上，吸掉多余菌液，接着摆放在有滤纸的ccm上(25个/皿)，28℃，暗培养3天。
[0193]
6、子叶节脱菌：用液体rim(不加agar)洗4-5遍，滤纸吸干。倒插入固体rim培养基，下胚轴朝上，培养10-14天左右发根长出，得到转gmntf2b-1大豆发状根。
[0194]
按照上述方法将重组质粒pcambia1302-gmntf2b-1替换为pcambia1302载体，且保持其他步骤不变，得到转空载体大豆发状根。
[0195]
7、在dna水平上对转gmntf2b-1大豆发状根和转空载体大豆发状根进行分子鉴定。
[0196]
鉴定的引物序列如下：
[0197]
转空载体大豆发状根dna水平鉴定的引物对：
[0198]
f：5'-agtaaaggagaagaacttttcactg-3'；
[0199]
r：5'-tttgtatagttcatccatgccatgat-3'；
[0200]
预期条带为711bp。
[0201]
转gmntf2b-1大豆发状根dna水平鉴定的引物对：
[0202]
f：5
’-
gactcttgaccatggatggatccagacgcg-3；
[0203]
r：5
’-
tgacgagggtgtctccctcaaactt-3’；
[0204]
预期条带为751bp。
[0205]
结果见图3g。转空载体大豆发状根中均扩增得到大小为711bp的目的条带，而转gmntf2b-1大豆发状根中均扩增得到大小为751bp的目的条带。
[0206]
8、在cdna水平上检测转gmntf2b-1大豆发状根和转空载体大豆发状根中目的基因gmntf2b-1的相对表达量。以cyp2基因为内参基因。引物序列如下：
[0207]
内参cyp2基因引物序列：
[0208]
f：5'-accagaattgcattaccagttga-3'；
[0209]
r：5'-ggtgccgagactcatgaagatat-3'；
[0210]
目的基因引物序列：
[0211]
f：5
’-
gtggagcactactacagcac-3’；
[0212]
r：5
’-
ggtggagattgagtggtggc-3’。
[0213]
结果见图3h。结果表明：与转空载体大豆发状根中gmntf2b-1的表达量相比，转
gmntf2b-1大豆发状根中gmntf2b-1的表达量升高了14倍。
[0214]
三、转基因大豆发状根阳性鉴定
[0215]
采用徒手切片法，用刀片将步骤二获得的转gmntf2b-1大豆发状根和转空载体大豆发状根的根系切成薄片至于激光共聚焦显微镜(lsm 880with airyscan，中国农业科学院作物科学研究所重大工程楼)下观察gfp荧光蛋白的荧光信号。
[0216]
结果见图3e和图3f。结果表明：转gmntf2b-1大豆发状根和转空载体大豆发状根中均观察到了荧光信号，成功获得转gmntf2b-1大豆发状根和转空载体大豆发状根。
[0217]
四、转基因大豆发状根表型鉴定
[0218]
观察步骤二获得的转gmntf2b-1大豆发状根(n＝12个)和转空载体大豆发状根(n＝12个)的根系生长发育情况，并比较根长和根表面积大小。实验重复三次，结果取平均值
±
标准差。
[0219]
根系生长发育结果见图3a和图3b。结果表明，在正常生长条件下，gmntf2b-1可以促进大豆根系生长，主要表现在促进根系发育方面。
[0220]
根长和根表面积统计结果见图3c和图3d。结果表明：转gmntf2b-1大豆发状根的根长平均为16.5cm；转空载体大豆发状根的根长平均为11.1cm；转gmntf2b-1大豆发状根的根表面积平均为8.7cm2；转空载体大豆发状根的根表面积平均为4.1cm2。转gmntf2b-1大豆发状根的根长和根表面积明显大于和转空载体大豆发状根。
[0221]
实施例4、gmntf2b-1蛋白对大豆耐逆性的影响
[0222]
一、重组表达载体的构建
[0223]
1、gmntf2b-1基因的克隆
[0224]
根据gmntf2b-1基因的序列设计引物对(gmntf2b-1-3301-f和gmntf2b-1-3301-r)，引物末端分别引入nco i和bste ii酶切识别位点，以大豆cdna为模板pcr扩增gmntf2b-1。
[0225]
引物序列如下：
[0226]
gmntf2b-1-3301-f：5
’-
ggactcttgaccatgatggatccagacgcg-3’；
