扩增和检测核酸的方法及试剂盒与流程

本发明涉及生物
技术领域：
：，具体涉及一种改进的变性泡介导的靶标核酸扩增方法及其专用试剂盒与应用。1.
背景技术：
：：核酸可分为脱氧核糖核酸(dna)和核糖核酸(rna)，是所有生命形式的基本要素。dna携带遗传信息并负责编码蛋白质的基本单元氨基酸。rna在基因的编码、解码、调节和表达中起到重要的作用。因此，核酸已作为重要的生物标志物应用于生物研究和医学诊断。核酸扩增技术为病原微生物的检测、生物材料的追溯与鉴真(如肉类)，以及其他基因检测提供了重要的理论基础。建立一种简单、易于操作和灵敏快速的核酸检测方法是生物检测领域中的主要目标。自从聚合酶链式扩增反应(polymerasechainreaction，pcr)发明以来，不断提高该技术的检测效率和灵敏度是科研工作者一直以来研究的重点。但是，聚合酶动力学和热循环仪的升降温速率的限制使pcr扩增反应需一小时或更长的时间才可以完成。因此改善这两个关键因素(酶体系和仪器性能)是缩短扩增时间的关键。随着酶体系和商用快速升降温仪器的改进，pcr扩增时间已从早期的4小时减少到目前的约1小时。然而，目前还没有可进一步缩短反应时间的商业化仪器。目前市售的热循环仪器主要通过典型的25-50μl反应体系进行能量传递，这也是限制能量传递速率、难以减少固有反应时间的主要原因。因此，一些研究人员开始使用红外灯、液滴红外激光、微波、液滴微波场等快速地在液体样品进行能量传递与加热。但是，这些非接触式加热方式在灵敏度、准确度方面仍有不足，从而限制了其在研究中的应用。另一方面，研究人员利用微流控技术来减少反应腔室体积，通过减少将能量转移到样品中和从样品中转移出的时间来提高反应速率。例如，小体积pcr的新平台——液滴pcr等可以实现快速pcr扩增，但是仍存在通量小、工艺复杂等问题。尽管进行了各种尝试，但是基于快速pcr扩增的方法(例如快速循环pcr和极速pcr)仍然受到定制化热循环设备的开发和商业化的限制。目前尚没有关于是否通过优化当前的等温核酸扩增技术解决上述问题的报道。在这种情况下，一系列等温核酸扩增技术，如环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)、依赖解旋酶的核酸等温扩增技术(helicase-dependentisothermaldeoxyribonucleicacid，hda)、基于变性泡介导的链置换扩增技术(strandexchangeamplification，sea)等技术相继开发以替代pcr。lamp技术因为灵敏度高、特异性强而被大家熟知，但是该技术易发生样品污染，且引物设计困难，无法实现高突变物种靶标的检测。而hda技术的反应体系中需要两个酶，双酶体系容易引起非特异性扩增，影响实验结果的判断。这些缺点在一定程度上限制了这些技术的推广应用。基于变性泡介导的链置换扩增技术(denaturationbubble-mediatedstrandexchangeamplification，sea)是一种基于dna呼吸作用引起的变性泡介导的核酸等温扩增技术，反应仅需一种酶和一对引物即可完成。引物通过侵入dna呼吸作用产生的变性泡部分，在聚合酶的作用下延伸并置换下原有的互补链从而进行指数扩增。专利cn109136337a中描述了sea技术能够扩增和检测1.0×10-14m核酸。基于上述已有研究，目前仍然需要建立适用于传统实验室的高通量和稳定的核酸扩增技术。本发明解决了该技术需求。2.技术实现要素：sea是一种核酸等温扩增方法，其原理是dna呼吸作用会使双链dna(dsdna)中自发形成变性泡，然后一对引物侵入变性泡与其中一条dna链结合，并在聚合酶的作用下延伸、替换原始的互补链以产生扩增产物。因此，该方法无需依赖热循环仪，可以在恒温(简单的水浴锅或金属浴)下直接利用模板dna自发形成的变性泡引发恒温pcr反应(shietal.“triggeredisothermalpcrbydenaturationbubble-mediatedstrandexchangeamplification”ꢀchemcommun(camb)(2016)4；52(77):11551-4)。本发明公开了改进sea技术过程中的重大发现，通过快速变化反应温度，即使很小范围的温度变化也能显著提高扩增反应的效率和速率。因此，本技术中称之为“快速sea”。因此，本公开一方面提供一种新的用于扩增和检测样品中的靶标核酸的方法。在一些实施例中，该方法的扩增混合物中包含聚合酶、一对引物和样品；在反应过程中，引物与靶标核酸进行特异性分子杂交；然后扩增混合物在第一温度和第二温度之间进行多个热循环，从而通过快速sea扩增靶标核酸分子的序列；并且其中第一温度和第二温度之间的差小于约30℃。在一些实施例中，该方法的扩增混合物中包含聚合酶、一对引物和样品；在反应过程中，引物与靶标核酸进行特异性分子杂交；然后扩增混合物在第一温度和第二温度之间进行多个热循环，从而通过快速sea扩增靶标核酸分子的序列；并且其中第一温度和第二温度之间的差小于约25℃。在一些实施例中，该方法的扩增混合物中包含聚合酶、一对引物和样品；在反应过程中，引物与靶标核酸进行特异性分子杂交；然后扩增混合物在第一温度和第二温度之间进行多个热循环，从而通过快速sea扩增靶标核酸分子的序列；并且其中第一温度和第二温度之间的差小于约20℃。在一些实施例中，本方法还包括检测扩增产物的序列。在一些实施例中，本方法还包括基于检测进行诊断。在特定实施例中，第一温度与第二温度之间的差为大约10-15℃。在更具体的实施例中，第一和第二温度之间的差为约10℃，约11℃，约12℃，约13℃，约14℃或约15℃。在一些实施例中，聚合酶具有用于在pcr期间催化引物延伸的最佳温度。在特定实施例中，最佳温度在第一温度±6℃的范围内。在特定实施例中，最佳温度在第二温度±6℃的范围内。在特定实施例中，最佳温度在第一温度和第二温度之间。在一些实施例中，通过本方法扩增的靶标核酸分子的序列具有第一熔解温度，并且其中第一温度在第一熔解温度的±5℃的范围内。在一些实施例中，一对寡核苷酸引物具有平均熔解温度，并且其中第二温度在平均熔解温度的±5℃的范围内。在一些实施例中，平均熔解温度在聚合酶最适温度的±5℃之内。在一些实施例中，一对寡核苷酸引物中的一条引物具有第二熔解温度，而一对寡核苷酸引物中的另一条引物具有第三熔解温度，其中第二和第三解熔解度之间的差小于约3℃。在一些实施例中，基于靶标核酸分子的序列，使用计算机算法确定第一熔解温度。另外或可替代地，在一些实施例中，基于寡核苷酸引物的序列使用计算机算法确定第二熔解温度。另外地或可替代地，在一些实施例中，基于寡核苷酸引物的序列使用计算机算法确定第三熔解温度。在一些实施例中，计算机算法选自nupack，dnamelt，novopro，blast，primerpremier，alignminer，oligo，perlprimer，primer3web和dnastar。在一些实施例中，本方法还包括确定第一，第二和/或第三熔解温度。在一些实施例中，聚合酶是耐热的聚合酶。在一些实施例中，聚合酶具有链置换活性。在一些实施例中，聚合酶具有逆转录酶活性。在一些实施例中，聚合酶是bstdna聚合酶或其异构酶，或具有至少80％序列同一性的功能性衍生物。在特定的实施例中，聚合酶是bstdna聚合酶大片段或其异构酶，或具有至少80％序列同一性的功能性突变体。在特定的实施例中，聚合酶是全长的bstdna聚合酶，bstdna聚合酶大片段，bst2.0dna聚合酶，bst2.0warmstartdna聚合酶或bst3.0dna聚合酶。在特定的实施例中，当聚合酶是本段中描述的任何聚合酶时，第一温度在约68-78℃的范围内，第二温度在约55-69℃的范围内。在一些实施例中，聚合酶是dna聚合酶i或其异构酶，或具有至少80％序列一致的功能性突变体。在一些实施例中，聚合酶是dna聚合酶i大片段(klenow)，或其异构酶，或具有至少80％序列同一性的功能性突变体。在特定的实施例中，聚合酶是野生型dna聚合酶i，dna聚合酶i大片段(klenow)或klenowexo-。在特定的实施例中，当聚合酶是本段中描述的任何聚合酶时，第一温度在约50-60℃的范围内，第二温度在约30-40℃的范围内。在一些实施例中，聚合酶是ventdna聚合酶或其异构酶，或具有至少80％序列一致的功能性突变体。在特定的实施例中，聚合酶是ventdna聚合酶，vent(exo-)dna聚合酶，deepventdna聚合酶或deepvent(exo-)dna聚合酶。在特定的实施例中，当聚合酶是该段中描述的任何聚合酶时，第一温度在约70-80℃的范围内，第二温度在约55-70℃的范围内。在一些实施例中，聚合酶是phi29dna聚合酶或其异构酶，或具有至少80％序列一致的功能性突变体。在特定的实施例中，当聚合酶是该段中描述的任何聚合酶时，第一温度选自约40-55℃的范围，第二温度选自约20-ꢀ37℃的范围。在一些实施例中，聚合酶是taqdna聚合酶或其异构酶，或具有至少80％序列同一性的功能突变体。在特定的实施例中，聚合酶是taqdna聚合酶，热启动taqdna聚合酶，epimark热启动taqdna聚合酶，onetaqdna聚合酶，onetaq热启动dna聚合酶，longamptaqdna聚合酶或longtaqdna聚合酶。在特定的实施例中，当聚合酶是本段中描述的任何聚合酶时，第一温度在约70-88℃的范围内，并且第二温度在约58-70℃的范围内。在一些实施例中，扩增的序列的长度和至少一种引物的长度在约30-60％的范围内。在特定的实施例中，扩增的序列长约20-50个碱基对(bp)。在特定的实施例中，引物长约15至约25个核苷酸(nt)。在一些实施例中，至少一种引物的熔解温度(tm值)在聚合酶最佳温度±5℃以内。在一些实施例中，引物的tm值之间的差小于1℃。在一些实施例中，至少一种引物的g/c含量为约40％至约60％。在一些实施例中，引物间的g/c含量百分比的差值小于20％。在一些实施例中，每个引物包括一个所述聚合酶在pcr期间可以添加核苷酸的延伸末端，并且其中引物在延伸末端具有g或c。在一些实施例中，每个引物包括一个所述聚合酶在pcr期间可以添加核苷酸的延伸末端，并且其中引物在包括延伸末端的连续的5-核苷酸区域中具有至少40％的g/c含量。在一些实施例中，每个热循环包括在第一温度下将扩增混合物孵育少于2s，并且在第二温度下将扩增混合物孵育少于2s。在一些实施例中，每个热循环还包括小于10秒的升降温时间。在一些实施例中，每个热循环包括在第一温度下将扩增混合物孵育约1s，并且在第二温度下将扩增混合物孵育约1s，并且其中变温时间小于2s。在一些实施例中，该方法在少于10分钟内完成至少35个热循环，或在少于8分钟内完成至少40个热循环。在一些实施例中，扩增混合物还包含dutps。在一些实施例中，扩增混合物不包含dttps。在一些实施例中，扩增混合物还包含尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)。在一些实施例中，扩增混合物还包含单链结合蛋白(ssb)。在一些实施例中，扩增混合物还包含聚乙二醇。在一些实施例中，扩增混合物包含不超过1.0×10-12m的靶标核酸。在一些实施例中，扩增混合物包含少于10个拷贝的靶标核酸。在一些实施例中，扩增混合物包含浓度不小于0.1u/μl的聚合酶。在一些实施例中，扩增混合物包含浓度不小于1.0×10-6m的至少一种引物。在一些实施例中，扩增混合物包含至少0.5％体积分数的聚乙二醇。在一些实施例中，扩增混合物包含浓度为至少1μg/ml的ssb。在一些实施例中，扩增混合物的体积为约1-30μl。在一些实施例中，通过将扩增混合物加入到微流控装置中以至少10℃/s的升降温速率进行所述热循环步骤。在一些实施例中，靶标核酸是双链核酸分子或单链核酸分子。在一些实施例中，靶标核酸是dna或rna。本公开另一方面还提供了用于检测样品中的靶标核酸分子的相关方法。在一些实施例中，该方法的扩增混合物中包括一种聚合酶、一对引物与核酸样品；在反应过程中，引物与靶标核酸进行特异性分子杂交；然后扩增混合物在第一温度和第二温度之间进行多个热循环，从而通过快速sea扩增靶标核酸分子的序列，以检测扩增混合物中的扩增产物；并且其中第一和第二温度之间的差小于约30℃。在一些实施例中，该方法的扩增混合物中包括一种聚合酶、一对引物与核酸样品；在反应过程中，引物与靶标核酸进行特异性分子杂交；然后扩增混合物在第一温度和第二温度之间进行多个热循环，从而通过快速sea扩增靶标核酸分子的序列，以检测扩增混合物中的扩增产物；并且其中第一和第二温度之间的差小于约25℃。在一些实施例中，该方法的扩增混合物中包括一种聚合酶、一对引物与核酸样品；在反应过程中，引物与靶标核酸进行特异性分子杂交；然后扩增混合物在第一温度和第二温度之间进行多个热循环，从而通过快速sea扩增靶标核酸分子的序列，以检测扩增混合物中的扩增产物；并且其中第一和第二温度之间的差小于约20℃。在特定的实施例中，每1、2、5或10个热循环进行一次检测。在特定实施例中，通过检测反应过程中扩增产物的荧光信号以检测产物产量变化。本公开另一方面还提供了用于诊断受试者中的病原体感染的相关方法。在一些实施例中，该方法包括提供包含从受试者收集的含核酸的样品，与聚合酶和一对寡核苷酸引物接触，从而形成扩增混合物；其中所述引物与感染病原体核酸进行特异性杂交；使扩增混合物在第一温度和第二温度之间进行多个热循环，从而通过聚合酶链式反应(pcr)扩增病原体序列，以检测扩增混合物中扩增产物的存在与否；其中第一和第二温度之差小于约30℃。在一些实施例中，该方法包括提供包含从受试者收集的含核酸的样品，与聚合酶和一对寡核苷酸引物接触，从而形成扩增混合物；其中所述引物与感染病原体核酸进行特异性杂交；使扩增混合物在第一温度和第二温度之间进行多个热循环，从而通过聚合酶链式反应(pcr)扩增病原体序列，以检测扩增混合物中扩增产物的存在与否；其中第一和第二温度之差小于约25℃。在一些实施例中，该方法包括提供包含从受试者收集的含核酸的样品，与聚合酶和一对寡核苷酸引物接触，从而形成扩增混合物；其中所述引物与感染病原体核酸进行特异性杂交；使扩增混合物在第一温度和第二温度之间进行多个热循环，从而通过聚合酶链式反应(pcr)扩增病原体序列，以检测扩增混合物中扩增产物的存在与否；其中第一和第二温度之差小于约20℃。在特定的实施例中，样品包含来自受试者的基因组核酸或来自受试者的游离核酸。在特定的实施例中，样品是体液样品。在特定的实施例中，病原体是病毒，细菌，真菌或寄生虫。本公开另一方面还提供了用于检测受试者的遗传改变的相关方法。在一些实施例中，该方法包括提供从受试者收集的含核酸样品，与聚合酶和一对寡核苷酸引物接触，从而形成扩增混合物；其中所述引物经设计为可以扩增疑似含有基因改变的受试者基因组的靶标序列；使扩增混合物经温度在第一温度和第二温度之间的多个热循环处理，从而通过聚合酶链式反应(pcr)扩增靶标序列；其中第一和第二温度之差小于约30℃。对扩增的序列进行测序，以确定是否存在遗传改变。在特定的实施例中，遗传改变是由于核苷酸替代，缺失，插入或拷贝数变异导致的基因突变。在一些实施例中，该方法包括提供从受试者收集的含核酸样品，与聚合酶和一对寡核苷酸引物接触，从而形成扩增混合物；其中所述引物经设计为可以扩增疑似含有基因改变的受试者基因组的靶标序列；使扩增混合物经温度在第一温度和第二温度之间的多个热循环处理，从而通过聚合酶链式反应(pcr)扩增靶标序列；其中第一和第二温度之差小于约25℃。对扩增的序列进行测序，以确定是否存在遗传改变。在特定的实施例中，遗传改变是由于核苷酸替代，缺失，插入或拷贝数变异导致的基因突变。在一些实施例中，该方法包括提供从受试者收集的含核酸样品，与聚合酶和一对寡核苷酸引物接触，从而形成扩增混合物；其中所述引物经设计为可以扩增疑似含有基因改变的受试者基因组的靶标序列；使扩增混合物经温度在第一温度和第二温度之间的多个热循环处理，从而通过聚合酶链式反应(pcr)扩增靶标序列；其中第一和第二温度之差小于约20℃。对扩增的序列进行测序，以确定是否存在遗传改变。在特定的实施例中，遗传改变是由于核苷酸替代，缺失，插入或拷贝数变异导致的基因突变。在特定的实施例中，遗传改变是单核苷酸多态性。在一些实施例中，该方法进一步包括与遗传改变有关的遗传状况的诊断或预后。本公开另一方面还提供了用于执行本方法的试剂盒。在一些实施例中，提供了用于扩增靶标核酸分子的试剂盒。在一些实施例中，试剂盒包含多个组分，所述多个组分包含耐热聚合酶和一对寡核苷酸引物，其中所述一对引物设计为可以通过聚合酶链式反应(pcr)扩增约20-50个碱基对(bp)的靶标核酸。其中耐热聚合酶具有链置换活性。在试剂盒的一些实施例中，至少一种引物的熔解温度在耐热聚合酶的最佳温度±5℃以内。在一些实施例中，至少一种引物的g/c含量为约40％ꢀ-60％。在一些实施例中，引物间的g/c含量百分比的差值小于20％。在一些实施例中，每个引物包括一个所述聚合酶在pcr期间可以添加核苷酸的延伸末端，并且其中至少一个引物在延伸末端的连续5-核苷酸区域具有至少40％的g/c含量。在一些实施例中，每个引物包括一个所述聚合酶在pcr期间可以添加核苷酸的延伸末端，并且其中至少一个引物在延伸末端具有g或c。在一些实施例中，至少一个引物长度约15-25个核苷酸。在试剂盒的一些实施例中，聚合酶是bstdna聚合酶或其异构酶，或具有至少80％序列dna聚合酶大片段，bst2.0dna聚合酶，bst2.0warmstartdna聚合酶或bst3.0dna聚合酶，其中每个热循环包括选自约72-76℃的温度范围内的第一温度下孵育约1s，并且选自约61-65℃的第二温度下进行的孵育约1s，总变温时间小于2s，总反应时间小于8分钟。在特定的实施例中，聚合酶是野生型dna聚合酶i，dna聚合酶i大片段(klenow)或klenowexo-，并且其中第一个温度在约30-40℃的范围内，第二温度范围约为50-60℃。在特定的实施例中，聚合酶是ventdna聚合酶，vent(exo-)dna聚合酶，deepventdna聚合酶或deepvent(exo-)dna聚合酶，并且其中第一温度在约70-80℃的范围内，并且第二温度在约55-70℃的范围内。在特定的实施例中，聚合酶是phi29dna聚合酶，并且其中第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度选自约20-37℃的范围。在特定的实施例中，聚合酶是taqdna聚合酶，热启动taqdna聚合酶，epimark热启动taqdna聚合酶，onetaqdna聚合酶，onetaq热启动dna聚合酶，longamptaqdna聚合酶或longtaqdna聚合酶，其中第一温度选自约70-88℃的范围，第二温度选自约58-70℃的范围。在一些实施例中，每个热循环还包括小于10s的升降温时间。在一些实施例中，热循环的数目小于40个循环，并且热循环还包括小于10分钟的总反应时间。在一些实施例中，扩增区域具有第一熔解温度，并且其中第一温度在第一熔解温度的±5℃的范围内。在一些实施例中，试剂盒中的一对引物具有平均熔解温度，并且其中第二温度在平均熔解温度的±5℃的范围内。在一些实施例中，一对寡核苷酸引物中的一条引物具有第二熔解温度，而一对寡核苷酸引物中的另一条引物具有第三熔解温度，其中第二和第三熔解温度之间的差小于约3℃。3.附图说明图1是变性泡介导的双链核酸(例如dna)链置换扩增反应的原理示意图。图2是在76℃和62℃的快速热循环下，扩增单增李斯特菌16srrna编码基因高变区靶标序列的实时扩增曲线图。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。其中不同的符号表示不同的引物浓度。图3是在76℃和62℃的快速热循环下，扩增单增李斯特菌16srrna编码基因高变区的靶标序列的实时扩增曲线图。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。其中不同的符号代表不同的酶浓度。图4是在74℃到78℃之间的高温温度和62℃低温温度的快速热循环下，扩增单增李斯特菌的16srrna编码基因高变区靶标序列的实时扩增曲线图。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。其中不同的符号代表分别不同的温度。图5是在76℃和62℃的快速热循环下，人工合成的dna片段的实时扩增曲线图。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。其中不同的符号代表不同的靶标浓度。图6a是在76℃和62℃的快速热循环下，人工合成的rna片段的实时扩增曲线图。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。其中不同的符号代表不同的靶标浓度。图6b是聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)图像，结果显示了实施例2中所述的快速sea反应产生的扩增产物。泳道m为梯度分子量dna标记(dnaladder)，并且标记了20bp和40bpdna的条带位置，其余泳道显示三个重复对照反应产生的特定43bp扩增产物，重复反应的初始靶标浓度为1.0×10-12m，并且在阴性对照中没有出现特异性扩增产物。小于20bp的条带源于剩余的引物分子。图7a是在76℃和62℃的快速热循环下，扩增单增李斯特菌的16srrna编码基因高变区的实时扩增曲线图。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。其中不同的符号代表不同的初始靶标浓度。图7b是聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)图像，结果显示了实施例3中所述的快速sea反应产生的43bp的扩增产物。泳道m为梯度分子量dna标记(dnaladder)，并且标记了20bp和40bpdna的条带位置，其余泳道显示不同初始浓度的靶标扩增后产生的43bp特异性扩增产物，并且在阴性对照中没有出现特异性扩增产物。图7c是在62℃恒定温度下，扩增单增李斯特菌的16srrna编码基因高变区靶标基因的实时扩增曲线图。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。其中不同的符号代表不同的初始靶标浓度。图8是在76℃和61℃的快速热循环下，金黄色葡萄球菌16srrna编码基因中50bp片段的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。其中不同的符号代表不同的靶标浓度。图9列出了生产商对几种bstdna聚合酶的描述和建议，其可以在具体实施例方案中与本发明的方法和试剂盒结合使用。图10a-e是在一系列恒定的反应温度(57℃，59℃，61℃，63℃和65℃)下以纯化的肺炎支原体16srrna编码基因片段为模板，使用五对不同引物(mp1-mp5)进行sea反应的实时扩增曲线。具体而言，图10a是在五个不同反应温度下使用引物对mp1(tm值约65℃)的扩增曲线。具体而言，图10b是在五个不同反应温度下使用引物对mp2(tm值约63℃)的扩增曲线。具体而言，图10c是在五个不同反应温度下使用引物对mp3(tm值约61℃)的扩增曲线。具体而言，图10d是在五个不同反应温度下使用引物对mp4(tm值约59℃)的扩增曲线。具体而言，图10e是在五个不同反应温度下使用引物对mp5(tm值约57℃)的扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。上述图中还显示了阴性对照(ntc)结果。图10f是在所示的五个不同反应温度下，使用提取的肺炎支原体基因组作为模板和mp3作为反应引物的情况下，进行sea反应的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。上述图中还显示了阴性对照(ntc)结果。图11a是使用三对特异性引物对(ct1-ct3)，以沙眼衣原体16srrna编码基因片段为模板，进行sea反应的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。上述图中还显示了阴性对照(ntc)结果。图11b是使用三对特异性引物对(sd1-sd3)，以家猪18srrna编码基因片段为模板，进行sea反应的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。上述图中还显示了阴性对照(ntc)结果。图12a是使用不同特异性引物对(mp3，mp6和mp7)，以肺炎支原体16srrna编码基因片段为模板，进行sea反应的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。上述图中还显示了阴性对照(ntc)结果。图12b是使用不同特异性引物对(ct1,ct4和ct5)，以沙眼衣原体16srrna编码基因片段为模板，进行sea反应的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。上述图中还显示了阴性对照(ntc)结果。图13a是使用不同特异性引物对(ct1,ct2和ct6)，以沙眼衣原体16srrna编码基因片段为模板，进行sea反应的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。上述图中还显示了阴性对照(ntc)结果。图13b是使用不同特异性引物对(bc1-bc3)，以蜡样芽胞杆菌16srrna编码基因片段为模板，进行sea反应的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。上述图中还显示了阴性对照(ntc)结果。图14是使用两对特异性引物对(sa1和sa2)，以金黄色葡萄球菌16srrna编码基因片段为模板，进行sea反应的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。上述图中还显示了阴性对照(ntc)结果。图15是使用微流控装置的加速sea反应的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。不同的符号代表不同的靶标分子浓度。图16展示了使用dutps或dttps的加速sea反应的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。实验还包括阴性对照组(ntc)。图17是udg酶消化含尿嘧啶的扩增产物的电泳凝胶图像。图18是在有或没有udg酶的条件下使用的dutps进行快速sea反应的实时扩增曲线。x轴代表扩增时间，以分钟(min)为单位，指示扩增反应经过的热循环数，y轴代表荧光信号强度，以相对荧光单位(rfu)为单位，指示反应的扩增量。图19显示了在76℃至61℃之间的快速热循环下合成的靶标dna片段的实时扩增曲线。x轴显示以分钟(min)为单位的扩增时间，y轴显示以相对荧光单位(rfu)表示的荧光信号强度，指示反应产生的扩增产物的量。图20显示了在76℃至61℃之间的快速热循环下人β-肌动蛋白基因中靶标序列的实时扩增曲线。x轴显示以分钟(min)为单位的扩增时间，y轴显示以相对荧光单位(rfu)表示的荧光信号强度，指示反应产生的扩增产物的量。图21显示了在76℃至55℃之间的快速热循环下合成的靶标dna片段的实时扩增曲线。x轴显示以分钟(min)为单位的扩增时间，y轴显示以相对荧光单位(rfu)表示的荧光信号强度，指示反应产生的扩增产物的量。如图所示，不同的符号代表不同的靶标浓度。