SPL7在调控植物抗旱能力中的应用的制作方法

spl7在调控植物抗旱能力中的应用
技术领域
1.本发明涉及植物基因工程，特别涉及一种增强植物抗旱能力的调控因子，及其在培育转基因植物新品种方面的潜在应用。


背景技术：

2.由于植物自身无法移动，常常暴露于恶劣环境中。因此植物进化出一系列复杂的机制来调控自身代谢和生长以适应环境。干旱、土壤盐度变化、寒冷都会导致水资源缺乏，是限制植物栖息和农业发展的一个主要因素。鉴于其对植物科学和农业发展的重要性，过去几十年来关于植物如何平衡自身生长和生存已经被广泛研究。前期研究表明，应对水缺乏的生理和分子反应主要是由经典的植物激素脱落酸(aba)所协调。在干旱、盐胁迫等恶劣条件下，植物体内的aba含量上升，aba诱导保卫细胞的胞质钙信号振荡，促进气孔关闭，减少水分散失。aba导致转录组水平的剧烈变化，从而导致代谢和细胞过程的改变，以适应干旱耐受。此外，aba抑制植物生长的作用早已为人所知，然而其机制尚不清楚。
3.植物内源的aba含量被复杂的稳态机制所调控，包括生物合成、分解代谢、可逆糖基化和远距离运输。aba的从头合成是通过类胡萝卜素途径进行的，是涉及一系列酶催化的反应，从质体中开始，在细胞质中结束。第一个含氧类胡萝卜素——玉米黄质，在拟南芥中通过aba1编码的玉米黄质环氧化酶转化为紫黄质。9
‑
顺式环氧化类胡萝卜素双加氧酶(nceds)将紫黄质和新黄质的顺式异构体进行裂解，生成第一个胞质aba前体黄质醛，这一步是aba生物合成的限制性步骤。nced基因属于多基因家族，拟南芥中的nced3是叶片中主要的胁迫诱导的亚型。aba合成的最后一步是由脱落醛氧化酶(aao)催化脱落醛氧化生成aba。aao3被认为是拟南芥中唯一参与aba合成的aao基因。在拟南芥中，aba分解代谢通过细胞色素p450 707a家族成员介导的羟基化和糖基转移酶介导的葡萄糖结合进行。无活性的葡萄糖结合形式的aba可以被β
‑
葡萄糖苷酶水解，补充细胞质中的aba。尽管前期研究很大程度上阐明了aba稳态的分子框架，但是aba稳态如何在植物的生长和发育过程中与其他重要的生理过程相互协调仍不清楚。
4.铜(cu)是植物中的一种微量过渡金属，作为许多具有电子转移和氧化还原反应功能的重要铜蛋白的辅助因子。在高等植物中，cu是生长所必需的，因为需要cu作为辅因子的蓝铜蛋白质体蓝素大量存在于类囊体腔内，是光合作用z
‑
scheme中不可或缺的电子载体。已有一些研究暗示cu稳态可能参与胁迫应激反应。首先，cu参与乙烯和aba等激素的合成或感知。其次，cu参与木质化次生细胞壁、凯氏带和种皮等具有保护功能的结构的形成。第三，许多铜稳态基因的表达受环境影响。因此，铜稳态参与平衡植物生长和胁迫应激响应，但其潜在的分子机制还有待进一步阐明。
5.spl7及其同源基因是绿色植物中高度保守的铜稳态调控因子，其具有特有的squamosa启动子结合蛋白(sbp)结构域，该结构域包含核定位信号序列和锌指结构域，其中锌指结构与已被证明可以结合含gtac的dna基序。植物处于缺铜环境下，spl7被激活，一方面上调copt基因家族的表达，促进铜离子的吸收，另一方面上调cu
‑
mirna的表达，这些cu
‑
mirna靶向cu/zn超氧化物歧化酶(csds)、漆酶和其他蓝铜蛋白，降解并抑制这些非必要铜蛋白的表达，促使cu向光合作用等生长所必需的途径中转运。此外，spl7还与其他转录调控因子相互作用，例如与elongated hypocotyl 5(hy5)互作，参与光信号的转导，与cu
‑
deficiency induced transcription factor 1(citf1)互作，促进生殖发育过程中的茉莉酸积累。这些研究表明spl7介导的铜稳态参与了一系列对生长发育和环境响应的至关重要的生物过程。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于研究植物spl7的功能，集中在其对于平衡植物生长和干旱响应的调控，为定向创制抗旱植物品种提供一种有效的方法，以期为干旱问题的解决带来一定思路。
7.本研究发现，spl7基因敲除或失活会延缓植物的生长，但会提高其抗旱能力。本研究致力于解析其背后的分子机制。随后的研究发现，spl7通过识别启动子上的gtac基序来抑制aba生物合成通路中nced3和aao3的转录，从而减少aba的积累，平衡植物的生长和抗逆能力。本研究表明，在陆生植物中存在一种潜在的保守机制，即通过spl7
‑
gtac调节aba的新生物合成，从而平衡植物的生长和胁迫响应。