[0227]
gmntf2b-1-3301-r：5
’-
attcgagctggtcacctcatgcatagtttaa-3’。
[0228]
pcr扩增产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，采用agarose gel dna purification kit ver.2.0回收纯化1.6kb左右的条带。
[0229]
2、重组表达载体的构建
[0230]
①
用限制性内切酶nco i和bste ii酶切步骤1回收纯化的pcr产物，回收酶切产物。
[0231]
②
用限制性内切酶nco i和bste ii酶切pcambia3301载体，回收载体骨架。
[0232]
③
将步骤
①
的酶切产物和步骤
②
的载体骨架连接，得到重组质粒pcambia3301-gmntf2b-1。
[0233]
④
将步骤
③
的连接产物电击转化top10菌株(购自北京天根公司)，37℃过夜培养，挑取阳性克隆进行测序。
[0234]
测序结果表明：重组质粒pcambia3301-gmntf2b-1为在pcambia3301载体的nco i和bste ii酶切位点之间插入了序列表中序列2所示的dna片段后得到的载体。
[0235]
二、转基因大豆发状根的获得
[0236]
1、农杆菌转化
[0237]
①
将-80℃保存的农杆菌k599菌株重新活化，28℃，200rpm培养菌液od
600
至0.6-1.0。
[0238]
②
吸取1ml活化的菌液于40ml含链霉素(50mg/l)的lb培养基中，28℃，200rpm培养菌液od
600
至0.6左右。
[0239]
③
将菌液转移到灭菌的50ml离心管中，插入冰内，冰浴30min后，5000rpm离心5min，弃上清。
[0240]
④
用2ml经灭菌的20mm的cacl2重悬菌体，混匀后按每管200μl分装。液氮速冻后，置于-80℃保存。
[0241]
⑤
分别向新制备的200μl农杆菌感受态中加入4μl(约2μg)的步骤一中的重组质粒pcambia3301-gmntf2b-1，冰浴5min后，液氮冷冻8min，在迅速置于37℃水浴5min。
[0242]
⑥
向每管中加入600μl不含抗生素的lb培养基，28℃，200rpm摇床上培养4-6h。
[0243]
⑦
5000rpm离心2min，去除部分上清，使每管内留有100-200μl液体，用移液枪悬浮液体，然后均匀地涂有kan(50mg/l)和str(50mg/l)的lb固体培养基上，28℃条件下，倒置培养至单菌落长出。
[0244]
⑧
挑取单菌落，扩大培养，筛选得到阳性菌落。
[0245]
⑨
将willimas82大豆种子均匀播种于高温高压灭菌的蛭石内，添加适量营养液，高湿条件下培养至大豆子叶形成(约5d左右)。在播种大豆的同时将转化含有目标基因表达载体(重组质粒pcambia3301-gmntf2b-1)的农杆菌k599活化后，在含有kan(50mg/l)与str(50mg/l)抗性的固体培养基上，28℃培养至菌落长出。
[0246]
⑩
用1ml注射器针头挑取农杆菌菌落，在大豆子叶节处注射。高温、高湿条件下培养，直至大豆发状根长出，得到转gmntf2b-1大豆发状根。
[0247]
按照上述方法将重组质粒pcambia3301-gmntf2b-1替换为pcambia3301载体，且保持其他步骤不变，得到转空载体大豆发状根。
[0248]
2、转基因大豆发状根的分子鉴定
[0249]
在dna水平上对步骤1获得的转gmntf2b-1大豆发状根和转空载体大豆发状根进行鉴定。鉴定的引物序列如下：
[0250]
转空载体大豆发状根dna水平鉴定的引物对：
[0251]
f：5'-atggtgagcaagggcgaggag-3'；
[0252]
r：5'-tcaaagatctaccatgtacagctcgt-3'；
[0253]
预期条带为700bp。
[0254]
转gmntf2b-1大豆发状根dna水平鉴定的引物对：
[0255]
f：5
’-
caaacgaaatgaaagttggtagcaaaagga-3；
[0256]
r：5
’-
ctctcttctctattctctcccacttctctc-3’；
[0257]
预期条带为751bp。
[0258]