图22显示了在60℃至34℃之间的快速热循环下合成的靶标小rna片段的实时扩增曲线。x轴显示以分钟(min)为单位的扩增时间，y轴显示以相对荧光单位(rfu)表示的荧光信号强度，指示反应产生的扩增产物的量。如图所示，不同的符号代表不同的靶标浓度。4.详细说明本说明书提供了用于扩增和检测样品中的靶标核酸的方法。本公开说明书一方面提供了一种靶标核酸扩增的技术方案。该方法包括将一种耐热聚合酶和一对寡核苷酸引物与样本直接接触，形成一种扩增混合液。该扩增混合液在68-78℃的第一温度和55-69℃的第二温度不断交替的热循环下，通过聚合酶链式反应(pcr)扩增靶标核酸序列。本公开说明书另一方面提供了一种实施该技术方案的试剂盒。该试剂盒随样品包含至少一种耐热聚合酶和一对寡核苷酸引物，以及使用该试剂盒实施该技术方案的说明。考虑到对特定实施例的详细说明，本说明书的附加功能(文中用词additionalfeatures)对本领域技术人员而言容易理解。4.1通用技术本发明中描述及涉及的技术和步骤均来自本领域技术人员易于理解和/或通常使用的常规技术和步骤，比如sambrook等编著的《分子克隆：实验室手册》(第三版.2001)(molecularcloning:alaboratorymanual(3ded.2001))和ausubel等编著的《现代分子生物学实验技术》(2003)(currentprotocolsinmolecularbiology(ausubeletal.eds.,2003))中描述的广泛使用的方法。4.2术语除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语与本领域普通技术人员所理解的含义相同。为了解释本说明书的目的，将使用以下术语描述，并且在适当时，以单数形式使用的术语还将包括复数形式，反之亦然。所有专利，申请，公开的申请和其他出版物均通过引用全文纳入本文。在术语的任何描述与通过引用并入本文的任何文件相冲突的情况下，以下述术语的描述为准。除非上下文另外明确指出，否则本文所用的单数术语“一个”，“一种”和“该”包括复数形式。如本文所用，术语“大约”是指近似的、在一定范围内、粗略的或附近。当术语“约”与数字范围结合使用时，它通过扩展上述数值上下的边界来修改该范围。通常，术语“约”在本文中用于将数值修改为在所述数值的5％上下(±5％)。当表达这样的范围时，另一实施例包括从一个特定值和/或至另一特定值。类似地，当通过使用先行词“约”将值表示为近似值时，将理解为特定值形成另一实施例。还将进一步理解为每个范围的端点相对于另一个端点显著相关以及独立。术语“氨基酸”是指天然存在的和非天然存在的α-氨基酸，以及以类似于天然存在的α-氨基酸功能的α-氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸是22种常见氨基酸(丙氨酸，精氨酸，天冬酰胺，天冬氨酸，半胱氨酸，谷氨酰胺，谷氨酸。甘氨酸，组氨酸，异亮氨酸，亮氨酸，赖氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，脯氨酸，丝氨酸，苏氨酸，色氨酸，酪氨酸，缬氨酸，吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)。氨基酸类似物或衍生物是指具有与天然氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即与氢，羧基，氨基和侧链r基团结合的碳，例如，高丝氨酸，正亮氨酸，蛋氨酸亚砜，蛋氨酸甲基磺酸。这样的类似物具有修饰的r基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽主链，但是保留与天然氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸在本文中可以用它们众所周知的三个字母符号或iupac-iub生化命名委员会推荐的一个字母符号来指代。同样，核苷酸可以用它们普遍接受的单字母代码来指代。如本文所用，术语“保守取代”是指一个氨基酸残基被另一生物学上相似的残基取代。保守取代的实例包括用一个疏水氨基酸残基例如ile，val，leu或met取代另一个，或用一个极性氨基酸残基取代另一个极性氨基酸残基，例如在arg和lys之间，在glu和asp之间或在gln和asn之间，以及类似取代方式。在某些情况下，离子氨基酸残基被类似或带相反电荷的离子氨基酸残基(例如lys)的asp替代，在本领域中这种取代方式被认为是保守的，因为认为那些离子氨基酸基团仅提供溶解性辅助。术语“非离子”和“离子”氨基酸残基在本文中以其通常的含义使用，是指在生理ph值下通常不带电荷或通常带电荷的氨基酸残基。示例性的非离子氨基酸残基包括thr和gln，而示例性的离子氨基酸残基包括arg和asp。术语“非天然氨基酸”或“非蛋白原性氨基酸”或“非天然氨基酸”是指相对于以上列出的二十二个常见或天然的氨基酸，包含不同侧链(不同的r基团)的α-氨基酸。此外，这些术语也可以指被描述为具有d-立体化学构象而非天然氨基酸的l-立体化学构象的氨基酸，尽管某些氨基酸确实以自然界中的d-立体化学形式存在(例如d-丙氨酸和d-丝氨酸)。如本文所用，术语“bstdna聚合酶”是指源自嗜热脂肪芽孢杆菌或其至少保留聚合酶和链置换活性的突变或截短形式的野生型dna聚合酶。该酶可以从嗜热脂肪芽孢杆菌中分离或合成产生。对于本公开特别适用的bstdna聚合酶的一个示例性实施例是bstdna聚合酶(大片段)，据报道，其在约65℃具有良好的链置换活性，并具有固有的逆转录酶活性(shietal.ꢀ“innatereversetranscriptaseactivityofdnapolymeraseforisothermalrnadirectdetection.”j.am.chem.soc.(2015)137,13804–13806)，并且没有5′→3′核酸外切酶活性。根据本发明，其他适用于实施例的bstdna聚合酶包括但不限于bstdna聚合酶(全长)，突变的bstdna聚合酶，例如由newengland商业化的bst2.0dna聚合酶，bstwarmstartdna聚合酶和bst3.0dna聚合酶。本文所用的术语——参照酶或蛋白质的“功能性衍生物”是指与参照酶或蛋白质相比具有不同氨基酸序列但保留了参照酶或蛋白质的相同功能的酶或蛋白质。在某些情况下，该术语是针对一种或多种感兴趣的活性使用的，并且只要一个变体保留了参照物的感兴趣的活性，该变体就可以被认为是功能性衍生物，即使该变体可能不含参照的其他功能或活性。在某些情况下，即使衍生物的活性水平提高或降低，功能性衍生物也可以保持与参照物相同的活性，并且这种衍生物仍可以被视为参照物的功能性衍生物。在分子生物学和遗传学领域的术语中的术语“g/c含量”，是指dna或rna分子中含氮碱基鸟嘌呤(g)或胞嘧啶(c)的百分比。术语“遗传多态性”是指在相同的杂交群体中两个或更多个dna序列共存的现象。术语“同一性”是指通过比对和比较序列确定的两个或更多个多肽分子或两个或更多个核酸分子的序列之间的关系。相对于参考多核苷酸序列的百分比(％)“序列同一性”被定义为候选核苷酸序列与参考核苷酸序列中相同的核苷酸的百分比，在将序列比对并在必要时引入缺口后，获得最大百分比序列同一性，并且不考虑任何取代作为序列同一性的一部分。为了确定核酸序列同一性百分比而进行的比对可以以本领域技术范围内的各种方式来实现，例如使用公开可用的计算机软件，例如blast，blast-2，align或megalign(dnastar，inc.)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。例如，可以使用blast算法确定两个或更多个序列的相关性的示例性参数如下。简而言之，可以使用blastp2.0.8版(jan-05-1999)和以下参数进行序列比对：矩阵：0blosum62；空位开放：11；缺口延伸：1；x_dropoff：50；期望：10.0；字号：3；过滤器：打开。可以使用blastn2.0.6版(1998年9月16日)和以下参数进行核酸序列比对：匹配：1；不匹配：ꢀ-2；空位开放：5；缺口延伸：2；x_dropoff：50；期望：10.0；字号：11；过滤器：关闭。本领域技术人员将知道可以对上述参数进行哪些修改以增加或减少比较的严格性，并确定两个或更多个序列的相关性。术语“寡核苷酸”和“核酸”是指单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸(例如，dna)或核糖核苷酸(例如，rna)的寡聚物及其聚合物。除非特别限制，该术语涵盖含有已知天然核苷酸的类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以与天然核苷酸相似的方式被代谢。除非另有特别限定，该术语还指包括pna(肽核酸)的寡核苷酸类似物，反义技术中使用的dna的类似物(硫代磷酸酯，氨基磷酸酯等)。除非另有说明，否则特定的核酸序列还隐含地涵盖其保守修饰的变体(包括但不限于简并密码子取代)和互补序列以及明确指出的序列。具体而言，简并的密码子取代可通过三个密码子中的一个或多个选定(或全部)被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代产生序列来实现，(batzer,m.a.,etal.,nucleicacidres.,1991,19,5081-1585；ohtsuka,e.etal.,j.biol.chem.,1985,260,2605-2608；androssolini,g.m.,etal.,mol.cell.probes,1994,8,91-98)。如本文所用的核酸可以是但不限于dna，rna，cdna，gdna，rrna，ssdna，dsdna，dna-rna杂交等。本文所用的术语“或”是指特定列表的任何一个成员，并且还包括该列表的成员的任何组合，除非另有说明或者该术语出现的上下文指示或暗示了其他含义。本文所用，术语“phi29dna聚合酶”是指源自枯草芽孢杆菌噬菌体phi29(φ29)或其至少保留聚合酶和链置换活性的突变或截短形式的野生型复制聚合酶。该酶可以从噬菌体phi29分离或人工合成。如本文所用，术语“聚合酶链式反应”或pcr是指由核酸聚合酶催化的链反应，其中在较早几轮反应中产生的核酸链被用作后续反应的模板。如本文所用，术语“探针”，“引物”或“寡核苷酸”是指具有确定序列的单链dna或rna分子，其可以与另一个包含互补序列的dna或rna分子(即“靶标“)碱基配对。杂交是两个互补的核酸单链结合形成一个氢键连接的双链。所得到的杂交体的稳定性取决于长度、g/c含量、最邻近的堆积能量以及碱基配对的程度。碱基配对的程度受探针和靶标分子之间的互补程度和杂交条件的严格程度等参数的影响。杂交严格程度受温度，盐浓度和甲酰胺等有机分子浓度等参数的影响，并通过本领域技术人员已知的方法来确定。探针，引物和寡核苷酸可以通过本领域技术人员众所周知的方法进行可检测地标记，包括放射性、荧光或非放射性标记。dsdna结合染料(与双链dna结合时比与单链dna结合或在溶液中游离时荧光更强的染料)可用于检测dsdna。据了解，“引物”是专门设计为可以通过聚合酶延伸的，而“探针”或“寡核苷酸”则可以不被如此设计。术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用，是指超过五十(50)个氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于蛋白质的描述，反之亦然。该术语适用于天然氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基为非天然氨基酸的氨基酸聚合物，例如氨基酸类似物。如本文所用，该术语包括长度大于50个氨基酸残基的氨基酸链，包括全长蛋白质(例如，全长聚合酶)，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。如本文所用，术语“肽”是指包含两个至五十(2-50)个氨基酸残基的聚合物链。该术语适用于天然氨基酸聚合物以及其中一个或多个氨基酸残基为非天然氨基酸的氨基酸聚合物，例如氨基酸类似物或非天然氨基酸的氨基酸聚合物。如本文所用，术语“样品”是指动物；动物的组织或器官；细胞(包括在受试者体内的细胞；直接取自受试者的细胞；保持在培养物中或从培养的细胞系中取出的细胞)；细胞裂解物(或裂解部分)或细胞提取物；含有一个或多个源自细胞、细胞物质或病毒物质的分子(例如多肽或核酸)的溶液；或含有天然或非天然核酸的溶液，按照本文所述进行测定。样品还可以是含有细胞、细胞成分或核酸的任何体液或排泄物(例如但不限于血液，尿液，粪便，唾液，眼泪，胆汁)。如本文所用，术语“特异性杂交”或其语法变体是指引物在高严格性条件下与基本上互补的核酸(例如样品核酸)识别并发生物理相互作用(即碱基对)，并且几乎不与其他核酸碱基配对。短语“高严格性条件”是指与使长度至少为40个核苷酸的dna探针产生杂交的类似条件，如含有0.5m磷酸钠盐，ph7.2、7％sds，1mmedta和1％bsa(组分v)的缓冲液，反应温度为65℃的条件，或含有48％甲酰胺，4.8×ssc，0.2μtris-cl，ph7.6、1xdenhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和0.1％sds的缓冲液，反应温度为42℃的条件。高严格杂交的其他反应条件，例如pcr，northern，southern或原位杂交，dna测序等，都是分子生物学领域的技术人员众所周知的(ausubeletal.,“currentprotocolsinmolecularbiology,”johnwiley&sons,newyork,ny,1998.)。如本文所用，术语“链置换”或其语法变体是本领域的术语，并且是指聚合酶在合成新互补链时置换在其遇到的下游互补核酸链的能力。结果是产生了包含原始模板链和新合成的互补链的双链核酸分子，同时去除了原始互补链。据报道，几种dna聚合酶具有不同程度的链置换活性。例如，phi29dna聚合酶具有很强的链置换能力。链置换聚合酶的其他实例包括dna聚合酶i，dna聚合酶i大片段(klenow)，dna聚合酶，和嗜热脂肪芽孢杆菌(bst)dna聚合酶(大片段)。还已知一些链置换聚合酶是耐热的。例如，bstdna聚合酶(大片段)在高温(例如约65℃)下表现出良好的链置换活性。其他此类实例包括但不限于dna聚合酶i，dna聚合酶i大片段(klenow)在高温(例如37℃左右)下表现出良好的链置换活性，dna聚合酶在高温下(例如75℃左右)表现出良好的链置换活性。几种链置换聚合酶是可商购的。例如，newengland已将几种工程化设计的bstdna聚合酶商业化。这些产品的制造商说明和建议(可从www.neb.com/faqs/0001/01/01/when-should-bst-dna-polymerase-be-the-ꢀchoiceme-of-choice网站获得)从仅用于说明目的图9中复制。zeng等描述了dna聚合酶i的突变型之一——缺乏5′→3′核酸外切酶活性，但保留了链置换活性的dna聚合酶i大片段(klenow)(klenowexo-)(zengetal.ꢀ“stranddisplacementamplificationformultiplexdetectionofnucleicacids”ꢀ(2018)；doi:10.5772/intechopen.80687)。尽管这些酶可以与本发明的方法和试剂盒结合使用，但是本发明绝不限于这些示例性的商品化酶。本领域技术人员能够理解的，满足本公开内容的所述活性的本领域当前已知或将来发现的其他酶也被本公开内容涵盖并且包括在本公开内容中。术语“受试者”和“患者”可以互换使用。如本文所用，在某些实施例中，受试者是哺乳动物，例如非灵长类动物(例如，牛，猪，马，猫，狗，大鼠等)或灵长类动物(例如，猴和人)。在特定的实施例中，受试者是人。本文所用的术语“耐热聚合酶”是指在50-80℃的温度范围内稳定且有活性的聚合酶，并且能够催化退火后与模板链碱基互补配对结合的引物延伸产生新链。合成可以在引物的3'端开始，并向模板链的5'端进行(5'→3'聚合酶活性)，直到合成终止，产生不同长度的核酸分子。或者，可以在引物的5'端开始合成，然后向模板链的3'端进行合成(3′→5′聚合酶活性)。在上述温度范围外的较低温度下无活性但在暴露于上述温度范围内的温度下可被活化或再活化的耐热聚合酶在本公开中称为热活化酶。在上述温度范围之外的较高温度下无活性但在暴露于上述温度范围内的温度下可以活化或再活化的热稳定聚合酶在本公开中称为热失活酶。4.3引物根据本公开，引物被设计成当置于合适的条件下(例如，存在核苷酸和诱导剂，如dna聚合酶，并在合适的温度和ph下)时能够充当引物延伸产物(即扩增产物)的合成的起始点。在一些实施例中，引物优选地是单链的，以实现最大的扩增效率，但是可以可替代地以双链的形式提供。在以双链形式提供引物的那些实施例中，可以先对引物进行处理以分离其链，然后再将其分离。用于生产引物延伸产物。在一些实施例中，引物是寡脱氧核糖核苷酸。在其他实施例中，引物是寡核糖核苷酸。在一些实施例中，设计一对上游和下游引物，使得它们可操作地限定靶标核酸分子中的扩增区域或序列，这意味着所述引物具有被设计为与靶标核酸分子中待扩增的区域的两个末端特异性杂交的序列。根据本公开，在一些实施例中，引物被设计为与靶标核酸中的模板链基本上互补，这意味着引物和靶标之间的碱基配对足够使得杂交对于引物延伸反应开始。被认为是“基本互补”的两个序列的碱基配对的百分比还取决于杂交条件的严格性，并且考虑到本公开内容，这种百分比和条件的选择对于本领域技术人员而言将是常见和容易理解的。在一些实施例中，在执行本方法之前，选择靶标序列。特别地，在一些实施例中，靶标序列的选择是基于确定目标生物的属和种。在一些实施例中，选择在生物体中相对大量存在的基因组序列作为靶标。在一些实施例中，靶标序列选自核糖体rna(rrna)编码基因或线粒体基因。在一些实施例中，选择对于相关生物唯一的基因组序列。例如，为了鉴定生物体的独特序列，在一些实施例中，将感兴趣生物体的候选序列与进化中其他紧密相关物种的序列(例如不同物种的直系同源基因)进行比较。直系同源物是通过垂直同源相关的一个或多个基因，并且负责不同生物中基本相同或相同的功能。例如，对于环氧化物水解的生物学功能，可以将小鼠环氧化物水解酶和人环氧化物水解酶视为直系同源物。例如，当基因共享足够数量的序列相似性以表明它们是同源的，或者通过共同祖先的进化而相关时，它们就通过垂直同源而相关。在一些实施例中，选择跨物种保守的基因组序列作为靶标。在一些实施例中，选择倾向于具有目的遗传突变的基因组序列作为靶标。因此，在一些实施例中，引物序列与靶标核酸分子的模板链不完全互补，并且即使确定了靶标序列，引物的序列也可以被优化。例如，在一些实施例中，非互补片段可以连接至引物的5'端，而引物序列的其余部分与链互补。例如，在其他实施例中，引物包含散布在与靶标互补的区域内的非互补碱基或片段。如本领域技术人员能够认可的，只要引物与待扩增的模板链具有足够的碱基配对与其杂交，从而形成用于下一轮扩增的模板，即可设计多种不同的引物。不受理论的束缚，可以预期，加速sea方法的扩增速率至少受以下三个因素影响：(1)形成变性泡的几率，(2)聚合酶的扩增效率，(3)引物与变性泡中靶标序列特异性结合的效率。具体而言，变性泡的形成和聚合酶的扩增效率受反应温度的影响。(chanderetal.“anovelthermostablepolymeraseforrnaanddnaloop-ꢀmediatedisothermalamplification(lamp),”front.microbiol.,(2014)5:395；sanchezetal.“dnakinksandbubbles:temperaturedependenceoftheelasticenergyofsharplybent10-nm-sizednamolecules,”physicalreviewe(2013)87:22710)。随着温度的升高，双链dna分子中变性泡的动态打开和关闭将变得更加频繁(adamciketal.,“quantifyingsupercoiling-induceddenaturationbubblesindna,”softmatter,(2012)8:8651-8658)。此外，聚合酶的扩增效率还受到反应温度的影响。具体而言，将酶活性达到最大水平的反应温度称为该特定酶的最佳温度。例如，据报道bstdna聚合酶的最佳温度为65℃(kuceraetal.“dna-dependentdnapolymerases,”currentprotocolsinmolecularbiology,(2008)84:3-5)。最后，引物-目标结合的效率受反应温度和引物的熔解温度(tmortmvalue)之间关系的影响，而tm值又取决于引物的序列(例如g/c含量)。通常，当反应温度接近引物的tm值时，引物将有效结合其靶标。然而，相比引物的tm值，过高的反应温度会阻碍引物与靶标的结合，而过低的反应温度会导致过度的非特异性引物结合和扩增(kwoketal.,“effectsofprimer-ꢀtemplatemismatchesonthepolymerasechainreaction:humanimmunodeficiencyvirustype1modelstudies,”nucleicacidsres.,(1990)18:999-1005；fernándezinmethodsinenzymology,elsevier,editonedn.,(2013),vol.529,pp.1-21)。设计具有特定tm值的引物的方法和确定给定酶的最佳温度的方法是本领域已知的。此外，可以使用本领域已知的方法确定合适的反应温度和引物的tm值，所述方法包括但不限于本专利的实施例6中描述的示例性步骤(第5.7.1节)在一些实施例中，引物的tm值在聚合酶的最佳温度±5℃以内。在一些实施例中，引物的tm值在聚合酶的最佳温度±4℃以内。在一些实施例中，引物的tm值在聚合酶的最佳温度±3℃以内。在一些实施例中，引物的tm值在聚合酶的最佳温度±2℃之内。在一些实施例中，引物的tm值在聚合酶的最佳温度±1℃以内。在一些实施例中，引物的tm值在聚合酶的最佳温度±0.5℃以内。例如，在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，用于反应的引物的tm值选自约58℃-68℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的各种实施例中，用于反应的引物的tm值为约58℃，约58.5℃，约59℃，约59.5℃，60℃，约60.5℃，约61℃，约61.5℃，约62℃，约62.5℃，约63℃，约63.5℃，约64℃，约64.5℃，约65℃，约65.5℃，约66℃，约66.5℃，约67℃，约67.5℃或约68℃。在一些实施例中，引物对中两个引物的tm值大致相同。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约5％。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约4％。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约3％。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约2％。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约1％。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约0.5％。在一些实施例中，引物对中两个引物的tm值大致相同。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约5℃。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约4℃。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约3℃。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约2℃。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约1℃。在特定的实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约0.5℃。不受理论的束缚，可预期的是，当靶标分子仅部分变性时本发明方法中使用的引物与靶标核酸分子杂交。此外，可以预期的是，变性泡在靶标核酸分子中动态地打开和关闭，从而使特异性引物杂交的时间窗比常规pcr短得多，在常规pcr中，靶标分子在引物退火之前已完全变性。此外，可以预期的是，在靶标核酸分子中的引物和模板链之间的稳定杂交促进聚合酶催化的引物延伸。进一步考虑到，虽然g-c碱基配对通常更稳定，但是a-t碱基配对可以以更快的速率杂交。(raymaekersetal.,“checklistforoptimizationandvalidationofreal-timepcrassays,”j.clin.lab.anal.,(2009)23:145-151).因此，在一些实施例中，本方法中使用的引物被设计为具有合适的g/c含量。在特定的实施例中，引物在聚合酶引发引物延伸的末端具有合适的g/c含量。例如，在一些实施例中，当聚合酶从引物的3'末端延伸引物时，可以将引物专门设计成在更接近其3'末端的区域中具有合适的g/c含量，因此引物可以快速与模板链稳定杂交。或者，在聚合酶从引物的5'端延伸引物的那些实施例中，可以将引物专门设计为在更靠近其5'端的区域具有合适的g/c含量，从而使引物可以快速与模板链形成稳定的杂交。引物的合适g/c含量可以使用本领域已知的方法来确定，包括但不限于本专利的实施例6中描述的示例性方法(第5.7.2节)。在聚合酶在引物的3'端起始引物延伸的特定实施例中，引物以g或c作为3'末端核苷酸。在一些实施例中，引物的g/c含量为约40％至约60％。在特定的实施例中，引物的g/c含量为约40％。在特定的实施例中，引物的g/c含量为约45％。在特定的实施例中，引物的g/c含量为约50％。在特定的实施例中，引物的g/c含量为约55％。在特定的实施例中，引物的g/c含量为约60％。在特定的实施例中，引物在包括3′末端核苷酸的连续5-nt区域中包含至少40％的g/c含量。在特定的实施例中，引物在包括3'末端核苷酸的连续5-nt区域中包含至少40％的g/c含量，其中3'末端核苷酸也是g或c。在特定的实施例中，引物在包括3'末端核苷酸的连续5-nt区域中g/c含量至少为60％。在特定的实施例中，引物在包括3'末端核苷酸的连续5-nt区域中包含至少60％的g/c含量，其中3'末端核苷酸也是g或c。在特定的实施例中，引物在包括3'末端核苷酸的连续5-nt区域中g/c含量至少为80％。在特定的实施例中，引物在包括3'末端核苷酸的连续5-nt区域中包含至少80％的g/c含量，其中3'末端核苷酸也是g或c。在特定的实施例中，引物在包括3'末端核苷酸的连续5nt区域中g/c含量为100％。在特定的实施例中，引物在包括3'末端核苷酸的连续5-nt区域中包含100％的g/c含量，其中3'末端核苷酸也是g或c。