8.在本发明的第一方面，提供了一种调控植物抗旱能力的蛋白，该蛋白为植物中高度保守的铜稳态调控因子spl7，是氨基酸序列如序列表中seq id no：1所示的蛋白质或其同源蛋白。
9.seq id no：1所示为拟南芥spl7的氨基酸序列，由818个氨基酸残基组成，第136
‑
215位氨基酸残基为sbp结构域。
10.spl7的表达量和/或活性会影响植物的抗旱能力，其中，敲除spl7基因或使之失活能够提高植物的抗旱能力。
11.编码拟南芥spl7的基因组序列如序列表中seq id no：2所示，其编码序列(cds)如序列表中seq id no：3所示。
12.在本发明的第二方面，提供了一种提高植物抗旱能力的方法，通过敲除植物的spl7基因或者使之突变失活，获得抗旱能力提高的植物。
13.可以采用基因编辑技术敲除植物的spl7基因，例如利用crispr
‑
cas9系统进行基因敲除，包括以下步骤：
14.1)选择spl7基因的编码区序列及其侧翼序列为模板设计crispr
‑
cas9系统敲除所需的sgrna；
15.2)将sgrna靶点序列插入到cas9载体中，构建spl7基因敲除的表达载体；
16.3)将步骤2)构建的表达载体导入植物细胞、组织或器官中，将被转化的植物细胞、组织或器官培育成植株，获得转基因植株；
17.4)对转基因植株的后代进行筛选鉴定，获得纯合的spl7基因被敲除的株系。
18.上述步骤1)设计成对的sgrna，包括sgrna1和sgrna2，其靶点序列分别如序列表中seq id no：4和5所示。
19.上述步骤2)中所述cas9载体优选为可用于农杆菌转化植物的双元表达载体，例如pcambia1300
‑
35s
‑
cas9载体，通过插入sgrna1和sgrna2的靶点序列得到spl7基因敲除的双
元表达载体pcambia1300
‑
atu6
‑
26
‑
sgrna1
‑
atu6
‑
26
‑
sgrna2
‑
35s
‑
cas9；在步骤3)先将所构建的spl7基因敲除的双元表达载体转入农杆菌中，然后通过农杆菌转染植物花器官，获得转基因植株。
20.使植物spl7基因突变失活的方法包括但不限于t
‑
dna插入突变，例如，利用t
‑
dna载体pbin
‑
rok2插入到拟南芥spl7基因的第六个外显子中，致使spl7蛋白无法正确编码从而失活，得到拟南芥的t
‑
dna插入突变体spl7
‑
1。通过实时荧光定量pcr(qrt
‑
pcr)检测显示，spl7
‑
1突变体中无法检测到spl7的表达量(见图1中c)。
21.spl7基因编码区序列敲除的表达载体、菌株和转基因植物系都在本发明的保护范围内。
22.在本发明的实施例中，选择拟南芥spl7基因的编码区序列及其侧翼序列左右各200bp为模板设计crispr
‑
cas9技术敲除所需的sgrna，插入到pcambia1300
‑
35s
‑
cas9载体，构建spl7基因敲除的双元表达载体pcambia1300
‑
atu6
‑
26
‑
sgrna1
‑
atu6
‑
26
‑
sgrna2
‑
35s
‑
cas9，将其转入到农杆菌gv3101，然后浸泡法感染col
‑
0背景的拟南芥花器官，获得转基因植株，后代筛选鉴定获得纯合的spl7基因编码区完全敲除的拟南芥株系(spl7
‑
ko)。
23.进一步的，选择spl7基因的自身启动子和蛋白编码序列(cds)插入至pcambia1381载体中，构建spl7基因回补的双元表达载体pcambia1381
‑
spl7pro
‑
spl7。将质粒pcambia1381
‑
spl7pro
‑
spl7转入到农杆菌gv3101，然后浸泡法感染spl7
‑
ko背景的拟南芥花器官，获得转基因植株，后代筛选鉴定获得spl7基因回补的拟南芥株系(pspl7:spl7/spl7
‑
ko)。
24.利用实时定量rt
‑
pcr方法检测spl7
‑
ko拟南芥中spl7的表达量，结果显示spl7的表达量几乎检测不到，而回补材料spl7pro:spl7/spl7
‑
ko拟南芥中spl7的表达量恢复到野生型的水平(图1)，表明本发明通过crispr
‑
cas9技术成功获得了spl7完全敲除的拟南芥植株，并且通过转基因技术成功获得了spl7回补材料。
25.首先，对本发明获得的spl7敲除和回补的拟南芥株系的生长情况进行分析，结果显示，与已报道的spl7
‑
1突变体表型一致，spl7
‑