部分样本的鉴定结果见图6a。结果表明：阴性对照(williams82)中没有检测到700bp和751bp的目的条带，在5个转空载体大豆发状根中均检测到700bp的目的条带，在7个转gmntf2b-1大豆发状根中均检测到751bp的目的条带；故分别选取3个转空载体发状根株系(#1、#2、#3)和3个转gmntf2b-1大豆发状根株系(#1、#2、#3)用于下述实验分析。
[0259]
3、转基因大豆发状根中目的基因gmntf2b-1的表达量检测
[0260]
在cdna水平上检测步骤1获得的转gmntf2b-1大豆发状根和转空载体大豆发状根中目的基因gmntf2b-1的相对表达量。以cyp2基因为内参基因。引物序列如下：
[0261]
内参cyp2基因引物对：
[0262]
f：5'-accagaattgcattaccagttga-3'；
[0263]
r：5'-ggtgccgagactcatgaagatat-3'；
[0264]
目的基因引物对：
[0265]
f：5
’-
gtggagcactactacagcac-3’；
[0266]
r：5
’-
ggtggagattgagtggtggc-3’。
[0267]
结果见图4g。结果表明：与转空载体大豆发状根中gmntf2b-1的表达量相比，转gmntf2b-1大豆发状根中gmntf2b-1的表达量升高了14倍。
[0268]
三、转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的耐旱性鉴定
[0269]
为评价转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆的耐旱效果。将步骤二获得的转gmntf2b-1大豆发状根和转空载体大豆发状根(各100个)进行耐旱性鉴定。设置三次重复实验，结果取平均值。具体步骤如下：将只含有转基因大豆发状根系的植株移栽至营养土中，正常生长10天后，分别进行干旱控水处理，处理5-6天后，分别得到转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆，观察转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆表型、拍照并对部分根系参数(存活率、根表面积和根干重参数)统计分析。
[0270]
1、干旱处理过程中土壤含水量及水势的测定
[0271]
在干旱处理过程中，每天同一时间分别选取土壤中3个相同位置分别测定3次。土壤含水量及水势的测定分别用专业仪器测定，专业仪器名称及货号与厂家如下：
[0272]
产品名称：土壤水分检测仪jc-ts；订货号：tr-0011；型号：jc-ts；厂家：青岛聚创环保集团有限公司；
[0273]
产品名称：土壤水势测定仪jc-tss-2；订货号：tr-0014；型号：jc-tss-2；厂家：青岛聚创环保集团有限公司。
[0274]
结果见图6b。结果表明：土壤含水量从控水开始前的46％下降到最后的4％，土壤水势从控水开始前的-0.02mpa下降到最后的-6.54mpa。说明干旱处理条件符合实际实验要求。
[0275]
2、干旱处理后表型
[0276]
干旱处理后表型观察结果见图4a、图4b和图4c。结果表明：转空载体大豆对干旱处理表现更敏感，叶片最早出现萎蔫、干枯，发状根生长缓慢，长势明显弱于转gmntf2b-1大豆；转gmntf2b-1大豆对干旱处理表现出一定的耐性。
[0277]
3、干旱处理后存活率、根表面积和根干重参数
[0278]
存活率、根表面积和根干重参数的检测结果见图4d、图4e和图4f。结果表明：在干旱处理条件下，转空载体大豆、转gmntf2b-1大豆的平均存活率分别是20％和80％，相对应的平均根表面积分别是31.21cm2和69.56cm2，平均根干重分别是0.27g和0.34g。说明过表达gmntf2b-1可提高大豆耐旱性。
[0279]
实施例5、gmntf2b-1蛋白通过降低叶片中的过氧化氢含量提高大豆耐旱性
[0280]
供试材料：实施例4中干旱处理后的转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆。
[0281]
一、叶片dab染色
[0282]