在聚合酶在引物的5'端起始引物延伸的特定实施例中，引物具有g或c作为5'端核苷酸。在一些实施例中，引物的g/c含量为约40％至约60％。在特定的实施例中，引物的g/c含量为约40％。在特定的实施例中，引物的g/c含量为约45％。在特定的实施例中，引物的g/c含量为约50％。在特定的实施例中，引物的g/c含量为约55％。在特定的实施例中，引物的g/c含量为约60％。在特定的实施例中，引物在包括5'末端核苷酸的连续5-nt区域中包含至少40％的g/c含量。在特定的实施例中，引物在包括5'末端核苷酸的连续5-nt区域中包含至少40％的g/c含量，其中5'末端核苷酸也是g或c。在特定的实施例中，引物在包括5'末端核苷酸的连续5-nt区域中g/c含量至少为60％。在特定的实施例中，引物在包括5'末端核苷酸的连续5-nt区域中包含至少60％的g/c含量，其中5'末端核苷酸也是g或c。在特定的实施例中，引物在包括5'末端核苷酸的连续5-nt区域中g/c含量至少为80％。在特定的实施例中，引物在包括5'末端核苷酸的连续5-nt区域中包含至少80％的g/c含量，其中5'末端核苷酸也是g或c。在特定的实施例中，引物在包括5'末端核苷酸的连续5个核苷酸区域中，g/c含量为100％。在特定的实施例中，引物在包括5'末端核苷酸的连续5-nt区域中包含100％的g/c含量，其中5'末端核苷酸也是g或c。不受理论的束缚，可以想到具有能够形成自身互补二级结构的序列的引物或彼此具有互补序列的一对引物会阻碍扩增反应。(meagheretal.,ꢀ“impactofprimerdimersandself-amplifyinghairpinsonreversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplificationdetectionofviralrna,”analyst,(2018)143:1924-1933)。因此，在一些实施例中，在选择用于引物杂交的靶标序列之后，可以进一步优化引物序列以避免或减少形成这些引物内或引物间互补结构的可能性。用于引物序列优化的方法在本领域中是已知的，包括但不限于本专利的实施例6中所述的示例性方法(第5.7.3节)。根据目前的发现，引物长度的选择可以取决于多种因素，包括但不限于扩增反应温度和时间。不受理论的限制，可以预期的是，反应温度越高，引物和靶标之间的互补区域越长，可以用于避免非特异性扩增。不受理论的束缚，还可以预期，减少每个扩增循环中的引物延伸时间可以显著减少产生可检测量的扩增产物所需的总时间，从而减少靶标检测和相关诊断所需的时间。因此，在一些实施例中，引物设计为可以特异性地与大部分的扩增区域杂交，从而使得在每个扩增循环中要延伸的核苷酸的数量(即扩增产物与引物之间的长度差)相对较小。例如，在特定的实施例中，引物的长度与扩增产物的总长度之间的比率在约30％至约60％的范围内。在特定的实施例中，引物的长度与扩增产物的总长度之间的比率在约30％的范围内。在特定的实施例中，引物的长度与扩增产物的总长度之间的比率在约35％的范围内。在特定的实施例中，引物的长度与扩增产物的总长度之间的比率在约40％的范围内。在特定的实施例中，引物的长度与扩增产物的总长度之间的比率在约45％的范围内。在特定的实施例中，引物的长度与扩增产物的总长度之间的比率在约50％的范围内。在特定的实施例中，引物的长度与扩增产物的总长度之间的比率在约55％的范围内。在特定的实施例中，引物的长度与扩增产物的总长度之间的比率在约60％的范围内。在一些实施例中，针对相对较短的扩增区域设计一对引物，该引物具有能够表明靶标核酸的特性、状态、起源或来源的独特序列。靶标核酸中扩增区域的选择取决于检测目的或应用场景，并且在阅读本专利之后，本领域技术人员能够认同这种选择方式。例如，为了检测样品中是否存在基因突变或多态性，可以选择包括突变或多态性的预期位点的扩增区域。为了检测样品中病理性微生物的存在，可以选择覆盖微生物基因组中的已知特征序列的扩增区域。在一些实施例中，该对引物被设计为扩增靶标核酸分子中小于100bp长的区域。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增片段的长度小于90bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增片段的长度小于80bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增片段的长度小于70bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增片段的长度小于60bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增片段的长度小于50bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增片段为约20-50bp长。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增片段长约30-50bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增片段长约35-50bp。在一些实施例中，为了减少引物延伸所需的时间，该对引物被配置为产生长度为约20个碱基对(bp)至约50bp的短扩增片段。扩增片段至少包含与靶标核酸分子中的独特序列相对应的中心部分，该中心部分的侧翼可以是与靶标分子中的序列相同或不同的引物序列。例如，在特定的实施例中，扩增片段的长度为约20bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约21bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约22bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约23bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约24bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约25bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约26bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约27bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约28bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约29bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约30bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约31bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约32bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约33bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约34bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约35bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约36bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约37bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约38bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约39bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约40bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约41bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约42bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约43bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约44bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约45bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约46bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约47bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约48bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约49bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约50bp。在一些实施例中，为了减少引物延伸所需的时间，将引物配置为与靶标分子中的扩增区域的大部分特异性杂交。具体地，在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度为约10至25个核苷酸(nt)。在一些实施例中，其中扩增产物的长度为约20至50bp，引物对中的两个引物的长度均为约10至25nt。具体地，在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约10nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约11nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约12nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约13nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约14nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约15nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约16nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约17nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约18nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约19nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约20nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约21nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约22nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约23nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约24nt。在扩增产物长约20至50bp的一些实施例中，一对引物中的至少一个的长度约25nt。如本领域普通技术人员能够理解的，在实际的引物设计过程中，基于不同的考虑因素(例如，tm，g/c含量，序列互补性)选择引物序列时可能彼此矛盾。因此，在一些实施例中，可以将不同的考虑因素彼此比较以确定在不同的考虑因素之间的优先级顺序。特别地，当基于较低优先级考虑得到的引物序列的选择与基于较高优先级考虑得到的引物序列的选择相矛盾时，可以采用基于较高优先级考虑的选择。示例6进一步提供了用于确定第5.7.4节中此类优先级顺序的示例过程。4.4酶根据本公开，可与本方法结合使用的聚合酶包括在约50-80℃的温度范围内具有链置换活性的耐热聚合酶。在一些实施例中，选择用于本发明方法的耐热聚合酶在约70-80℃的温度下具有链置换活性。在一些实施例中，耐热聚合酶具有5′→3′聚合酶活性，并且能够将退火后与模板链结合的引物从3'端开始向模板链的5'端延伸，从而置换沿5′→3′方向的原始互补链。在其他实施例中，耐热聚合酶具有3′→5′聚合酶活性，并且能够将退火后与模板链结合的引物从5'端开始向模板链的3'端延伸，从而置换沿3′→5′方向的原始互补链。与链置换相反，某些聚合酶(例如taqdna聚合酶)通过核酸外切酶活性降解遇到的下游互补链。尽管结果也是形成具有原始模板链和新合成的互补链(通过降解除去原始互补链)的双链，但核酸外切酶活性可以减少扩增的核酸片段的总量，因此在某些(但不是全部)应用的过程中效果不太理想。因此，某些聚合酶经过了工程改造，可以去除野生型酶的5′→3′核酸外切酶活性，同时保留聚合酶活性和链置换活性。因此，在一些实施例中，耐热聚合酶具有5′→3′聚合酶活性，并且没有5′→3′核酸外切酶活性。在一些实施例中，耐热聚合酶具有3′→5′聚合酶活性，并且没有3′→5′核酸外切酶活性。在一些实施例中，耐热聚合酶是热活化酶。在一些实施例中，耐热聚合酶是热灭活酶。在一些实施例中，耐热聚合酶具有逆转录酶活性。在一些实施例中，耐热聚合酶在其最佳温度下的扩增速率为至少10nt/s。可以结合本专利使用的热稳定聚合酶的实例包括但不限于phi29dna聚合酶或其截短或突变形式，dna聚合酶i或其截短或突变形式，dna聚合酶或截短或其突变形式，以及嗜热脂肪芽孢杆菌(bst)dna聚合酶或其截短或突变形式，以及水生栖热菌(taq)dna聚合酶或其截短或突变形式。在一些实施例中，聚合酶是bstdna聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是全长bstdna聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是bstdna聚合(大片段)。在一些实施例中，聚合酶是bstdna聚合酶的突变形式。在特定的实施例中，突变的bstdna聚合酶缺乏5′→3′核酸外切酶活性。在一些实施例中，bstdna聚合酶是可商购的。在特定的实施例中，bstdna聚合酶选自从newengland商购的bst2.0dna聚合酶，bst2.0warmstartdna聚合酶和bst3.0dna聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是dna聚合酶i或其突变或截短形式。在一些实施例中，聚合酶是野生型dna聚合酶i大片段(klenow)。在一些实施例中，聚合酶是klenowexo-。在一些实施例中，聚合酶是phi29dna聚合酶或其突变或截短形式。在一些实施例中，聚合酶是dna聚合酶,deep(exo-)dna聚合酶,deepdna聚合酶,或(exo-)dna聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是taqdna聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是taqdna聚合酶的突变形式。在一些实施例中，taqdna聚合酶是热活化酶。在一些实施例中，taqdna聚合酶是可商购的。在具体的实施例中，taqdna聚合酶选自可从newengland购买热启动taqdna聚合酶，热启动taqdna聚合酶，onetaqdna聚合酶，热启动dna聚合酶和taqdna聚合酶。在一些实施例中，taqdna聚合酶是longtaqdna聚合酶。尽管以上示例性酶或相应商业产品可以与本发明的方法和试剂盒结合使用，但是本发明中对于酶的选择绝不限于上述几种。如本领域技术人员能够理解的，满足本专利的当前已知或将来发现的其他酶也被本专利考虑并且包括在本专利中。可以使用本领域已知的方法产生并选择适用于本专利内容的其他聚合酶。例如，可以通过定向诱变或随机诱变使野生型聚合酶突变以产生肽变体，随后可以对其进行筛选(例如，单独地或通过高通量测定)以鉴定具有所需聚合酶活性的突变体。为了说明目的，下面提供了用于酶诱变和进化的几种示例性方法。定向进化是一种强有力的方法，其涉及引入针对特定基因或含有该基因的寡核苷酸序列的突变，以改善和/或改变酶，蛋白质或肽(例如聚合酶，特别是dna聚合酶)。可以通过开发和实施灵敏的高通量检测方法来鉴定改良的和/或改变的酶，蛋白质或肽，该方法可以自动筛选多种酶或肽变体(例如，>1.0×104)。通常进行迭代诱变和筛选以提供具有优化特性的酶或肽。目前还已经开发出可以帮助鉴定诱变基因区域的计算算法，并且可以显著减少需要产生和筛选的酶或肽变体的数量(fox,r.j.,etal.,trendsbiotechnol.,2008,etal.,nat.biotechnol.,1999,17,1205-1209)；硫杂酶截短以产生杂合酶(thio-itchy)，与itchy相似，不同之处在于使用硫代磷酸酯dntp产生截短(see:lutzetal.,nucleicacidsres.,2001,29,e16)；scratchy，其结合了两种重组基因的方法：itchy和dna改组(see:lutzetal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2001,98,11248-11253)；随机漂移诱变(rndm)，其中通过eppcr产生的突变之后，筛选/选择保留有用活性的突变(see:bergquistetal.,biomol.eng.,2005,22,63-72)；序列饱和诱变(sesam)，一种随机诱变方法，使用硫代磷酸酯核苷酸的随机掺入和裂解生成一个随机长度片段库，用作在“通用”碱基(如肌苷)存在下扩展的模板，含肌苷的补体的复制产生随机碱基掺入并引起诱变(see:wongetal.,biotechnol.j.,2008,3,74-82；wongetal.,nucleicacidsres.,2004,32,e26；wongetal.,anal.biochem.,2005,341,187-189.)。合成改组，其使用被设计为编码“靶标中的所有遗传多样性”的重叠寡核苷酸，并允许改组后代具有非常高的多样性(see:nessetal.,nat.biotechnol.,2002,20,1251-1255)；核苷酸交换和切除技术next，利用dutps掺入，然后用尿嘧啶-dna糖基化酶并结合哌啶处理来进行端点dna片段化(see:mulleretal.,nucleicacidsres.,33:e117)。进一步的诱变方法包括不依赖序列同源性的蛋白质重组(shiprec)，其中使用接头促进两个遥远相关或不相关基因之间的融合，并且在两个基因之间产生一系列嵌合体，形成了单交杂种(see:sieberetal.,nat.biotechnol.,2001,19,456-460)；基因位点饱和诱变tm(gssmtm)，其中的起始材料包括一个超螺旋双链dna(dsdna)质粒，该质粒包含一个插入片段和两个在所需的突变位点变性的引物，从而能够在蛋白质或肽的每个位置上单独引入所有氨基酸变异(see:kretzetal.,methodsenzymol.,2004,388,3-11)；组合盒诱变(ccm)，其涉及使用短的寡核苷酸盒替换含大量可能的氨基酸序列改变的特定区域(see:reidhaar-olsonetal.methodsenzymol.,1991,208,564-586；reidhaar-olsonetal.science,1988,241,53-57)。组合多盒诱变(cmcm)与ccm基本相似，并以高突变率使用eppcr识别热点和热点区域，然后通过cmcm扩展以覆盖蛋白质序列空间的定义区域(see:reetzetal.,angew.chem.int.edengl.,2001,40,3589-3591)；突变株技术，其中条件ts突变质粒利用mutd5基因，该基因编码dna聚合酶iii的突变亚基，在选择过程中允许随机和自然突变频率增加20到4000倍，并在不需要选择时阻止有害突变的积累(see:selifonovaetal.,appl.environ.microbiol.,2001,67,3645-3649)；lowetal.,j.mol.biol.,1996,260,3659-3680)。其他示例性方法包括直视诱变(look-throughmutagenesis,ltm)，它是一种多维诱变方法，用于评估和优化所选氨基酸组合的突变(see:rajpaletal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2005,102,8466-8471.)；基因重组，这是一种与同源性无关的dna重排方法，可以一次应用于多个基因，也可以创建单个基因的大型嵌合体(多个突变)文库(see:short,j.m.,uspatent5,965,408,tunablegenereassemblytm)；silico蛋白质设计自动化(pda)中的一种优化算法，该算法可锚定具有特定折叠结构的结构定义的蛋白质主链，并在序列空间中搜索能够稳定蛋白质折叠和整体蛋白质能量的氨基酸取代，并且通常对于已知三维结构的蛋白质的计算最为有效(see:hayesetal.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.,2002,99,15926-15931)；迭代饱和诱变(ism)，涉及利用结构/功能知识来选择可能的酶促修饰位点，使用诱变方法(例如stratagenequikchange(stratagene；sandiegoca)，在选定的位点进行饱和诱变，筛选/选择为了获得所需的特性，并使用改良的克隆，从另一个位点开始并重复进行直至获得所需的活性(see:reetzetal.,nat.protoc.,2007,2,891-903；reetzetal.,angew.chem.int.edengl.,2006,45,7745-7751)。除了上述生物学方法外，酶(例如聚合酶)的进化也可以使用化学合成方法进行。例如，可以通过使用已知的溶液相或固相肽合成技术来合成包含突变体的大型组合肽文库(例如，>1.0×106种)(seereview:shin,d.-s.,etal.,j.biochem.mol.bio.,2005,38,517-525.)。化学肽合成方法可用于生产包含多种α-氨基酸的聚合酶变体，其中包括天然的蛋白原氨基酸，以及非天然和/或非蛋白原氨基酸，例如具有非蛋白原侧链的氨基酸，或d-氨基酸，或β-氨基酸。上述任何一种用于酶诱变的方法都可以单独使用或以任何组合使用，以改善酶，蛋白质和肽的性能。类似地，任何上述的诱变方法和/或展示的内容可以单独使用或以任何组合使用，以使得能够产生聚合酶变体，可以选择所述变体以改善性质。在一些实施例中，突变的聚合酶至少有80％的核酸序列与对应的野生型聚合酶相同。在一些实施例中，突变的聚合酶至少有85％的核酸序列与对应的野生型聚合酶相同。在一些实施例中，突变的聚合酶至少有90％的核酸序列与对应的野生型聚合酶相同。在一些实施例中，突变的聚合酶至少有95％的核酸序列与对应的野生型聚合酶相同。在一些实施例中，突变的聚合酶至少有96％的核酸序列与对应的野生型聚合酶相同。在一些实施例中，突变的聚合酶至少有97％的核酸序列与对应的野生型聚合酶相同。在一些实施例中，突变的聚合酶至少有98％的核酸序列与对应的野生型聚合酶相同。在一些实施例中，突变的聚合酶至少有99％的核酸序列与对应的野生型聚合酶相同。在此领域，用于确定序列同一性的方法是已知的。例如，检查两个多肽的核酸或氨基酸序列将揭示所比较序列之间的同一性和相似性。本领域技术人员熟知的算法，例如align，blast，clustalw和其他算法可以用于比较并确定原始序列的相似性或同一性，还可以确定可分配权重或进行评分的序列中空位的存在或重要性。在本领域中这样的算法也是已知的，并且类似地适用于确定核苷酸序列的相似性或同一性。基于众所周知的统计相似性的计算方法，或在随机多肽中找到相似匹配的机会以及确定匹配的显著性，计算出足以确定相似性的参数。如果需要，可以由本领域技术人员使用计算机对两个或更多个序列进行比较，以进行可视化优化。举例来说，使用blast算法确定两个或多个序列的相关性的示例性参数如下所示。简而言之，可以使用blastp2.0.8版(jan-05-1999)和以下参数进行氨基酸序列比对：矩阵：0blosum62；空位开放：11；缺口延伸：1；x_dropoff：50；期望：10.0；字数：3；过滤器：打开。可以使用blastn2.0.6版(1998年9月16日)和以下参数进行核酸序列比对：匹配：1；不匹配：-2；空位开放：5；缺口延伸：2；x_dropoff：50；期望：10.0；字数：11；过滤器：关闭。本领域技术人员将了解可以对上述参数如何修改，例如增加或减少比较的严格性，并确定两个或更多个序列的相关性。在一些实施例中，与野生型对应物相比，蛋白质的功能变体包含一个或多个保守取代。在一些实施例中，与野生型对应物相比，蛋白质的功能变体包含被非天然氨基酸残基替代的一个或多个氨基酸残基。可以筛选野生型和突变的酶(例如聚合酶)以选择具有本发明方法所期望性质的酶，以与本方法结合使用。在一些实施例中，针对那些至少保留dna聚合酶活性和链置换活性的酶和/或突变变体进行筛选。在一些实施例中，针对在约50-80℃的温度范围内具有热稳定性和活性的酶和/或突变的变体进行筛选。在一些实施例中，针对在约70-80℃的温度范围内具有热稳定性和活性的酶和/或突变的变体进行筛选。在一些实施例中，针对在50-80℃的温度范围内具有最佳温度的酶和/或突变的变体进行筛选。在一些实施例中，针对在70-80℃的温度范围内具有最佳温度的酶和/或突变的变体进行筛选。在一些实施例中，针对在50-80℃的最佳温度下具有至少10nt/s的延伸速率的酶和/或突变的变体进行筛选。在一些实施例中，筛选具有逆转录酶活性的酶和/或突变的变体。在一些实施例中，针对没有核酸外切酶活性的酶和/或突变的变体进行筛选。在一些实施例中，针对酶和/或突变的变体筛选热激活和/或热失活酶。可以使用本领域已知的方法和测定进行筛选。例如，给定的聚合酶是否具有链置换活性可以使用walker等(nucleicacidsres.1992apr11；20(7):1691–1696)和gao等(nucleicacidsres.,2009feb1；37,e20.)描述或使用的链置换扩增(sda)测定法来确定。可以使用诸如rychlik等人所述的测定方法来确定给定酶的热力学性质，包括其最佳温度和延伸速率(nucleicacidsres.,1990nov21；18(21),6409-6412.)。聚合酶是否具有逆转录酶活性可以使用shi等人(j.am.chem.soc.,2015oct16；137(43),13804-13806)和lanford等人(j.virol.,1995apr21；69(7),4431-4439.)