ko植株生长弱小，其中生长5天时的主根长度，生长7天时的叶片面积、鲜重，和生长1个月时的叶片面积、鲜重都显著低于野生型。可见，spl7影响植物的营养生长(图2)。
26.进而，本发明对相关植物材料进行了干旱处理，测定了存活率、单个叶片失水率、叶片温度和电导率四方面的干旱参数。其中，叶片温度代表了植物的蒸腾作用，叶片温度越低，即蒸腾作用越强，失水率越高。电导率代表了植物的细胞完整性，电导率越高，细胞膜完整性越低，代表了植物受干旱胁迫后细胞膜损伤越高。结果表明，21天的干旱处理后，spl7
‑
1和spl7
‑
ko植物材料相对于野生型，存活率显著调高(约98％，图3)。且单个叶片失水率和叶片温度参数测定表明，spl7
‑
1和spl7
‑
ko植物材料的失水率远低于野生型(图4)。可见，spl7对植物抗旱能力有着重要影响。
27.进一步，本发明对野生型和spl7
‑
ko突变体中aba合成基因的表达量以及aba含量进行了检测，结果显示与野生型相比，spl7
‑
ko突变体中的aba合成基因显著下调，aba含量显著减少(图5)。这就证明了spl7可以负调aba合成通路中的关键基因aba1，nced3，和aao3，从而减少aba的合成，平衡植物的生长和抗旱。
28.此外，本发明对不同物种中spl7同源蛋白的sbp结构域序列进行比对分析，结果显
示spl7蛋白中的sbp结构域在陆生植物(包括双子叶植物，单子叶植物和早期登陆的苔藓植物)中高度保守(图6)。鉴于该基因的应用价值及其利用潜力的巨大应用前景，应加以专利保护。
附图说明
29.图1显示了实施例中spl7敲除植株构建过程及结果，其中：a图中上方为spl7编码区结构示意图，其中三角形指示为spl7
‑
1突变体的插入位点；下方为野生型wt和敲除突变型spl7
‑
ko植株中spl7基因的测序序列示意图；b为spl7
‑
ko植株的鉴定结果电泳图，星号分别对应wt和spl7
‑
ko对应的pcr条带；c为不同基因型植株中spl7的表达量；d为不同基因型幼苗(7天)的生长情况。
30.图2显示了spl7影响植物的营养生长，其中：a为生长5天的不同基因型(wt,spl7
‑
1,spl7
‑
ko,pspl7:spl7/spl7
‑
ko)幼苗；b为生长7天的不同基因型幼苗；c为生长11天的不同基因型幼苗；d为不同基因型幼苗的叶片面积(7天)、鲜重(7天)和根长(5天)的统计分析；e为1个月大的不同基因型植株的生长情况；f为1个月大的不同基因型植株的叶片面积和鲜重的统计分析。
31.图3显示了敲除spl7增强植物的抗旱能力，其中：a为不同基因型在正常生长14天、干旱处理21天、复水3天三个时间节点的生长情况；b为不同基因型在正常生长14天、干旱处理21天、复水3天后的存活率统计分析；c为不同基因型植株中干旱响应基因的表达模式。
32.图4显示了spl7敲除降低叶片失水率，其中：a为不同基因型单个叶片脱水前后的表型；b为不同基因型的叶片温度示意图；c为不同基因型单个叶片脱水率；d为不同基因型的叶片温度统计分析。
33.图5显示了spl7敲除增加植物体内的aba含量，其中：a为aba合成代谢途径；b为野生型(wt)和spl7
‑
ko突变体中aba1、nced3和aao3的表达模式；c为干旱处理后野生型和spl7
‑
ko突变体中的aba含量。
34.图6显示了spl7的sbp结构域在陆生植物中的保守性，共选取了代表性的25种陆生植物，列出了每种植物对应的spl7同源蛋白的sbp结构域序列，其中，*表示sbp结构域中锌指结构的关键氨基酸(c：半胱氨酸；h：组氨酸)。
具体实施方式
35.下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验试剂耗材，如无特殊说明，均自常规生化试剂公司购买得到。
36.植物材料：拟南芥(col
‑
0)。
37.1、spl7基因敲除的转基因拟南芥的获得
38.1.1spl7敲除的靶点设计
39.根据ncbi数据库(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)信息获取拟南芥spl7的蛋白质编码序列(见序列表中seq id no：2)，利用crispr
‑
ge网站(http://skl.scau.edu.cn)在线设计靶点及其载体构建引物序列。选择spl7编码区序列及其侧翼序列左右各200bp为模板设计crispr
‑
cas9技术敲除所需的sgrna，靶点序列及其引物序列如表1所示。
40.表1.spl7基因敲除靶点序列和靶点引物序列
[0041][0042]