参照商品化试剂盒(dab染液试剂盒)提供的方法，用二氨基联苯胺(dab)对h2o2的产生进行定位。在干旱处理六天后，分别将转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆同一植株的相同部位的叶片剪下，剪口浸入到含1mg/ml dab的水溶液(ph＝3.8)中，反应8h以使dab被吸收并与叶片内的h2o2和过氧化物酶进行反应。之后，将叶片剪成3cm左右的叶段并在95％的乙醇溶液中煮沸10min进行固定和脱色，待叶绿素完全褪去后将叶片置于饱和水合氯醛中透明，透明后的叶片可放在50％的甘油中以备显微观察。
[0283]
结果见图4h和图4j。结果表明：干旱处理后，转空载体大豆的叶片染色程度明显比转gmntf2b-1大豆的染色程度要深。染色越深，叶片中的过氧化氢含量越高，植株越不抗旱，说明gmntf2b-1通过降低植株内过氧化氢含量，来提高大豆的抗旱性。
[0284]
二、叶片nbt染色
[0285]
参照商品化试剂盒(nbt染液试剂盒)提供的方法，采用氮蓝四唑(nbt)组织染色法检测超氧阴离子自由基o
2-的产生。在干旱处理六天后，分别将转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆同一植株的相同部位的叶片剪下，再将叶片放入含有0.1％nbt(w/v)的10mm磷酸缓冲液(ph＝7.8)中真空渗透20min，之后将叶片置于95％的乙醇溶液中煮沸10min进行固定和脱色，待叶绿素完全褪去后将叶片置于饱和水合氯醛中透明，透明后的叶片可放在50％的甘油中以备显微观察。
[0286]
结果见图4i和图4k。结果表明：干旱处理后，转空载体大豆的叶片染色程度明显比转gmntf2b-1大豆的染色程度要深。染色越深，叶片中的o
2-含量越高，植株越不抗旱，说明gmntf2b-1通过降低植株内o
2-含量，来提高大豆的抗旱性。
[0287]
三、叶片过氧化氢含量测定
[0288]
参照商品化试剂盒(过氧化氢含量测定试剂盒)提供的方法，按如下步骤实施：
[0289]
1、组织样品的制备
[0290]
按照组织质量(g)：试剂一体积(ml)为(1:5)-10的比例进行冰浴匀浆，本实验取干旱处理后的大豆叶片0.1g，加入1ml试剂一；转移至ep管中，用试剂一定容至1ml，8000g在4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
[0291]
2、在ep管中按顺序加入下列试剂：
[0292]
表10、h2o2含量测定操作表
[0293][0294]
加入试剂四溶解沉淀后，室温静置5min，倒入比色皿中，测定415nm处吸光值a。对照管只要做一次即可。计算δa＝a测定-a对照。
[0295]
注：试剂一易挥发，试剂一必须先预冷再加，研磨时必须在冰上研磨。
[0296]
结果见图4l。结果表明：转空载体大豆叶片中的过氧化氢含量为1.18μmol/g
·
fw，
转gmntf2b-1大豆中的过氧化氢含量为0.68μmol/g
·
fw，转空载体大豆叶片中的过氧化氢含量明显比转gmntf2b-1大豆的含量高。说明gmntf2b-1通过降低植株内过氧化氢含量，来提高大豆的抗旱性。
[0297]
四、叶片受损伤面积比例的测定
[0298]
叶片受损伤面积比例的换算需要用图形分析软件imagej(软件官网https://imagej.nih.gov/ij/)的灰度分析功能来完成。具体步骤如下：
[0299]
1、打开image j软件后，点击软件上方的file，下拉点击open，将扫描图片拉入进入软件中。接着点击软件上方的image，下拉第一个是type，点击，将其改为8-bit。
[0300]
2、点击analyze，下拉点击set measurement，点击图中所勾的四个选项。然后点击ok确定。然后点击process，下拉点击substract background，只勾图中light background一个选项，点击ok即可。
[0301]
3、完成步骤2后，点击analyze，下拉出现set scale，点击它，弹出一个小框，把unit of length那个空白框内的英语改为pixels，点击ok即可。
[0302]
4、完成步骤3后，点击file下方一些列不规则圆圈，选择心型圆圈，点击出现freehand selections。然后点击edit，下拉出现invert，点击即可。
[0303]
5、完成步骤4后，进行灰度统计。用鼠标选择图中亮色区域，尽可能的把亮色区域全部圈起来。然后点击anlyze下拉出现的measurement，即可弹出你选定区域的灰度统计值，记为a1；按同样的操作计算整个区域的灰度值，记为a2。按照如下公式计算叶片受损伤面积比例：叶片受损伤面积比例＝a1/a2