描述或使用的测定方法确定。聚合酶是否具有核酸外切酶活性可以使用holland等(p.natl.acad.sci.usa,1991aug15；88(16),7276-7280)和beese等(beeseetal.,emboj.,1991jan1；10(1),25-33.)描述或使用的测定方法来确定。快速筛选大量不同突变酶、蛋白质或肽变体的方法涉及到显示技术的使用(forareview,see:ullman,c.g.,etal.,briefingsfunctionalgenomics,2011,10,125-134)。肽显示技术具有以下优势：特定的肽编码信息(例如rna或dna序列信息)可链接至文库中的每个相应肽或以其他方式与之关联，并且在筛选事件后此信息可访问和可读(例如，通过扩增和测序)，从而能够识别大型文库中表现出理想的性能的各个肽(例如，高结合亲和力)。表现出所需的改善的特性(hits)的酶肽突变体可以进行额外的诱变，以产生高度优化的酶变体。4.5方法当前公开的一方面提供了用于扩增和检测样品中的靶标核酸的方法。目前的方法大大改进了现有的基于变性泡介导的链置换扩增(sea)技术，shi等人于2016年首次报道了该技术(shietal.“triggeredisothermalpcrbydenaturationbubble-mediatedstrandexchangeamplification”chemcommun(camb)(2016)4；52(77):11551-4)。shi等报道了使用bstdna聚合酶和一对特异性引物在等温条件下进行指数dna扩增的sea分析。等温sea方法基于环境热波动而在双链dna(dsdna)中自发形成变性区域(“变性泡”)。然后，一对寡核苷酸引物侵入变性泡，与变性泡中未缠绕的单链dna结合，在聚合酶的作用下延伸并替换原始的互补链以产生扩增片段。因此，认为该方法利用了在不加热样品的情况下自发形成的小的变性泡的优点，从而有利地消除了对热循环仪的需求，并在通常选择聚合酶具有最佳活性的温度进行pcr反应(shietal.,2016，同上)。自建立以来，等温sea方法已被证明并用于各种病原体的快速检测和诊断，例如单增李斯特菌(zhangetal.“rapiddetectionoffoodbornepathogenlisteriamonocytogenesbystrandexchangeamplification,”analyticalbiochemistry,(2018)545:38-42)；肺炎支原体(shietal.“rapiddiagnosisofmycoplasmapneumoniainfectionbydenaturationbubble-mediatedstrandexchangeamplification:comparisonwithlampandreal-timepcr,”scientificreports,vol.9；articlenumber:896(2019))；金黄色葡萄球菌(liuetal.,“rapidandsimpledetectionofviablefoodbornepathogenstaphylococcusaureus,”ꢀfrontchem.(2019)mar12；7:124)；大肠杆菌(中国专利申请公开号：cn105176971a)；松材线虫(liuetal.,“therapiddetectionofthebursaphelenchusxylophilusbydenaturationbubble-mediatedstrandexchangeamplification,”anal.sci.2019,18p-461p.”)；和掺假肉(liuetal.,“asimpleisothermalnucleicacidamplificationmethodfortheeffectiveon-siteidentificationforadulterationofporksourceinmutton,”foodcontrol,2019,98297-302)。还已经证明了等温sea方法具有检测样品中微量靶标核酸(浓度低至1.0×10-14m)的能力(中国专利申请公开号：cn109136337a)。此外，还发现bstdna聚合酶具有固有的逆转录酶活性(shietal.“innatereversetranscriptaseactivityofdnapolymeraseforisothermalrnadirectdetection.”ꢀj.am.chem.soc.(2015)137,13804–13806)。已经证实，使用bstdna聚合酶进行等温sea反应可有效扩增和检测样品中的目标rna分子，而无需使用另一种逆转录酶(中国专利申请公开号：cn105176971a)。本公开令人惊讶的发现，即使在几摄氏度的小范围内，通过迅速改变反应温度来改变等温sea方法，也显著提高了数千倍扩增效率和速率。因此，在本技术的某些段落中，本方法被称为“加速sea”。不受理论的束缚，本公开内容设想可以通过在小温度范围内引起温度波动来促进变性泡的形成，这使其对于引物进入和杂交效率更高。此外，由于温度波动在聚合酶催化引物延伸的最佳温度附近，因此不会以增加延伸速率为代价来增加的变性泡出现的频率。除了温度波动在小范围内外，该反应的扩增片段很短(通常为20-50bp)。因此，即使聚合酶的活性可能略有降低，聚合酶仍可实现此类短片段的扩增。因此，在各种实例中，感应温度波动在聚合酶最佳延伸温度的1℃至15℃之内。在各种实施例中，本方法中使用的温度波动范围约小于30℃。在各种实施例中，本方法中使用的温度波动范围约小于25℃。在各种实施例中，本方法中使用的温度波动范围约小于20℃。在一些实施例中，本方法包括使聚合酶和一对特异性寡核苷酸引物与含有或疑似含有靶标核酸的样品接触，从而形成扩增混合物。该方法还包括使扩增混合物经受第一温度和第二温度之间的多个热循环，以便经由聚合酶链式反应(pcr)扩增靶标核酸的序列。然后可以检测扩增片段的产生，该检测可以用作各种分析和诊断的基础。根据本公开，第一和第二温度中的至少一个适合于(a)在双链靶标分子中形成变性泡；(b)引物能与靶标核酸特异性杂交；(c)聚合酶催化扩增混合物中的引物延伸；或(a)至(c)的任何组合。在一些实施例中，第一温度和第二温度之间的温度范围适合于(a)在双链靶标分子中形成变性泡；(b)引物能与靶标核酸特异性杂交；(c)聚合酶催化扩增混合物中的引物延伸；或(a)至(c)的任何组合。在一些实施例中，第一或第二温度的选择基于用于扩增的聚合酶的类型。在一些实施例中，在所用聚合酶的最佳温度附近选择第二温度。确定酶的最佳温度的方法是本领域已知的。例如，为了确定给定聚合酶在给定条件下催化引物延伸的最佳温度，可以制备多个等分试样的扩增混合物，每个等分试样均包含目标聚合酶，相同的引物，靶标和相同浓度的其他反应物。可以将等分试样在不同温度条件下进行pcr，并且可以通过比较扩增速率(例如使用实时pcr监测)来确定最佳温度。此外，可以基于本领域的报道或商品化聚合酶制造商的建议来确定聚合酶的最佳延伸温度。在一些实施例中，第二温度选自聚合酶最佳温度±6℃。仅出于说明和示例的目的，如果聚合酶的最佳延伸温度是65℃，那么在一些实施例中，第二温度可以选自约59-71℃。具体地，在该示例中，第二温度可以是大约59℃，大约59.5℃，大约60℃，大约60.5℃，大约61℃，大约61.5℃，大约62℃，大约62.5℃，大约63℃，大约63.5℃，大约64℃，大约64.5℃，大约65℃，大约65.5℃。℃，约66℃，约66.5℃，约67℃，约67.5℃，约68℃，约68.5℃，约69℃，约69.5℃，约70℃，约70.5℃或约71℃。在其他实施例中，第二温度选自聚合酶最佳延伸温度±5℃，±4℃，±3℃，±2℃或±1℃。在各种实施例中，第一温度比第二温度高或低约1℃至约30℃。在各种实施例中，第一温度比第二温度高或低约1℃至约25℃。在各种实施例中，第一温度比第二温度高或低约1℃至约20℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约1℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约1.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约2℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约2.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约3℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约3.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约4℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约4.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约5.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约6℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约6.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约7℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约7.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约8℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约8.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约9℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约9.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约10℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约10.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约11℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约11.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约12℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约12.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约13℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约13.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约14℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约14.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约15℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约15.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约16℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约16.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约17℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约17.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约18℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约18.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约19℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约19.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约20℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约20.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约21℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约21.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约22℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约22.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约23℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约23.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约24℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约24.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约25℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约25.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约26℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约26.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约27℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约27.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约28℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约28.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约29℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约29.5℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高或低约30℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高不超过约25c，并且第一温度等于或小于约90c。在一些实施例中，第一温度比第二温度高不超过约25℃，并且第一温度等于或小于约89℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高不超过约25℃，并且第一温度等于或小于约88℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高不超过约25℃，并且第一温度等于或小于约87℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高不超过约25℃，并且第一温度等于或小于约86℃。在一些实施例中，第一温度比第二温度高不超过约25℃，并且第一温度等于或小于约85℃。在该段落中描述的任何实施例中，聚合酶可以是bstdna聚合酶，taqdna聚合酶，dna聚合酶i，dna聚合酶，phi29dna聚合酶或任何这些聚合酶的截短或突变形式。在一些实施例中，聚合酶是bstdna聚合酶，并且第一温度选自约68-ꢀ78℃的范围，第二温度选自约55-69℃的范围。具体而言，在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约68℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约68.5℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约69℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约69.5℃，并且第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约70℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约70.5℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约71℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约71.5℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约72℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约72.5℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约73℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约73.5℃，第二温度选自约55-ꢀ69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约74℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约74.5℃，并且第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约75℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约75.5℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约76℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约76.5℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约77℃，第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约77.5℃，并且第二温度选自约55-69℃的范围。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约78℃，第二温度选自约55-69℃的范围。特别地，在本段描述的任何实施例中，从大约55-69℃的范围中选择的第二温度可以是大约55℃，55.5℃，56℃，56.5℃，57℃，57.5℃，58℃，58.5。℃，59℃，59.5℃，60℃，60.5℃，61℃，61.5℃，62℃，62.5℃，63℃，63.5℃，64℃，64.5℃，65℃，65.5℃，66℃，66.5℃，67℃，67.5℃，68℃，68.5℃或69℃。特别地，在本段所述的任何实施例中，bstdna聚合酶可以是野生型bstdna聚合酶，或者是由bstdna聚合酶大片段，bst2.0dna聚合酶，bst2.0warmstartdna聚合酶和bst3.0dna突变或截短的bstdna聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是bstdna聚合酶，并且第一温度选自约68-ꢀ78℃的范围，第二温度选自约55-69℃的范围。具体地，在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约55℃。在聚合酶为bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-ꢀ78℃的范围，第二温度为约55.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约56℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约56.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约57℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约57.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约58℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约58.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约59℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-ꢀ78℃的范围，第二温度为约59.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约60℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约60.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约61℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约61.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约62℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约62.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约63℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-ꢀ78℃的范围，第二温度为约63.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约64℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约64.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约65℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约65.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约66℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约66.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约67℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-ꢀ78℃的范围，第二温度为约67.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约68℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约68.5℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约68-78℃的范围，第二温度为约69℃。特别地，在本段中描述的任何实施例中，从大约68-78℃的范围中选择的第一温度可以是大约68℃，68.5℃，69℃，69.5℃，70℃，70.5℃，71℃，71.5。℃，72℃，72.5℃，73℃，73.5℃，74℃，74.5℃，75℃，75.5℃，76℃，76.5℃，77℃，77.5℃或78℃。特别地，在本段所述的任何实施例中，bstdna聚合酶可以是野生型bstdna聚合酶，或者是由bstdna聚合酶，大片段，bst2.0dna聚合酶，bst2.0warmstartdna聚合酶和bst3.0dna突变或截短的bstdna聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是bstdna聚合酶，第一温度选自约72-76℃的范围，第二温度选自约61-65℃的范围。具体地，在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约72℃，第二温度为约61℃，约62℃，约63℃，约64℃或约65℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约73℃，第二温度为约61℃，约62℃，约63℃，约64℃或约65℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约74℃，第二温度为约61℃，约62℃，约63℃，约64℃或约65℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约75℃，第二温度为约61℃，约62℃，约63℃，约64℃或约65℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约76℃，第二温度为约61℃，约62℃，约63℃，约64℃或约65℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约76℃，第二温度为约62℃。在聚合酶是bstdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约76℃，第二温度为约61℃。特别地，在本段所述的任何实施例中，bstdna聚合酶可以是野生型bstdna聚合酶，或者是突变或截断的bstdna聚合酶，如bstdna聚合酶大片段，bst2.0dna聚合酶，bst2.0warmstartdna聚合酶和bst3.0dna聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是taqdna聚合酶或其截短或突变形式，并且第一温度选自约70-88℃的范围，第二温度选自约58-70℃的范围。具体而言，在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约70℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约70.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约71℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约71.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约72℃，并且第二温度选自约58-ꢀ70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约72.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约73℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约73.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约74℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约74.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约75℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约75.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约76℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约76.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约77℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约77.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约78℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约78.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约79℃，并且第二温度选自约58-ꢀ70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约79.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约80℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约80.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约81℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约81.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约82℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约82.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约83℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约83.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约84℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约84.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约85℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约85.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约86℃，并且第二温度选自约58-ꢀ70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约86.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约87℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约87.5℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度为约88℃，并且第二温度选自约58-70℃的范围。特别地，在本段中描述的任何实施例中，从大约58-70℃的范围中选择的第一温度可以是大约58℃，58.5℃，59℃，59.5℃，60℃，60.5℃，61℃，61.5。℃，62℃，62.5℃，63℃，63.5℃，64℃，64.5℃，65℃，65.5℃，66℃，66.5℃，67℃，67.5℃，68℃，68.5℃，69℃，69.5℃或70℃。特别地，在本段中描述的任何实施例中，taqdna聚合酶可以是野生型taqdna聚合酶，或者是选自hotstarttaqdna聚合酶，epimarkhotstarttaqdna聚合酶的突变或截短的taqdna聚合酶。onetaqdna聚合酶，onetaq热启动dna聚合酶，longamptaqdna聚合酶或longtaqdna聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是taqdna聚合酶或其截短或突变形式，并且第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度选自约70-88℃的范围。58-70℃。具体而言，在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约58℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约58.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约59℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约59.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约60℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约60.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约61℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约61.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约62℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约62.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约63℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-ꢀ88℃的范围，并且第二温度为约63.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约64℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约64.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约65℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约65.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约66℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约66.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约67℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约67.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约68℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约68.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约69℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约69.5℃。在聚合酶是taqdna聚合酶的特定实施例中，第一温度选自约70-88℃的范围，并且第二温度为约70℃。特别地，在本段中描述的任何实施例中，taqdna聚合酶可以是野生型taqdna聚合酶，或者是选自hotstarttaqdna聚合酶，epimarkhotstarttaqdna聚合酶的突变或截短的taqdna聚合酶。onetaqdna聚合酶，onetaq热启动dna聚合酶，longamptaqdna聚合酶或longtaqdna聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是dna聚合酶i或其截短或突变体，第一温度选自约50-60℃的范围，第二温度选自约30-40℃的范围。具体而言，在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约50℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约50.5℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约51℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约51.5℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约52℃，并且第二温度选自约30-ꢀ40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约52.5℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约53℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约53.5℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约54℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约54.5℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约55℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约55.5℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约56℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约56.5℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约57℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约57.5℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约58℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约58.5℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约59℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约59.5℃，并且第二温度选自约30-40℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施方例中，第一温度为约60℃，并且第二温度选自约30-ꢀ40℃的范围。特别地，在本段描述的任何实施例中，第二温度选自大约30-ꢀ40℃的范围，可以是大约30℃，30.5℃，31℃，31.5℃，32℃，32.5℃，33℃，33.5℃，34℃，34.5℃，35℃，35.5℃，36℃，36.5℃，37℃，37.5℃，38℃，38.5℃，39℃，39.5℃或40℃。特别地，在该段落中描述的任何实施例中，聚合酶可以选自野生型dna聚合酶i，dna聚合酶i大片段(klenow)或klenowexo-。在一些实施例中，聚合酶是dna聚合酶i或其截短或突变形式，并且第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度选自约30-40℃的范围。具体而言，在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-ꢀ60℃的范围，并且第二温度为约30℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约30.5℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约31℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约31.5℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约32℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约32.5℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约33℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约33.5℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约34℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约34.5℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约35℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约35.5℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约36℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约36.5℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约37℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约37.5℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约38℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约38.5℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约39℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约39.5℃。在聚合酶是dna聚合酶i的特定实施例中，第一温度选自约50-60℃的范围，并且第二温度为约40℃。特别地，在本段所述的任何实施例中，第二温度选自大约50-60℃的范围，可以是大约50℃，50.5℃，51℃，51.5℃，52℃，52.5℃，53℃，53.5℃，54℃，54.5℃，55℃，55.5℃，56℃，56.5℃，57℃，57.5℃，58℃，58.5℃，59℃，59.5℃或60℃。特别地，在该段落中描述的任何实施例中，聚合酶可以选自野生型dna聚合酶i，dna聚合酶i，大片段(klenow)或klenowexo-。在一些实施例中，聚合酶是dna聚合酶或其截短或突变体，第一温度选自约70-80℃的范围，第二温度选自约55-70℃的范围。具体而言，在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约70℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约70.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约71℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约71.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约72℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约72.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约73℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约73.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约74℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约74.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约75℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约75.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约76℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约76.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约77℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约77.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约78℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约78.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约79℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约79.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约80℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。特别地，在本段所述的任何实施例中，从大约55-70℃的范围中选择的第二温度可以是大约55℃，55.5℃，56℃，56.5℃，57℃，57.5℃，58℃，58.5。℃，59℃，59.5℃，60℃，60.5℃，61℃，61.5℃，62℃，62.5℃，63℃，63.5℃，64℃，64.5℃，65℃，65.5℃，66℃，66.5℃，67℃，67.5℃，68℃，68.5℃，69℃，69.5℃或70℃。特别地，在该段落中描述的任何实施方案中，聚合酶可以是ventdna聚合酶，vent(exo-)dna聚合酶，deepventdna聚合酶或deepvent(exo-)dna聚合酶。在一些实施例中，聚合酶是dna聚合酶或其截短或突变形式，并且第一温度选自约70-80℃的范围，第二温度选自约55-70℃的范围。具体而言，在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约70℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约70.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约71℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约71.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约72℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约72.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约73℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约73.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约74℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约74.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约75℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约75.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约76℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约76.5℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约77℃，并且第二温度选自约55-70℃的范围。在聚合酶是dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约50℃，并且第二温度选自约20-ꢀ37℃的范围。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约50.5℃，并且第二温度选自约20-37℃的范围。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约51℃，并且第二温度选自约20-ꢀ37℃的范围。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约51.5℃，并且第二温度选自约20-37℃的范围。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约52℃，并且第二温度选自约20-ꢀ37℃的范围。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约52.5℃，并且第二温度选自约20-37℃的范围。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约53℃，并且第二温度选自约20-ꢀ37℃的范围。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约53.5℃，并且第二温度选自约20-37℃的范围。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约54℃，并且第二温度选自约20-ꢀ37℃的范围。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约54.5℃，并且第二温度选自约20-37℃的范围。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度为约55℃，并且第二温度选自约20-ꢀ37℃的范围。在一些实施例中，聚合酶是phi29dna聚合酶，并且第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度选自约20-37℃的范围。具体地，在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约20℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约20.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约21℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约21.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约22℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约22.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约23℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约23.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约24℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约24.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约25℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约25.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约26℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约26.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约27℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约27.