×
100％。
[0304]
结果见图4m。结果表明：转空载体大豆叶片的叶片受损伤面积比例为32.1％，转gmntf2b-1大豆的叶片受损伤面积比例为10.8％，转空载体大豆的叶片受损伤面积比例明显高于转gmntf2b-1大豆。
[0305]
实施例6、gmntf2b-1蛋白通过降低根系中的过氧化氢含量和相对电导率提高大豆耐旱性
[0306]
供试材料：实施例4中干旱处理后的转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆。
[0307]
一、根系dab染色
[0308]
实验方法同实施例5中的叶片dab染色方法。
[0309]
结果见图5a和图5b。结果表明：干旱处理前两者没有明显差异。干旱处理后，转空载体大豆发状根系的染色程度明显比转gmntf2b-1大豆发状根系的染色程度要深。染色越深，叶片中的过氧化氢含量越高，植株越不抗旱，进一步证实gmntf2b-1通过降低植株内过氧化氢含量，来提高大豆的抗旱性。
[0310]
二、根系过氧化氢含量测定
[0311]
实验方法同实施例5中的叶片过氧化氢含量测定。
[0312]
结果见图5c。结果表明：干旱处理前，转gmntf2b-1大豆和转空载体大豆根部的过氧化氢含量相差不大，都是大约0.45μmol/g
·
fw左右，转gmntf2b-1大豆根部过氧化氢含量略低。干旱处理后，二者的过氧化氢含量明显升高，但是转gmntf2b-1大豆根部过氧化氢含量(1.48μmol/g
·
fw)显著低于转空载体大豆(2.02μmol/g
·
fw)。进一步证实gmntf2b-1通过降低植株内过氧化氢含量，来提高大豆的抗旱性。
[0313]
三、根系相对电导率的测定
gmntf2b-1promoter大豆发状根，将其置于ms0液体培养基(购自北京梦怡美)和加了20％peg的ms0液体培养基中，分别模拟正常生长条件和干旱生长条件。处理6小时后，再分别进行gus染色。
[0335]
四、gus染色
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1、取材
[0337]
将根剪下，置于10ml离心管中。
[0338]
2、染色
[0339]
将试剂盒(gus染色试剂盒：产品名称：gus染色试剂盒；商品货号：rtu4032；商品厂家：中科瑞泰(北京)生物科技有限公司。)中的gus染色液添加至完全覆盖材料，锡箔纸包好后摇晃10分钟乃至更长时间直至出现蓝色，保险起见，染30分钟以上。
[0340]
3、脱色
[0341]
将染色液置换成无水乙醇，摇晃30分钟以上，重复2-3次。
[0342]
4、观察
[0343]
体式显微镜(品牌：卡尔
·
蔡司；型号：stemi 508；中国农业科学院作物科学研究所重大工程楼)下观察。
[0344]
结果见图7a-图7d。结果表明：正常生长条件下，二者没有明显差异。干旱处理后，转pcambia1305大豆发状根根系的染色程度明显比转pcambia1305-gmntf2b-1promoter大豆发状根根系的染色程度要深。干旱条件下，这种染色差异进一步加剧。
[0345]
五、实时荧光定量pcr分析gus的表达特性
[0346]
方法同实施例1。引物序列如下：
[0347]
gus基因：f：5
’-
gctatacgcctttgaagcc-3’；
[0348]
r：5
’-
ttgactggcctcttcgctgta-3’；
[0349]
内参基因：f：5
’-
ttacccgatgggcaagtc-3’；
[0350]
r：5
’-
gctcatacggtcagcgatac-3’。
[0351]
结果见图7e。结果表明：正常生长条件下，转pcambia1305大豆发状根中的gus相对表达量稍低于转pcambia1305-gmntf2b-1promoter大豆发状根发状根。干旱条件下，这种表达差异显著扩大，转pcambia1305大豆发状根中的gus相对表达量明显低于转pcambia1305-gmntf2b-1promoter大豆发状根。说明基因gmntf2b-1是受干旱诱导表达。
[0352]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。