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约28℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约28.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约29℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约29.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约30℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约30.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约31℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约31.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约32℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约32.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约33℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约33.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约34℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约34.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约35℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约35.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约36℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约36.5℃。在聚合酶是phi29dna聚合酶的特定实施方案中，第一温度选自约40-55℃的范围，并且第二温度为约37℃。特别地，在本段中描述的任何实施例中，从大约40-ꢀ55℃的范围中选择的第一温度可以是大约40℃，40.5℃，41℃，41.5℃，42℃，42.5℃，43℃，43.5℃，44℃，44.5℃，45℃，45.5℃，46℃，46.5℃，47℃，47.5℃，48℃，48.5℃，49℃，49.5℃，50℃，50.5℃，51℃，51.5℃，52℃，52.5℃，53℃，53.5℃，54℃，54.5℃或55℃。在一些实施例中，设计的引物对扩增靶标核酸分子的区域长度小于100bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增产物长度小于90bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增产物长度小于80bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增产物长度小于70bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增产物长度小于60bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增产物长度小于50bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增产物长度约20-50bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增产物长度约30-50bp。在一些实施例中，通过本方法产生的扩增产物长度约35-50bp。在一些实施例中，为减少引物延伸所需的时间，设计引物对以扩增长度为约20bp至约50bp的短扩增片段。扩增片段至少包含与靶标核酸分子中的独特序列相对应的中心部分，该中心部分的两侧可以是与靶标分子中的序列相同或不同的引物序列。例如，在特定的实施例中，扩增片段的长度为约20bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约21bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约22bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约23bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约24bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约25bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约26bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约27bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约28bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约29bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约30bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约31bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约32bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约33bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约34bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约35bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约36bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约37bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约38bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约39bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约40bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约41bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约42bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约43bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约44bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约45bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约46bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约47bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约48bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约49bp。在特定的实施例中，扩增片段的长度为约50bp。在一些实施例中，扩增产物具有等于或低于约90℃的熔解温度(tm或tm值)。在一些实施例中，扩增产物的tm值等于或低于约89℃。在一些实施例中，扩增产物的tm值等于或低于约88℃。在一些实施例中，扩增产物的tm值等于或低于约87℃。在一些实施例中，扩增产物的tm值等于或低于约86℃。在一些实施例中，扩增产物的tm值等于或低于约85℃。在一些实施例中，使用基于扩增产物序列的计算机算法确定扩增产物的tm值。在一些实施例中，基于计算机的算法，基于扩增产物的序列和扩增混合物的一种或多种其他条件，例如但不限于na 的浓度，mg2 的浓度，或扩增混合物中核酸分子的浓度。在一些实施例中，计算机算法选自nupack网络工具(www.nupack.org)，dnamelt网络(http://unafold.rna.albany.edu/？q＝dinamelt)、novopro(www.novopro.cn/tools/rev_comp.html)、ncbi网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)上的blast算法，primerpremier(premierbiosoftinc.,canada)，alignminer(http：//www.scbi.uma.es/alignminer/)、oligo(dbaoligo,inc.,co,us)，perlprimer(http://perlprimer.sourceforge.net/)、primer3web(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)和dnastar(dnastarinc.,wi,us)。在一些实施例中，相对较短的扩增片段使得可以通过在第一温度和第二温度之间快速改变反应温度来进行扩增反应，从而在不到15分钟的时间内产生可检测量的扩增片段。具体而言，在一些实施例中，本方法包括使扩增混合物经历第一温度和第二温度之间的快速热循环处理，其中每个热循环时间小于约20s，或小于约15s，或小于约10s，或小于约8s，或小于约6s，或小于约5s，或小于约4s，或小于约3s，或小于约2s，或小于约1s，或小于约0.5s，或小于约0.1s。在一些实施例中，在每个热循环期间，将扩增混合物在第一温度下孵育不超过5s，在第二温度下孵育不超过5s。在一些实施例中，在每个热循环期间，将扩增混合物在第一温度下孵育不超过2s，在第二温度下孵育不超过2s。在一些实施例中，在每个热循环期间，将扩增混合物在第一温度下孵育少于约1秒，在第二温度下孵育少于约1秒。在一些实施例中，在每个热循环期间，将扩增混合物在第一温度下孵育约0.5秒，在第二温度下孵育约0.5秒。在一些实施例中，在每个热循环期间，将扩增混合物在第一温度下孵育约0.1秒，在第二温度下孵育约0.1秒。在一些实施例中，完成每个热循环的时间长于在第一温度下孵育的时间和在第二温度下孵育的时间的总和，因为需要时间来使反应温度在两个温度之间变化，这种时间间隔在本文中称为“斜坡时间”(即变温时间)。根据本发明，热循环中的总升温时间也包括将反应温度从第一温度降低至第二温度的所需时间和将反应温度从第二温度增加到第一温度的所需时间。在一些实施例中，热循环中的总变温时间小于约10s。在一些实施例中，热循环中的总变温时间小于约5s。在一些实施例中，热循环中的总变温时间小于约2s。在一些实施例中，热循环中的总变温时间小于约1s。在一些实施例中，热循环中的总变温时间小于约0.5s。在示例性实施例中，如实施例9所示，使用具有8℃/s的变温速率的微流控平台运行本方法，在少于8秒(40个热循环)内产生了可检测的特异性扩增。下面提供了可与本方法和系统结合使用的其他示例性方法和仪器。1990年代初期的早期工作确立了使用毛细管和热空气进行温度控制实现快速循环的可行性。在过去的20年中，根据pcr方法的范例，在该领域已进行了大量的工作以改进pcr仪器，特别是热循环仪快速、精确地控制和监测反应温度的能力。科研人员尝试了各种方法和技术以避免或减少由于锥形管壁的热传递效率，低的比表面积或大体积样品的加热而引起的温度变化的延迟。科研人员还通过改良导热材料以及设计新型反应室和加热元件的方法进一步减少变温时间。在一些实施例中，本方法的热循环数约为20至50个循环。在一些实施例中，本方法的热循环数至少为20个循环。在一些实施例中，本方法的热循环数至少为25个循环。在一些实施例中，本方法的热循环数至少为30个循环。在一些实施例中，本方法的热循环数至少为35个循环。在一些实施例中，本方法的热循环数至少为40个循环。在一些实施例中，本方法的热循环数至少为45个循环。在一些实施例中，本方法的热循环数至少为50个循环。在一些实施例中，该方法的总反应时间约为2-20分钟。在一些实施例中，该方法的总反应时间小于20分钟。在一些实施例中，该方法的总反应时间小于15分钟。在一些实施例中，该方法的总反应时间小于10分钟。在一些实施例中，该方法的总反应时间小于7分钟。在一些实施例中，该方法的总反应时间小于5分钟。在一些实施例中，该方法的总反应时间小于2分钟。在一些实施例中，扩增混合物的体积范围为1-30μl。在一些实施例中，扩增混合物为1μl。在一些实施例中，扩增混合物为2μl。在一些实施例中，扩增混合物为3μl。在一些实施例中，扩增混合物为4μl。在一些实施例中，扩增混合物为5μl。在一些实施例中，扩增混合物为6μl。在一些实施例中，扩增混合物为7μl。在一些实施例中，扩增混合物为8μl。在一些实施例中，扩增混合物为9μl。在一些实施例中，扩增混合物为10μl。在一些实施例中，扩增混合物为15μl。在一些实施例中，扩增混合物为20μl。在一些实施例中，扩增混合物为25μl。在一些实施例中，扩增混合物为30μl。在某些实施例中，本方法采用微流控装置。在一些实施例中，本方法采用放大混合物液滴。本公开使用的各种样本，包括但不限于从受试者分离出的生物样本(例如血液样本、唾液样本、口鼻拭子)，含从生物样本中分离提取的核酸分子的样本，或者含有合成核酸分子的样本。在一些实施例中，靶标核酸是dna。在一些实施例中，靶标核酸是rna。本发明预测并证明本方法和试剂盒可用于扩增和检测样品中存在的微量靶标核酸分子。在具体实施例中，扩增混合物含有浓度少于1.0×10-12m的靶标核酸。在具体实施例中，扩增混合物含有浓度少于1.0×10-13m的靶标核酸。在具体实施例中，扩增混合物含有浓度少于1.0×10-14m的靶标核酸。在具体实施例中，扩增混合物含有浓度不多于1.0×10-15m的靶标核酸。在具体实施例中，扩增混合物含有浓度不多于1.0×10-16m的靶标核酸。在具体实施例中，扩增混合物含有浓度不多于1.0×10-17m的靶标核酸。在具体实施例中，扩增混合物含有浓度不多于1.0×10-18m的靶标核酸。在具体实施例中，扩增混合物含有少于1.0×107拷贝的靶标核酸分子。在具体实施例中，扩增混合物含有少于1.0×106拷贝的靶标核酸分子。在具体实施例中，扩增混合物含有少于1.0×105拷贝的靶标核酸分子。在具体实施例中，扩增混合物含有少于1.0×104拷贝的靶标核酸分子。在具体实施例中，扩增混合物含有少于1.0×103拷贝的靶标核酸分子。在具体实施例中，扩增混合物含有少于100拷贝的靶标核酸分子。在具体实施例中，扩增混合物含有少于10拷贝的靶标核酸分子。正如本领域普通技术人员所认可的，本发明的方法和系统可检测样品中存在的微量靶标核酸。为了防止由于漂浮在环境空气中的核酸分子对反应可能造成的污染，在一些实施例中，本方法进一步包括一些步骤以防止或减少可能出现的污染造成的影响。尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)是一种催化水解尿嘧啶和糖残基之间的n-糖基键，释放游离的尿嘧啶，并在含尿嘧啶的单链或双链dna中留下嘧啶二酮位点，易被水解破坏的酶。udg对含单链和双链尿嘧啶(du)的dna有活性，但dutps并非udg的底物。udg可用于特异性降解由先前的扩增反应产生的核酸(残留污染物的常见来源)。在一些实施例中，udg能够降解先前的扩增产物或错误的引物延伸产生的非特异性产物，而保留原本打算用于扩增的天然核酸模板。因此，在一些实施例中，扩增混合物包含用于执行扩增反应的dutps。在特定的实施例中，扩增混合物中包含尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)以进行反应。在特定的实施例中，扩增混合物中同时包含dutps和udg以进行反应。在将dutps用于扩增的一些实施例中，扩增混合物不包含dttps。这里的引物可以结合本方法使用，例如第4.3节描述的引物和根据示实施例7描述的示例性流程设计的引物。特别是在一些实施例中，扩增反应包含一对用于确定靶标核酸分子的约20～50bp扩增区域的引物。特别是在一些实施例中，存在于扩增混合物中的至少一条引物的浓度不低于1.0×10-6m。在一些实施例中，存在于扩增混合物中的至少一条引物的浓度不低于1.5×10-6m。在一些实施例中，存在于扩增混合物中的至少一条引物的浓度不低于2.0×10-6m。在一些实施例中，存在于扩增混合物中的至少一条引物的浓度不低于2.5×10-6m。在一些实施例中，存在于扩增混合物中的至少一条引物的浓度不低于3.0×10-6m。在一些实施例中，存在于扩增混合物中的所有引物的浓度不低于1.0×10-6m。在一些实施例中，存在于扩增混合物中的所有引物的浓度不低于1.5×10-6m。在一些实施例中，存在于扩增混合物中的所有引物的浓度不低于2.0×10-6m。在一些实施例中，存在于扩增混合物中的所有引物的浓度不低于2.5×10-6m。在一些实施例中，存在于扩增混合物中的所有引物的浓度不低于3.0×10-6m。具体而言，在一些实施例中，一条引物的熔解温度(tm或tm值)在所述方法使用的第二温度±6℃内。一条引物的tm值在所述方法使用的第二温度±5℃内。在一些实施例中，一条引物的tm值在所述方法使用的第二温度±4℃内。在一些实施例中，一条引物的tm值在所述方法使用的第二温度±3℃内。在一些实施例中，一条引物的tm值在所述方法使用的第二温度±2℃内。在一些实施例中，一条引物的tm值在所述方法使用的第二温度±1℃内。在一些实施例中，一条引物的tm值在所述方法使用的第二温度±0.5℃内。在一些实施例中，所有引物的tm值在所述方法使用的第二温度±6℃内。所有引物的tm值在所述方法使用的第二温度±5℃内。在一些实施例中，所有引物的tm值在所述方法使用的第二温度±4℃内。在一些实施例中，所有引物的tm值在所述方法使用的第二温度±4℃内。在一些实施例中，所有引物的tm值在所述方法使用的第二温度±3℃内。在一些实施例中，所有引物的tm值在所述方法使用的第二温度±1℃内。在一些实施例中，所有引物的tm值在所述方法使用的第二温度±0.5℃内。在一些实施例中，该方法中采用的第一温度在扩增产物的tm值的±6℃以内。在一些实施例中，该方法中采用的第一温度在扩增产物的tm值的±5℃以内。在一些实施例中，该方法中采用的第一温度在扩增产物的tm值的±4℃以内。在一些实施例中，该方法中采用的第一温度在扩增产物的tm值的±3℃以内。在一些实施例中，该方法中采用的第一温度在扩增产物的tm值的±2℃以内。在一些实施例中，该方法中采用的第一温度在扩增产物的tm值的±1℃以内。在一些实施例中，该方法中采用的第一温度在扩增产物的tm值的±0.5℃以内。在一些实施例中，该方法中采用的第一温度与扩增产物的tm值大约相同。在该段落中描述的特定实施例中，该方法中采用的第二温度在至少一个引物的tm值的±6℃之内。在该段落中描述的特定实施例中，该方法中采用的第二温度至少在一个引物的tm值的±6℃以内，±5℃以内，±4℃以内，±3℃以内，±2℃以内，±1℃以内或±0.5℃以内。在该段落中描述的特定实施例中，该方法中使用的第二温度与该方法中使用的至少一种引物的tm值大约相同。在该段落中描述的特定实施例中，一对引物的tm值大约相同。在该段落中描述的特定实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约3℃，约2℃，约1℃或约0.5℃。在一些实施例中，该方法中使用的一对引物各自具有熔解温度。一对引物的两个tm值的平均值称为一对引物的平均熔解温度。特别地，在一些实施方案中，该方法中使用的第二温度在该方法中使用的一对引物的平均熔解温度的±6℃以内。在一些实施方案中，该方法中使用的第二温度在该方法中使用的一对引物的平均熔解温度的±5℃以内。在一些实施方案中，该方法中使用的第二温度在该方法中使用的一对引物的平均熔解温度的±4℃以内。在一些实施方案中，该方法中使用的第二温度在该方法中使用的一对引物的平均熔解温度的±3℃以内。在一些实施方案中，该方法中使用的第二温度在该方法中使用的一对引物的平均熔解温度的±2℃以内。在一些实施方案中，该方法中使用的第二温度在该方法中使用的一对引物的平均熔解温度的±1℃以内。在一些实施方案中，该方法中使用的第二温度在该方法中使用的一对引物的平均熔解温度的±0.5℃以内。在一些实施例中，该方法中使用的第二温度与该方法中使用的一对引物的平均熔解温度大致相同。在该段落中描述的特定实施例中，一对引物的tm值大约相同。在该段落中描述的特定实施例中，一对引物的tm值彼此相差小于约3℃，约2℃，约1℃或约0.5℃。在该段落中描述的特定实施例中，该方法中采用的第一温度在扩增产物tm值的±6℃以内，±5℃以内，±4℃以内，±3℃以内，±2℃以内，±1℃以内或±0.5℃以内。在该段落中描述的特定实施例中，该方法中采用的第一温度与扩增产物的tm值大致相同。用于确定核酸(例如，寡核苷酸引物或扩增产物)的tm值的方法是本领域已知的。例如，本领域已知能够基于核酸序列和/或环境条件(例如盐浓度)确定tm值的各种计算机算法。可用于确定核酸的tm值的示例性计算机算法或软件包括但不限于nupack网络工具(www.nupack.org)，dnamelt网络(http://unafold.rna.albany.edu/？q＝dinamelt)，novoprowww.novopro.cn/tools/rev_comp.html)、ncbi网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)上的blast算法，primerpremier(premierbiosoftinc.,canada)，alignminer(http://www.scbi.uma.es/alignminer/)、oligo(dbaoligo，inc.，co，us)，perlprimer(http://perlprimer.sourceforge.net/)、primer3web(http://bioinfo.ut.ee/primer3/)和dnastar(dnastarinc.,wi,us)。在一些实施方案中，可用于确定核酸的tm值的计算机算法或软件选自nupack网络工具(www.nupack.org)，dnamelt网络(http://unafold.rna.albany.edu/？q＝dinamelt)，novoprowww.novopro.cn/tools/rev_comp.html)和ncbi网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)上的blast算法。在一些实施例中，本方法还包括确定将通过该方法产生的扩增产物的tm值。在一些实施例中，本方法还包括确定该方法中使用的至少一种引物的tm值。在一些实施例中，本方法进一步包括确定将在该方法中使用的两种引物的tm值。在一些实施例中，本方法还包括确定将在该方法中使用的两个引物的tm值，并且还包括确定将在该方法中使用的一对引物的平均熔解温度。在一些实施例中，基于引物或扩增产物的序列，使用计算机算法确定引物或扩增产物的tm值。在一些实施例中，基于引物或扩增产物的序列和扩增混合物的一种或多种其他条件，例如但不限于na 的浓度，mg2 的浓度或扩增混合物中核酸分子的浓度，使用计算机算法确定引物或扩增产物的tm值。这里提到的聚合酶，可以结合本方法使用，例如第4.4节描述的聚合酶。具体而言，在一些实施例中，聚合酶是本文所述的耐热聚合酶。在一些实施例中，扩增混合物中含有浓度不低于0.1u/μl的聚合酶。在一些实施例中，扩增混合物中含有浓度不低于0.2u/μl的聚合酶。在一些实施例中，扩增混合物中含有浓度不低于0.3u/μl的聚合酶。在一些实施例中，扩增混合物中含有浓度不低于0.4u/μl的聚合酶。在一些实施例中，扩增混合物中含有浓度不低于0.5u/μl的聚合酶。在一些实施例中，扩增混合物中含有浓度不低于1u/μl的聚合酶。在一些实施例中，该聚合酶的最佳温度在本方法使用的第一温度和第二温度之间。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第二温度±6℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第二温度±5℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第二温度±4℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第二温度±3℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第二温度±2℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第二温度±1℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第二温度±0.5℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第一温度±5℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第一温度±4℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第一温度±3℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第一温度±2℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第一温度±1℃。在某些实施例中，聚合酶的最佳温度为该方法所使用的第一温度±0.5℃。在一个具体的实施例中，本发明公开了一种在样品中扩增靶标核酸分子的方法：将bstdna聚合酶和一对寡核苷酸引物与样品接触，从而形成扩增混合物，从约76℃、约75℃、约74℃、约73℃、约72℃中选择第一温度，约61℃、约62℃、约63℃、约64℃和约65℃中选择了第二温度进行多次热循环，其中每个热循环包括在第一温度下孵育所述扩增混合物不超过1s并且在所述第二温度下孵育所述扩增不超过1s，总孵育时间不超过2s，从而在10分钟内产生约20-50碱基对(bp)长度的扩增片段。具体而言，在本实施例中，目标核酸在样品中的浓度小于1.0×10-14m。更具体地说，在本实施例中，样品中的靶标核酸浓度小于1.0×10-15m、小于1.0×10-16m、小于1.0×10-17m或小于1.0×10-18m。具体而言，在本实施例中，目标核酸在样品中的浓度少于1.0×105拷贝。进一步具体地说，在本实施例中，样品中的目标核酸浓度少于1.0×104拷贝，少于1.0×103拷贝，少于100拷贝或少于10拷贝。本方法生产的扩增片段可以使用本领域已知的方法检测，例如荧光检测、比色检测和电泳检测。用于实时监测pcr扩增的常规方法也可用于本方法对扩增的实时监测。具体而言，在一些实施例中，在每个热循环期间都能检测扩增量。在其它实施例中，每2、5或10个热循环检测扩增量。扩增产物可以从扩增混合物中纯化，并进行序列分析，如下一代测序，以确定靶标核酸的序列、来源和分子性质。这种对扩增产物的检测和分析可进一步作为与靶标核酸及其来源(例如含有靶标核酸的生物样本和提供生物样本的受试者)有关的各种分析和诊断的基础。作为一个非限制性的例子，本文公开的方法和试剂盒可用于检测病原体是否存在于生物样本中。例如，该方法和试剂盒可以针对病原体的基因组中独特序列的扩增区域设计引物，以检测生物样品中独特序列的存在。例如，这些方法可用于诊断由病原体引起的传染病，检测生物样本中的掺假或病原体污染，食品和饮料的质量控制等。作为本文公开的另一个非限制性实例，本文公开的方法和试剂盒可用于检测受试者的遗传改变。具体而言，用于包括但不限于受试者中单核苷酸多态性以及归因于点突变的遗传疾病的检测。例如，该方法和试剂盒可以针对已知或容易发生此类突变的基因组序列中的扩增区域设计引物，通过对扩增产物的测序分析以检测突变的存在。在阅读本公开之后，本文公开的方法和试剂盒的其他可能的应用对于本领域普通技术人员容易理解，并且其他可能的用途和应用也在本公开的考虑之内并且包括在本公开中。因此，在另一方面，本文提供了一种检测样品中的靶标核酸的方法，该方法包括使聚合酶和一对寡核苷酸引物与样品混合，从而形成扩增混合物，使扩增混合物在第一温度和第二温度之间多次热循环，从而通过聚合酶链式反应扩增至少一部分靶标核酸，并检测扩增混合物中是否存在扩增产物。在一些实施例中，第一温度选自约68℃至78℃的范围。在一些实施例中，第二温度选自约55℃至69℃的范围。在一些实施例中，一对寡核苷酸引物被设计产生约20-50bp长的扩增产物。在一些实施例中，聚合酶选自bstdna聚合酶、dna聚合酶i大片段(klenow)和dna聚合酶，或其突变或截短形式。在一些实施例中，扩增混合物还包含dntps和聚乙二醇。在一些实施例中，扩增产物的检测是通过荧光检测、比色检测或本领域已知的其它方法进行的。例如，在一些实施例中，本方法还提供对扩增的实时监测。特别在一些实施例中，在每1个热循环测量产生的扩增量。在其它实施例中，每2、5或10个热循环检测扩增量。利用传统的实时监测pcr扩增方法可以实现对扩增产物数量的检测和测量。另一方面本发明提供了一种用于诊断受试者病原体感染的方法，该方法包括使聚合酶和一对寡核苷酸引物与样品接触，从而形成一个扩增混合物，寡核苷酸引物被设计成在病原体基因组中扩增出一个独特的序列；使扩增混合物在第一温度和第二温度之间多次热循环，从而通过聚合酶链式反应产生扩增产物；以及检测扩增混合物中扩增产物的是否存在。在一些实施例中，第一温度选自约68℃至78℃的范围。在一些实施例中，第二温度选自约55℃至69℃的范围。在一些实施例中，扩增产物的长度为约20-50bp。在一些实施例中，聚合酶选自bstdna聚合酶、dna聚合酶i大片段(klenow)、和ventdna聚合酶，或其突变或截短形式。在一些实施例中，扩增混合物还包含dntp和聚乙二醇。在一些实施例中，样品是受试者的基因组核酸。在一些实施例中，样品是受试者的游离核酸分子。在一些实施例中，样品是体液样品。在一些实施例中，病原体是微生物，例如病毒，细菌或真菌。在一些实施例中，病原体是寄生虫，例如原生动物，蠕虫或体外寄生虫。在另一方面，本文提供了一种用于检测受试者的遗传改变的方法，该方法包括使聚合酶和一对寡核苷酸引物与样品接触，从而形成扩增混合物，该对寡核苷酸引物被设计为能够扩增具有或疑似遗传改变的靶标序列；使扩增混合物在第一温度和第二温度之间多次热循环，从而通过聚合酶链式反应产生扩增产物；并对扩增产物进行测序，以确定是否存在遗传改变。在一些实施例中，第一温度选自约68℃至78℃的范围。在一些实施例中，第二温度选自约55℃至69℃的范围。在一些实施例中，扩增子的长度为约20-ꢀ50bp。在一些实施例中，聚合酶选自bstdna聚合酶，dna聚合酶i大片段(klenow)和dna聚合酶，或其突变或截短形式。在一些实施例中，扩增混合物还包含dntps和聚乙二醇。在一些实施例中，遗传改变是基因突变，例如插入，缺失，取代或拷贝数变异。在一些实施例中，遗传改变是单核苷酸多态性。在一些实施例中，该方法进一步包括与遗传改变有关的遗传状况的诊断或预后。4.6试剂盒另一方面，本公开还提供了用于实行本方法的试剂盒。该试剂盒包含多种组分，这些组分在扩增混合物中混合在一起或包含在至少两个单独的容器中。在一些实施例中，试剂盒包含聚合酶和一对核苷酸引物。本文提供的引物(例如在4.3节中描述的引物和根据实施例7描述的示例性程序设计的引物)以及本文提供的聚合酶(例如在4.4节中描述的聚合酶)可以与本试剂盒配合使用。在一些实施例中，试剂盒包含dntps和适用于聚合酶的缓冲溶液。缓冲溶液可提供促进聚合酶活性的离子浓度，ph和/或辅酶。选择和制备适合特定聚合酶的缓冲溶液的方法是本领域已知的。例如，市售的聚合酶通常搭配适当缓冲液的推荐配方出售。在一些实施例中，试剂盒还包含聚乙二醇(peg)。在一些实施例中，聚乙二醇是peg200，peg400，peg2000或peg4000。在一些实施例中，试剂盒还包含甘油。在一些实施例中，试剂盒还包含能够促进双链在靶标核酸中的引物退火的位置附近解链的试剂，如单链结合蛋白(ssb)。在一些实施例中，ssb在执行本方法的温度范围内稳定并且有活性。在具体的实施例中，ssb源自微生物，例如细菌或噬菌体。在具体的实施例中，本试剂盒包含选自t4噬菌体32ssb，t7噬菌体2.5ssb，噬菌体29ssb或大肠杆菌ssb。在一些实施例中，试剂盒还包含用于检测和定量扩增产物的试剂，例如荧光染料或ph指示剂。适用于该目的的试剂是本领域已知的，例如，某些荧光染料(例如，evagreen)在与双链扩增产物结合时发出更强的荧光信号，并且扩增反应发出的荧光信号的强度能够反应产生的扩增产物的量。在一些实施例中，试剂盒进一步包括使用试剂盒的说明书。例如在一些实施例中，试剂盒的各种组分以混合物的形式提供，并且试剂盒包括用于添加合适量的样品以形成扩增混合物的说明书。或者在一些实施例中，在至少两个单独的容器中提供试剂盒的各种组分，并且该试剂盒包括将组分在分开的容器中与合适量的样品混合以形成扩增混合物的说明。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含浓度不小于0.1u/μl的聚合酶。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含浓度不小于0.2u/μl的聚合酶。在具体的实施例中，该说明书指定扩增混合物包含浓度不小于0.3u/μl的聚合酶。在具体的实施例中，该说明书指定扩增混合物包含浓度不小于0.4u/μl的聚合酶。在具体的实施例中，该说明书指定扩增混合物包含浓度不小于0.5u/μl的聚合酶。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含浓度不小于1u/μl的聚合酶。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含浓度不小于1.0×10-6m的至少一种引物。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含浓度不小于1.5×10-6m的至少一种引物。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含浓度不小于2.0×10-6m的至少一种引物。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含浓度不小于2.5×10-6m的至少一种引物。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含浓度不小于3.0×10-6m的至少一种引物。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含两种引物，每种引物的浓度均不少于1.0×10-6m。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含两个引物，每个引物的浓度均不少于1.5×10-6m。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含两个引物，每个引物的浓度均不少于2.0×10-6m。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含两个引物，每个引物的浓度均不少2.5×10-6m。在具体的实施例中，该说明书指定扩增混合物包含两个引物，每个引物的浓度均不少于3.0×10-6m。在具体的实施例中，说明书指明扩增混合物应包括至少1.0×10-13m的靶标核酸。在具体的实施例中，说明书指明扩增混合物应包括至少1.0×10-14m的靶标核酸。在具体的实施例中，说明书指明扩增混合物应包括至少1.0×10-15m的靶标核酸。在具体的实施例中，说明书指明扩增混合物应包括至少1.0×10-16m的靶标核酸。在具体的实施例中，说明书指明扩增混合物应包括至少1.0×10-17m的靶标核酸。在具体的实施例中，说明书指明扩增混合物应包括至少1.0×10-18m的靶标核酸。在具体实施例中，说明书指明扩增混合物包含不超过10拷贝的靶标核酸分子。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少0.5％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含按体积分数约0.5％-10％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少约0.5％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少约1％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少约1.5％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少约2％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少约2.5％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少约3％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少约3.5％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少约4％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少约4.5％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少约5％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含体积分数至少约10％的peg。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含约1-50μg/ml的ssb。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含约1μg/ml的ssb。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含约5μg/ml的ssb。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含约12.5μg/ml的ssb。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含约25μg/ml的ssb。在具体的实施例中，该说明书指明扩增混合物包含约50μg/ml的ssb。在具体实施例中，该说明书指明扩增混合物的体积为约1-30μl。在具体实施例中，该说明书进一步指明可以将扩增混合物加载到微流体装置上以进行pcr反应。在一些实施例中，试剂盒进一步包括用于使扩增混合物在热循环方案下进行pcr的说明书。在具体实施例中，热循环方案包括多个热循环，其中每个热循环包括在第一温度下的孵育和在第二温度下的孵育。在具体实施例中，第一温度范围为68-78℃，第二温度范围为55-69℃。在一些实施例中，每个热循环还包括小于10s的变温时间。在一个具体的实施例中，热循环方案包括在约72-76℃的范围内的第一温度下孵育约1s，在约61-65℃的范围内的第二温度下孵育约1s，以及小于2s的升温时间，总反应时间小于8分钟。5.实施例下面描述与本发明有关的实施例在大多数情况下可以使用其他技术替代。实施例旨在说明而不是限制本发明的范围。例如，在按照所述方案制备pcr反应体系时，条件可以变化，例如，任何溶剂、反应时间、试剂、温度、补充剂、反应条件或其他反应参数都可以变化。例如，可以使用不同的方法检测靶标序列的pcr扩增过程，并且在不需要实时监测pcr扩增的情况下，扩增混合物中不需要包含荧光染料。而且，尽管在以下实施例中待检测的核酸靶标来源于微生物，但是当前方法和系统的应用不仅限于此，而是可以应用于检测其他类型的遗传样品，例如源自哺乳动物的遗传物质。此外，尽管在下面的案例中使用了试剂盒的组分，但是，这些具体设计不是唯一或最佳的。试剂类型、体积、浓度、包装也是可变化的。可以认为，本公开不限于所描述的具体方法、方案和试剂，因为以上可以根据本领域技术人员参照上下文的使用情况而变化。通用方法：除非另有说明，否则以下实施例中的方法和设备是相关领域中用于相似研究的常规方法和设备。除非另有说明，否则以下示例中使用的测试材料是从生化试剂商店或其他商业供应商处购买的。所有涉及dna、rna和蛋白质等生物分子的分子生物学和pcr反应均使用标准化的平板、小瓶和ep管。商业试剂按要求使用。在以下实施例中，使用购自天根生化技术(北京)有限公司(中国北京，目录号dp422)的dna/rna提取试剂盒提取基因组dna或rna样品。等温反应缓冲液的溶剂是纯净水，其溶质和浓度如下：20mmtris-hcl，10mmkcl，10mm(nh4)2so4，2mmmgso4，0.1％tritonx-100；25℃时的ph值为8.8。定量研究的结果基于至少三个重复实验。5.2实施例1：快速链置换扩增(sea)反应体系的引物浓度优化。进行了以下研究以测试引物浓度对快速sea反应的扩增速率的影响。基于单增李斯特菌16srrna编码基因的高变区域的靶标核酸序列，通过nupack软件(www.nupack.org/)设计了一对特异性引物。，靶标序列是具有以下序列的50bp合成片段：5'-ꢀgggtcattggaaactggaagactggagtgcagaagaggagagtggaattc-3'(seqidno:1),引物序列分别是：3.0×10-6m的引物和最终浓度为0.16u/μl，0.20u/μl、0.24u/μl和0.28u/μl(分别对应于0.20μl、0.25μl、0.30μl和0.35μl的8u/μl酶贮存液)的聚合酶。还设置了用等量水代替单增李斯特菌基因组材料，其他成分相同的扩增混合物为阴性对照组(ntc)。表2:用于优化聚合酶浓度的快速sea扩增体系成分表表2:用于优化聚合酶浓度的快速sea扩增体系成分表为了进行快速sea反应，使用cfxconnecttm实时pcr系统(bio-ꢀrad，ca)使扩增混合物在76℃和62℃之间进行快速热循环。每个热循环由以下步骤组成：首先，扩增混合物在76℃下孵育1s，紧接着降至62℃并孵育1s，然后再升回76℃。为了实时监测扩增并缩短扫描荧光的时间，每2个热循环扫描一次扩增混合物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图3)。如图所示，对于包含浓度为0.24u/μl或0.28u/μl的聚合酶的反应，快速sea反应在不到20分钟的时间内产生了可检测的靶标序列的扩增。将聚合酶浓度从0.24u/μl增加到0.28u/μl时，进一步显著提高了扩增效率和速率，将样品中靶标核酸检测所需的时间从15分钟内缩短到10分钟以内。5.4实施例3：快速链置换扩增(sea)反应系统的热循环优化。进行以下研究以测试变性温度对快速sea反应的扩增效率和扩增速率的影响。如以上实施案例1中所述制备扩增体系，其中引物浓度保持在3.0×10-6m，聚合酶浓度保持在0.24u/μl。然后使扩增体系经受不同的热循环以进行pcr反应，并评估不同温度对扩增效率和速率的影响。在每个热循环中，将扩增体系在较高的变性温度下孵育1s，然后立即在较低的延伸温度下再孵育1s。可以基于选用的dna聚合酶来选择较低的延伸温度。在这些研究中，将延伸温度设置为62℃，在此温度下，bstdna聚合酶活性最佳。不受理论的束缚，可以预期的是，轻微的温度差异可能会显著影响双链核酸样品中变性泡打开的速率和持续时间，进而会影响扩增的效率和速率。在这些研究中，测试并比较了74℃、75℃、76℃、77℃和78℃五个变性温度。阴性对照组(ntc)除用水代替单增李斯特菌基因组材料外，其余成分与含量均相同。例如，介于76℃和62℃之间的每个热循环是由将扩增体系在76℃孵育1s，然后立即将温度降至62℃孵育1s，然后立即将温度升回76℃。对于每个快速sea反应，热循环重复至少35个循环。为了实时监控扩增，每2个热循环扫描一次扩增体系发出的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图4)。如图所示，当变性温度在74℃至76℃之间时，快速sea反应在20分钟内即可检测到靶标序列的扩增信号。在所有测试温度中，变性温度为76℃为最优温度，从而使样品中靶标核酸所需的检测时间最短。5.5实施案例4：样品中dna分子的扩增和检测。进行以下研究以测试快速sea方法检测生物样品中dna分子的能力。基于靶标核酸序列，通过nupack软件(www.nupack.org/)设计了一对特异性引物。其中，靶标序列是:5'-ꢀgggtcattggaaactggaagactggagtgcagaagaggagagtggaattc-3'(seqidno:1),引物序列分别是：primer1:5'-gtcattggaaactggaagactg-3'(m58822.1b)(seqidno:2)；primer2:5'-ccactctcctcttctgcac-3'(m58822.1b)(seqidno:3).引物和靶标片段dna分子是化学合成的(生工生物工程股份有限公司，上海，中国)，并与其他pcr反应物混合以形成10μl扩增体系，如下表3所示。具体而言，制备了两个部分的扩增混合物，分别包含1.0×10-12m的合成靶标dna片段或0.8ng/μl单增李斯特菌基因组材料。引物浓度为3.0×10-6m，聚合酶浓度为0.24u/μl，还设置了用等量水代替单增李斯特菌基因组材料，其他成分相同的扩增混合物为阴性对照组(ntc)。表3:dna扩增体系成分表名称终浓度primer13.0×10-6mprimer23.0×10-6m合成靶标dna1.0×10-12mdntps8mm等温反应缓冲液1×evagreen20×etssb5μg/mlbstdna聚合酶0.24u/μl聚乙二醇200100％纯水补充至10μl为了进行快速sea反应，使用cfxconnecttm实时pcr系统(bio-ꢀrad，ca)使扩增体系在76℃和62℃之间进行快速热循环。每个热循环由以下步骤组成：首先，扩增体系在76℃下孵育1s，紧接着降至62℃并孵育1s，然后再升回76℃。为了实时监测扩增并缩短扫描荧光的时间，每2个热循环扫描一次扩增体系的荧光信号，并绘制如随时间变化的荧光曲线图(图5)。如图所示，快速sea方法能够在所提供的靶标浓度下，在10分钟内有效地检测出单增李斯特菌相关的合成dna片段和基因组核酸，表明可以使用本方法和试剂盒对病原体感染进行即时诊断。5.6实施例5：样品中rna分子的扩增和检测。进行了以下研究以测试快速sea方法检测生物样品中rna分子的能力。具体而言，如上所述针对具有以下序列的靶rna序列设计了相同的引物(seqidno：2和3)5’-ꢀgggtcauuggaaacuggaagacuggagugcagaagaggagaguggaauuc-3’ꢀ(seqidno:7)如上所述制备引物并合成rna靶标分子，并与其他pcr反应物混合以形成10μl扩增体系，如下表4所示，配制三部分的扩增混合物，分别包含浓度为3.0×10-6m的引物，浓度为0.24u/μl的聚合酶和浓度为1.0×10-12m的靶标rna分子。还设置了用等量水代替单增李斯特菌基因组材料，其他成分相同的扩增混合物为阴性对照组(ntc)。表4:rna扩增体系成分表名称终浓度primer13.0×10-6mprimer23.0×10-6m合成靶标rna1.0×10-12mdntps8mm等温反应缓冲液1×evagreen20×etssb5μg/mlbstdna聚合酶0.24u/μl聚乙二醇200100％纯水补充至10μl为了进行快速sea反应，使用cfxconnecttm实时pcr系统(bio-ꢀrad，ca)使扩增体系在76℃和62℃之间进行快速热循环。每个热循环由以下步骤组成：首先，将扩增体系在76℃下孵育1s，并且在立即将扩增体系在62℃下孵育另外1s，然后将温度升回76℃。为了实时监控扩增，每2个热循环扫描一次扩增体系的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图6a)。如图所示，使用具有逆转录酶活性的bstdna聚合酶，快速sea方法能够在约10分钟内有效地检测所述浓度的靶标rna分子。在三个重复对照反应中，扩增产物在大约同一时间到达指数期，且在阴性对照组中未检测到扩增，表明该方法和反应体系具有高度可重复性和稳定性。最后，为了验证观察到的荧光信号的增加对应于靶标rna分子的特异性扩增，在反应完成之后，选用12.5％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳检查扩增产物。电泳结果如图6b所示，显示了快速sea反应产生了预期的扩增片段(长度为43bp)，并且阴性反应(ntc)的结果没有出现目标条带。泳道m为梯度分子量dna标记(dnaladder)，图中标注了大小为20bp和40bpdna片段的对应条带。5.7实施例6：恒温条件下的等温sea反应与快速热循环条件下的快速sea反应的比较以下研究以比较在恒温条件下进行的等温sea反应(如cn109136337a中所述的程序)和在当前快速热循环条件下的快速sea反应。具体而言，按照上述方法针对同一的单增李斯特菌基因组(seqidno：1)靶标序列设计了相同的引物(seqidno：1和2)。根据上文提到的方法获得引物和单增生李斯特菌基因组材料，并与其他pcr反应物混合以形成10μl扩增混合物，成分如下表5所示。此外，本研究设置了一系列含有不同初始浓度(1.0×10-11m，1.0×10-12m，1.0×10-13m，1.0×10-14m，1.0×10-15m，1.0×10-16m，1.0×10-17m或1.0×10-18m)的50bp合成单增生李斯特菌基因组序列片段的反应混合物，以比较两种方法在扩增和检测样品中存在的痕量靶标核酸时的速率和灵敏度。该反应还设置了用等量水代替单增李斯特菌基因组材料，其他成分相同的扩增混合物为阴性对照组(ntc)。表5:用于灵敏度检测的扩增反应混合物成分表5:用于灵敏度检测的扩增反应混合物成分如上文实施例1中所述，使用cfxconnecttm实时pcr系统(bio-ꢀrad，ca)将扩增反应体系进行76℃至62℃之间的快速热循环，以进行快速sea反应。具体步骤如下，每个热循环由以下步骤组成：将扩增混合物在76℃下孵育1s，随后立即降低温度至62℃，在62℃孵育1s后立即将温度升至76℃。为了实现对扩增过程进行实时监控，每2个热循环扫描一次扩增反应混合物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图7a)。(1.0×10-11m，1.0×10-12m，1.0×10-13m和1.0×10-14m样本的数据未列出)。此外，为了验证观察到的荧光信号的增加对应于特异性扩增，在反应完成之后，将扩增混合液加样到12.5％的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳以检查扩增产物。图7b是page凝胶的照片，照片显示含浓度为1.0×10-15m，1.0×10-16m，1.0×10-17m和1.0×10-18m原始靶标的加速sea反应混合物产生了预期的扩增片段(长度为43bp)，并且阴性反应(ntc)的结果没有出现目标条带。泳道m为梯度分子量dna标记(dnaladder)，图中标注了大小为20bp和40bpdna片段的对应条带。使用cfxconnecttm实时pcr系统(bio-rad，ca)在62℃条件下对扩增混合物进行孵育，以在恒温下进行等温sea反应。为了实现对扩增过程进行实时监控，每分钟对扩增产物的荧光信号进行扫描，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图7c，1.0×10-16m，1.0×10-17m和1.0×10-18m样本的数据未列出)。如图7a和7c所示，两种方法的荧光信号与扩增反应体系中初始靶标浓度均显示出良好线性关系。即初始样品中存在的靶标量越多，该方法产生可检测的靶标分子的扩增产物所花费的时间就越少。值得注意的是，在检测速率和灵敏度方面，快速sea方法(在快速热循环条件下)的性能明显优于等温sea方法(在恒定温度条件下)。具体而言，如图7c所示，靶标浓度为1.0×10-15m时，等温sea方法大约需要1个小时才能产生可检测的扩增产物，而如图7a所示，快速sea方法在15分钟内的即可在所有浓度条件下产生可检测的测试靶标的扩增产物。因此，与等温sea方法相比，快速sea方法将检测时间减少了约75％，从而将检测时间缩短至15分钟。此外，如图7c所示，在20分钟的反应时间内，等温sea方法能够检测样品中1.0×10-12m或更高浓度的靶标分子，而如图7a所示，快速sea方法能够检测浓度低至1.0×10-18m的靶标分子(该浓度的样品中靶标核酸仅有数个拷贝)。因此，对于15至20分钟的反应，快速sea方法将检测灵敏度提高了至少106倍。5.8实施例7：引物设计使用nupack网络工具(www.nupack.org)，dnameltweb(http：//unafold.rna.albany.edu/？q＝dinamelt)、novoprowww.novopro.cn/tools/rev_comp.html)以及ncbi网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)上的blast算法进行引物设计和评估。dna引物由personal生物技术有限公司(中国上海)合成。sea检测试剂盒购自navid生物技术有限公司(中国，青岛)。dna提取试剂盒购自天根生物技术有限公司(中国北京)。其他试剂和缓冲液均为分析纯级别。传统pcr反应：根据制造商提供的说明书，使用tianampdna提取试剂盒(北京天根生物技术有限公司，北京)提取肺炎支原体，沙眼衣原体，猪肉，蜡状芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌的基因组dna。使用cfxconnecttm实时pcr系统(美国加利福尼亚州bio-rad)进行实时定量pcr。反应体系如下：总体积为50μl，包含20ng基因组dna模板，1μl正向引物和反向引物(10μm)，1.5μldntps(2.5mm)，0.25μltaq聚合酶和5μl标准taq反应缓冲液。反应步骤包括94℃变性5分钟，35个热循环(94℃孵育30s，60℃孵育30s，72℃孵育90s)进行扩增，最后在72℃延伸10min。sea反应：sea反应在10μl体系中进行，该系统包含1μl模板，两种引物各1.5μl(10μm)，5μl2×反应缓冲液和0.25×evagreen。为了排除提取的基因组dna纯度的影响，如无其他说明，使用靶标序列的pcr产物(1pm)作为模板进行实验。将反应混合物分别在57℃,59℃,61℃,63℃和65℃的恒温条件下孵育60分钟，并通过cfxconnecttm实时pcr系统(美国加利福尼亚州bio-rad)每分钟检测一次扩增产物的荧光信号。另外，使用不包含靶标的反应混合物(ntc)作为阴性对照。5.7.1反应温度和引物tm值的优化以下实施例提供了用于给定的聚合酶条件下选择最佳反应温度及适合该反应条件的引物的示例性方法。具体步骤如下：设计并合成多种具有不同tm值(65℃，63℃，61℃，59℃或57℃)的肺炎支原体16srrna编码基因特异性引物(mp1-mp5)(表6)。选用bst2.0warmstartdna聚合酶在57℃，59℃，61℃，63℃或65℃的恒温条件下进行一系列sea反应。为了实现对扩增过程进行实时监控，每秒扫描一次扩增混合物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图10)。表6.肺炎支原体(m.pneumoniae*)16srrna编码基因特异性引物*genbank编号：cp017343.1如图10所示，引物对mp1-mp5参与的反应产生可检测到的扩增产物的最短时间(阈值时间tt)分别为22分钟，15分钟，11分钟，23分钟和20分钟。此外，在所测试的五个反应温度中，引物对mp1-mp5达到最小tt值的反应温度分别为61℃，61℃，61℃，61℃和57℃，观察到的结果总结在上面的表6中。这些结果表明，当使用bstdna聚合酶进行sea或快速sea反应时，可以优先选择和使用约61℃的反应温度和tm值约61℃的引物。随后，为了证明通过上述方法确定的最佳条件(包括反应温度和引物特性)适用于实际应用场景，将上述最佳条件应用于以肺炎支原体基因组dna作为靶标的sea反应(与研究实验室中的合成和/或纯化的dna片段不同)。具体步骤如下，在相同的反应温度(即65℃，63℃，61℃，59℃或57℃)下，将40ng的肺炎支原体基因组dna用作与引物对mp3的sea反应的模板。观察到相似的结果：在61℃下使用引物对mp3参与的反应显示出最短的tt值。尽管此反应中最短的tt值(约20分钟)比上述使用扩增的靶标dna片段作为靶标的反应的tt值更长，但这种差异可归因于较长的基因组核酸中靶标位置出现变性泡的几率低于较短的靶标dna片段(图10f)。这些结果进一步证明，本实施例的步骤和方法可用于确定sea方法和当前加速sea方法的最优反应温度和引物tm值。在上述用于优化引物tm值和反应温度的研究中，观察到tt值还与引物对中两个引物的tm值之间的差异有关。以下实施例提供了用于选择具有有利tm值特征的引物的其他示例性方法。具体而言，设计了具有不同的tm值差异的沙眼衣原体(ct1-ct3)或家猪(sd1-sd3)特异性引物对，并将其在61℃下进行的sea反应中(表7)。引物对的平均tm值均接近61℃，以排除该因素的可能影响。如图11所示，无论对于沙眼衣原体还是家猪特异的引物，tm值差异最小的引物对tt值最短，而tm值差异最大的引物对显示出最高的tt值。tm值相似的引物对通常具有相似的退火温度，因此引物的扩增反应速率相似，在这种情况下，sea反应的效率更高(thorntonetal.,“real-timepcr(qpcr)primerdesignusingfreeonlinesoftware,”biochem.mol.biol.edu.,(2011)39:145-ꢀ154)。这些结果表明，可以优先选择具有相似tm值的引物对用于sea反应和加速的sea反应。表7.沙眼衣原体(c.trachoma*)16srrna编码基因和家猪(s.domestica**)18srrna编码基因特异性sea引物*genbank编号：nr_025888.1**genbank编号：jn601073.15.7.23’端g/c含量的优化以下实施例提供了结合本方法进行引物的g/c含量优化的示例性方法。具体而言，使用对肺炎支原体16srrna(mp3，mp6和mp7)编码基因或沙眼衣原体16srrna(ct1，ct4和ct5)编码基因的靶标序列具有特异性的引物对进行sea反应。本实施例选择的聚合酶是bstdna聚合酶。具体步骤如下，设计肺炎支原体特异性引物，使得在3'端的5nt区域中g和c的总数为1至4。设计沙眼衣原体特异性引物，使3'端5nt区的g和c总数为2或3。此外，所有引物对的tm均值均在61℃附近，并在61℃的恒定温度下进行反应。为了实时监控扩增，每秒扫描一次扩增混合物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图12)。引物中3'末端中g/c的数，每个引物对的3’端5nt区域g/c数目，以及反应的tt值如表8所示。表8.肺炎支原体(m.pneumoniae*)和沙眼衣原体(c.trachoma**)16srrna编码基因特异性sea引物*genbank编号：cp017343.1**genbank编号：nr_025888.1如以上图11a和表8所示，肺炎支原体特异性引物相关的结果表明，在3'端附近具有较高g/c含量的引物表现出较低的tt值，表明可以优先选择3'端g/c含量较高的引物。此观察结果与常规pcr引物的设计原则相反，在常规pcr引物的设计中，通常应避免引物在3'端具有高g/c含量(simonssonetal.,“dnatetraplexformationinthecontrolregionofc-myc,”ꢀnucleicacidsres.,(1998)26:1167-1172)。此外，还观察到尽管三个沙眼衣原体特异性引物对的3'末端区域中g/c含量相似，其中3'-末端核苷酸均为g或c的引物对(ct1)tt值最低。肺炎支原体特异性引物结果中也观察到相同的现象。这些结果表明，引物尾端与其靶位点之间的g/c碱基配对相对更稳定，对于更加有利于杂交，因为这会避免引物容易被原始互补链替换。此外，由末端碱基对形成的稳定结构将有助于通过聚合酶引发引物延伸，并防止非特异性扩增(rodríguez-lázaroetal.,“real-timepcrinfoodscience:introduction,”curr.issuesmol.biol(2013)15:25-38)。因此，该研究证明，用于本发明的引物在聚合酶拟延伸的末端5-nt区域中应具有至少2个g和/或c。此外，在引物的末端为g或c的引物更有利于聚合酶引发的延伸。5.7.3基于互补性的引物序列优化以下实施例提供了用于优化引物序列以避免或减少在引物分子内形成自互补二级结构的示例性程序。使用sea方法评估了引物序列中自身互补或引物对中各引物之间3'互补的影响。具体而言，针对沙眼衣原体(ct1，ct6和ct2)或蜡状芽胞杆菌(bc1-bc3)特异的不同引物对，分析了它们潜在的自我互补或3'互补位点数。使用ncbi网站(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)上的blast算法。表9中总结了各引物的预测互补位点数。然后将引物在上述条件下进行sea反应。为了实时监控扩增，每秒扫描一次扩增混合物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图13)。表9.沙眼衣原体(c.trachoma*)和蜡样芽孢杆菌(b.cereus**)16srrna编码基因特异性sea引物*genbank编号：nr_025888.1**genbank编号：nr_152692.1如图13所示，引物对中互补位点的数量与相应反应的tt值呈正相关，其中潜在互补位点总数最少的引物对tt值最低。此外还观察到在蜡样芽孢杆菌特异性引物中，tt值(bc1)最低的引物对tm值最高(65℃)。此外，bc1p2引物的3'末端核苷酸既不是g也不是c。这一发现表明，引物序列内和序列间互补对sea方法或快速sea方法总体效率和速率负面影响超过了合适的引物g/c含量或tm值的积极影响。因此，该研究表明，避免或减少引物序列中的潜在的自身互补和/或3'互补有益于本方法效率的提高。5.7.4引物设计注意事项的优先级(tm值和3'末端c/g含量)在实际的引物设计过程中，综合考虑不同的引物优化注意事项时可能导致选择引物出现矛盾。例如，如图13和表9所示，引物序列内和序列间互补的负面影响超过了合适的引物g/c含量或tm值对总体效率和扩增速率的正面影响。以下研究进一步提供了示例性过程和步骤，用于确定引物tm值与3'端g/c含量之间的优先顺序。具体而言，使用4ng基因组dna作为模板，用两个对金黄色葡萄球菌特异引物对(sa1和sa2)进行sea反应。对于sa1引物对，两个引物之间的tm值和tm值差分别为约65℃和2.2℃左右。对于sa2引物对，两个引物之间的tm值和tm值差分别为61℃和1.1℃左右，且两个引物的3'末端核苷酸均为a或t。引物的序列和特征总结在下表10中。将引物用于在上述条件下进行sea反应。为了实时监控扩增，每秒扫描一次扩增混合物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图14)。表10.金黄色葡萄球菌(s.aureus*)16srrna编码基因特异性引物*genbank编号：d83356.1.1.如图14和表10所示，引物对sa1的扩增效率(tt为37分钟)明显低于引物对sa2(tt为32分钟)。基于这些测定，可以得出结论，相比于选择有利的3'末端残基或3'末端g/c含量，选择有利的tm值和tm值差值有更高的考虑优先级。这些观察结果可以解释为，与g-c碱基配对提供的稳定性相比，适当的tm值的引物和反应温度之间更有效地促进形成稳定的引物-靶标双链结构。2.总之，这些研究表明，基于不同的考虑，引物设计的优先顺序为(从高优先级到低优先级)：(1)避免/减少引物序列中的自身互补和/或3'互补，(2)选择合适的tm值和/或tm值差值，以及(3)选择合适的3’端5nt区域c/g含量和/或g/c为末端残基。换句话说，当基于较低优先级考虑的引物序列的选择与基于较高优先级考虑的引物序列的选择相矛盾时，可以采用基于较高优先级考虑的选择。5.9实施例8：试剂盒以下提供了使用预先制备的试剂盒通过本发明的快速sea方法检测靶标核酸的实例。制备了包含具有以下成分的缓冲液a和缓冲液b的试剂盒。缓冲液a：等温反应缓冲液(10×)：1.75μl；dntps(10mm)：2μl；引物1：7.5μl(终浓度：3.0×10-6m)；引物2：7.5μl(终浓度：3.0×10-6m)；聚乙二醇(peg)200(100％)：0.625μl；evagreen(20×)：0.625μl；缓冲液b：等温反应缓冲液(10×)：0.75μl；et单链结合蛋白(ssb)(500μg/ml)：0.25μl；dna聚合酶(8u/μl)：0.75μl。在本实施例中，设计引物对检测样品中的金黄色葡萄球菌。具体而言，设计引物以扩增金黄色葡萄球菌16srrna编码基因的片段，序列如下：5'-ꢀggttcaaaagtgaaagacggtcttgctgtcacttatagatggatccgcgc-3'(seqidno:4)。引物序列为：引物1:5’-ggttcaaaagtgaaagacggtcttg-3’(seqidno:5)；引物2:5’-gcgcggatccatctataagtgac-3’(seqidno:6).根据制造商提供的说明书，使用购自天根生化技术(北京)有限公司(中国北京，目录号dp422)的dna/rna分离试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组。按下述步骤制备三个平行重复样品：混合缓冲液a和缓冲液b，并向混合物中加入2.5μl提取的金黄色葡萄球菌基因组材料，并加水至总体积为25μl。使用相同含量水代替金黄色葡萄球菌基因组材料配制扩增混合液作为阴性对照组(ntc)。使用cfxconnecttm实时pcr系统(bio-rad，ca)，使扩增反应体系进行76℃至61℃的快速热循环进行快速sea反应。具体而言，每个热循环由以下步骤组成：将扩增反应体系在76℃下孵育1s，随后立即降低温度至62℃，在62℃孵育1s后立即将温度升至之前的76℃。为了实现对扩增过程的实时监控，每两个热循环扫描一次扩增产物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图8)。如图所示，三个重复实验扩增结果一致，而阴性对照没有产生可检测的荧光信号。这些结果表明，使用该试剂盒能够得到可重复且稳定的结果，并且分别以缓冲液a和缓冲液b的形式保存的试剂性质稳定，混合后能够诱导发生反应。5.10微流控设备下面提供了在微流体芯片中使用本发明的快速sea方法检测靶标核酸的实例。制备了包含以下内容物的10μl反应混合物：纯净水：0.35μl等温反应缓冲液(10×)：1μl引物1：3μl(终浓度：3.0×10-6m)；引物2：3μl(终浓度：3.0×10-6m)；peg200(100％)：0.25μl；evagreen(20×)：0.25μl；dutp(10mm)：0.8μl；尿嘧啶dna糖基化酶(1u/μl)：0.1μl；dna聚合酶(8u/μl)：0.25μl；靶标核酸：1μl。在该实施例中，设计引物对检测样品中的金黄色葡萄球菌。具体而言，设计引物以扩增金黄色葡萄球菌16srrna编码基因的片段，序列如下：5'-ꢀggttcaaaagtgaaagacggtcttgctgtcacttatagatggatccgcgc-3'(seqidno：4)引物序列为：引物1：5'-ggttcaaaagtgaaagacggtcttg-3'(seqidno：5)；和引物2：5'-gcgcggatccatctataagtgac-3'(seqidno：6)。根据制造商的说明，使用购自天根生化技术(北京)有限公司(中国北京，目录号dp422)的dna/rna分离试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组到储备溶液中。混合所有试剂，并向混合物中添加1.0μl不同浓度金黄色葡萄球菌靶标，使其总体积为10μl，靶标的浓度分别为1.0×10-9m，1.0×10-10m，1.0×10-11m，1.0×10-12m，1.0×10-13m，1.0×10-14m和1.0×10-15m。该反应还设置了用等量水代替金黄色葡萄球菌基因组材料，其他成分相同的扩增混合物为阴性对照组(ntc)。充分混合反应混合物，然后用移液管吸取所有混合物，从微流体rapi：chiptm(韩国，genesystem)的进样口注入反应室，每个反应室均具有进样口和排气口。将所有样品混合物和ntc混合物注入反应室后，将密封膜粘贴在微流控芯片上以密封进样口和排气口。之后，将微流控芯片置于uf-ꢀ150genecheckertm超快速实时pcr系统(韩国，genesystem)上，准备进行扩增反应。在37℃下孵育5分钟后，微流体芯片在76℃至60℃之间经历快速的热循环。每个热循环由以下步骤组成：将扩增混合物在76℃下孵育1秒，随后立即将温度降低到60℃，并在60℃下再孵育1s，然后立即将温度升回76℃。温度的上升和下降速率为8℃/s，每个周期在12s内完成。为了实时监测扩增，每个热循环扫描一次扩增产物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图15)。如图所示，荧光信号的出现时间与浓度成正相关。而阴性对照则未产生可检测的荧光信号。在该实施例中的研究表明，本发明的快速sea方法可以在8分钟内(少于40个循环)扩增和检测样品中存在的靶标分子(浓度低至1.0×10-14m或在10μl反应系统中约6.0×104个拷贝)。5.11实施例10：尿嘧啶-dna糖基化酶(udg)减少污染以下研究证明在扩增混合物中添加尿嘧啶-dna糖基化酶可以减少扩增中的残留污染。首先，进行以下研究以证明快速的sea可以用dutps合成新的扩增产物。在第一个反应(dttps；实心圆)中，扩增混合物包含dntps(datps，dgtps，dttps，dctps)，在第二个反应(dutps；实心三角形)中，扩增混合物包含dntps(datps，dgtps，dutps，dctps)。此外还包括不含靶标分子的对照反应(ntc；实心正方形)。将上述反应混合物进行快速sea反应，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图16)。如图所示，用dutps代替dttps不会显著影响反应效率，表明dutps可用于快速的sea反应。此外，进行以下研究以证明udg对含尿嘧啶的核酸的消化。将来自上述第二次反应的含尿嘧啶的扩增产物(使用dutps代替dttps)进行udg消化。具体而言，在10μl扩增混合物中加入udg(0.01u/μl)对扩增产物进行消化，并在37℃下孵育2分钟。然后将消化产物上样至sds凝胶上进行电泳(泳道2)。将未经udg处理的10μl扩增混合物上样到sds凝胶的另一条泳道上(泳道1)进行比较。如图17所示，经udg处理后，扩增产物的荧光明显比未处理的扩增产物的荧光弱，这表明udg通过切割掺入产物中的u碱基降解了含尿嘧啶的扩增产物。最后，进行了以下研究以证明进行快速的sea时在扩增混合物中加入udg可以有效地防止由周围环境中存在的残留扩增产物(例如气溶胶)引起的污染。在这项研究中，将datps，dgtps，dutps和dctps用于第一轮快速sea反应。然后将扩增产物用作另一轮快速sea反应的靶标。具体而言，按上述方法进行快速sea反应，并绘制第二轮反应的荧光信号随时间变化的荧光曲线图(图18)。从图中可以看出，含0.01u/μludg的扩增反应阈值时间(tt)与没有udg的扩增反应(实心正方形)相比延迟了3.78分钟，这表明udg可以有效地防止目前快速sea方法的核酸分子污染。5.12实施例11：使用热稳定的taqdna聚合酶快速扩增和检测样品中的dna分子。进行了以下研究以检查快速sea方法检测生物样品中dna分子的能力。基于目标核酸序列，通过nupack软件(www.nupack.org/)设计了一对特异性引物。特别地，靶序列是5'-ꢀagatgttgaaggattcaaccaaatctccagagtttgttaaaaccgttccaa-3'(seqidno:58),引物序列为：引物1:5'-atgttgaaggattcaaccaaatc-3'(seqidno:59)；引物2:5'-ggaacggttttaacaaactctg-3'(seqidno:60).引物和靶标dna分子是商业合成的(sangonbiotech，上海，中国)，并与其他pcr反应物混合以形成10μl的扩增混合物，如下表11所示。特别地，制备扩增混合物，每个混合物分别包含1.0×10-12m，1.0×10-13m，1.0×10-14m，1.0×10-15m或1.0×10-16m副溶血弧菌基因组材料。引物浓度为5.0×10-7m，聚合酶浓度为0.05u/μl，并包括用等量水置换靶标dna的扩增混合物作为阴性对照组(ntc)。表11:用于dna扩增的扩增混合物含量为了进行快速sea反应，使用cfxconnecttm实时pcr系统(bio-ꢀrad，ca)使扩增混合物在76℃和61℃之间进行快速热循环。特别地，每个热循环由以下组成：将扩增反应体系在76℃下孵育1s，随后立即降低温度至61℃，在61℃孵育1s后立即将温度升至之前的76℃。为了实现对扩增过程的实时监控，每两个热循环扫描一次扩增产物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图19)。如图所示，快速sea方法能够在提供的靶标浓度下有效地检测副溶血弧菌的基因组核酸，这使得能够使用本发明的方法和试剂盒能够对病原体感染进行即时诊断。5.13实施例12：使用核酸探针对样品中的dna分子进行扩增和检测。进行以下研究以检查使用核酸探针的快速sea方法检测生物样品中的dna分子的能力。特别地，根据人β-肌动蛋白基因中的以下靶标序列设计一对特异性引物和探针：5’-caaatgcttctaggcggactatgacttagttgcgttacaccctttcttgacaaaacctaacttgcg-3’(seqidno:61)引物和探针序列为：引物1:5'-cctgtgttatcttggaggtc-3'(seqidno:62)；引物2:5'-fam-ccctgaagggctctctgg-bhq-3'(seqidno:63).探针：5'-accaaaagagctagaaccac-3'(seqidno:64).引物，探针和靶标dna分子是商业合成的(sangonbiotech，上海，中国)，并与其他pcr反应物混合以形成10μl的扩增混合物，如下表12所示。特别地，制备了扩增混合物，其包含从人口腔上皮细胞分离的基因组材料作为靶标dna。引物浓度为5.0×10-7m，探针浓度为6.0×10-7m，聚合酶浓度为0.05u/μl，并包括用等量水置换靶标dna的扩增混合物作为阴性对照组(ntc)。表12:用于dna扩增的扩增混合物含量成分终浓度引物15.0×10-7m引物25.0×10-7m探针6.0×10-7mdntps8mm靶标rna1.0×10-14m合成dna片段taq反应缓冲液1×taqdna聚合酶0.05u/μl100％聚乙二醇2000.625μl纯水补充至10μl为了进行快速sea反应，使用cfxconnecttm实时pcr系统(bio-ꢀrad，ca)使扩增混合物在76℃和61℃之间进行快速热循环。特别地，每个热循环由以下组成：将扩增反应体系在76℃下孵育1s，随后立即降低温度至61℃，在61℃孵育1s后立即将温度升至之前的76℃。为了实现对扩增过程的实时监控，每两个热循环扫描一次扩增产物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图20)。如图所示，快速sea方法能够在提供的靶标浓度下在约10分钟内从口腔上皮细胞有效地检测人β-肌动蛋白基因。在三个重复的反应中，扩增大约在同一时间到达指数期，而阴性对照组中的未检测到扩增产物，表明该方法和反应系统具有高度重复性和稳定性。5.14实施例13：样品中dna分子的扩增和检测进行以下研究以检查快速sea方法检测生物样品中的dna分子的能力。基于靶标核酸序列，通过nupack软件(www.nupack.org/)设计了一对特异性引物。特别地，靶标序列是5'-ꢀagatgttgaaggattcaaccaaatctccagagtttgttaaaaccgttccaa-3'(seqidno:58),引物序列为：引物1:5'-atgttgaaggattcaacca-3'(m58822.1b)(seqidno:65)；引物2:5'-ggaacggttttaacaaact-3'(m58822.1b)(seqidno:66).引物和靶标dna分子是商业合成的(sangonbiotech，上海，中国)，并与其他pcr反应物混合以形成10μl的扩增混合物，如下表13所示。特别地，制备了扩增混合物，其包含单核细胞增生李斯特氏菌的1.0×10-12m合成靶dna片段。引物浓度为3.0×10-6m，聚合酶浓度为0.24u/μl，并包括用等量水置换靶标dna的扩增混合物作为阴性对照组(ntc)。表13:用于dna扩增的扩增混合物含量成分终浓度引物13.0×10-6m引物23.0×10-6m靶标dna1.0×10-12m合成dna片段dntps8mm等温反应缓冲液1×20×evagreen0.625μletssb5μg/mlbstdna聚合酶0.24u/μl100％聚乙二醇2000.625μl纯水补充至10μl为了进行快速sea反应，使用cfxconnecttm实时pcr系统(bio-ꢀrad，ca)使扩增混合物在76℃和55℃之间进行快速热循环。特别地，每个热循环由以下组成：将扩增反应体系在76℃下孵育1s，随后立即降低温度至55℃，在55℃孵育3s后立即将温度升至之前的76℃。为了实现对扩增过程的实时监控，每两个热循环扫描一次扩增产物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图21)。如图所示，快速sea方法能够在提供的靶标浓度下在不到10分钟内有效地检测单增李斯特菌的合成dna片段，这使得能够使用本发明的方法和试剂盒进行病原体感染的现场即时检测。5.15实施例14：样品中小rna分子的扩增和检测进行了以下研究以检查快速sea方法检测生物样品中的小rna分子的能力。通过nupack软件(www.nupack.org/)基于靶核酸序列设计了一对特异性引物。特别地，靶标序列是5'-gcuuaucagacugauguuga-3'(seqidno:67),引物序列为：引物1:5'-gcttatcaga-3'(m58822.1b)(seqidno:68)；引物2:5'-tcaacatcag-3'(m58822.1b)(seqidno:69).引物和靶dna分子是商业合成的(sangonbiotech，上海，中国)，并与其他pcr反应物混合以形成10μl的扩增混合物，如下表14所示。特别地，制备了扩增混合物，其含有1.0×10-11m的合成靶标小rna片段。引物浓度为3.0×10-6m，聚合酶浓度为0.25u/μl。并包括用等量水置换靶标小rna片段的扩增混合物作为阴性对照组(ntc)。表14:用于小rna扩增的扩增混合物含量成分终浓度引物13.0×10-6m引物23.0×10-6m靶标小rna1.0×10-11mdntps8mm等温反应缓冲液1×20×evagreen1.25μlklenow片段exo-0.25u/μl尿嘧啶-dna糖基化酶0.05u/μl100％聚乙二醇2001.25μl纯水补充至20μl为了进行快速sea反应，使用cfxconnecttm实时pcr系统(bio-ꢀrad，ca)使扩增混合物在60℃和34℃之间进行快速热循环。特别地，每个热循环由以下组成：将扩增反应体系在60℃下孵育1s，随后立即降低温度至34℃，在34℃孵育1s后立即将温度升至之前的60℃。为了实现对扩增过程的实时监控，每两个热循环扫描一次扩增产物的荧光信号，并绘制随时间变化的荧光曲线图(图22)。如图所示，快速的sea方法能够在提供的靶标浓度下在不到10分钟的时间内有效地检测合成的小rna片段，这使得能够使用本方法和试剂盒从样品中检测小rna。6.序列表该申请是与序列表的计算机可读形式(crf)副本一起提交的，该序列表名为14624-002-146_st25.txt，创建于2020年，大小为11,518字节；通过引用将其全部内容并入本文。当前第1页12当前第1页12