1.2靶点引物退火
[0043]
将靶点引物用水溶解成10μm母液，各取10μl加入80μl 0.5
×
te(ph 8.0)里，终浓度为1μm；可将水加热至沸腾，关闭加热器电源，将盛有靶点引物的ep管放入热水里，30s后取出，自然冷却至室温。另外，可在pcr仪中98℃加热3min，立即取出pcr管，自然冷却至室温，用于连接。
[0044]
1.3sgrna cassette的构建
[0045]
1.3.1bsai酶切atu6
‑
26
‑
sgrna
‑
sk植物编辑质粒
[0046]
取1μg atu6
‑
26
‑
sgrna
‑
sk质粒，在50μl反应中用10u bsa i
‑
hf 37℃酶切60min，使用dna 纯化试剂盒纯化后分装，冷冻保存(可重复使用)。
[0047]
1.3.2靶点连接反应
[0048][0049][0050]
室温(20
‑
25℃)连接30分钟。
[0051]
1.3.3转化、鉴定阳性克隆
[0052]
将10μl连接产物转化大肠杆菌xl1
‑
blue或dh5α，涂amp

lb平板，10
‑
12h后挑选单克隆做菌落pcr鉴定并进行测序，确认靶点是否连入载体。
[0053]
菌落pcr鉴定用引物：
[0054]
正向引物sk
‑
grna
‑
f：5
’‑
ctcactatagggcgaattgg
‑3’
(seq id no：10)；
[0055]
反向引物：见表1中靶点的反向引物。
[0056]
pcr片段长度为499bp。
[0057]
将正确的克隆进行扩大培养，提取质粒，用nhe i和spe i双酶切，电泳后将片段大小约642bp的片段割胶回收，回收片段即sgrna1 cassette和sgrna2 cassette。
[0058]
1.4双元载体构建
[0059]
1.4.1spei酶切pcambia1300
‑
35s:cas9质粒
[0060]
取1
‑
2μg pcambia1300
‑
35s:cas9质粒，在50μl反应中用10u spe i 37℃酶切10
‑
30min，80℃失活20min，为了防止载体自连接，加入0.2μl碱性磷酸酶ciap，37℃10min对载体进行去磷酸化处理，电泳切胶回收，分装后冷冻保存(该酶切产物可重复利用)。
[0061]
1.4.2sgrna cassette连接反应
[0062][0063]
室温(20
‑
25℃)连接30分钟。
[0064]
1.4.3转化、鉴定阳性克隆
[0065]
将10μl连接产物转化大肠杆菌dh5α，涂kan

lb平板，14
‑
16h后挑选单克隆，利用双元载体上的引物序列进行菌落pcr鉴定，挑取测序正确的质粒(命名为pcambia1300
‑
atu6
‑
26
‑
sgrna1
‑
35s
‑
cas9)，spei酶切，与sgrna2 cassette进行连接反应，转化测序后将鉴定正确的质粒(命名为pcambia1300
‑
atu6
‑
26
‑
sgrna1
‑
atu6
‑
26
‑
sgrna2
‑
35s
‑
cas9)转化农杆菌。
[0066]
菌落pcr鉴定的引物位于spe i酶切位点的两端，引物序列如下：
[0067]
1300
‑
grna
‑
f：5
’‑
ccagtcacgacgttgtaaaac
‑3’
(seq id no：11)
[0068]
1300
‑
grna
‑
r：5
’‑
caatgaatttcccatcgtcgag
‑3’
(seq id no：12)
[0069]
单个sgnra cassette连接成功后的pcr片段长度约750bp，未连接成功的克隆pcr片段只有100bp左右。
[0070]
1.5spl7敲除材料的基因转化
[0071]
将测序正确的质粒pcambia1300
‑
atu6
‑
26
‑
sgrna1
‑
atu6
‑
26
‑
sgrna2
‑
35s
‑
cas9转入农杆菌gv3101，将col
‑
0背景的拟南芥花器官浸泡法农杆菌溶液，获得转基因t0代植株，后代hygromycin抗性筛选获得t1代阳性植株并进行pcr鉴定繁种至t4代spl7基因敲除植株(记为spl7
‑
ko)，筛选出分别标记为#21，#39，#47三个4185bp的spl7基因编码区完全敲除的转基因拟南芥株系，参见图1中b、c和d。
[0072]
2、spl7基因回补的转基因拟南芥的获得
[0073]
2.1ctab法提取拟南芥基因组dna
[0074]
首先，称取约200mg的拟南芥叶片组织于2ml ep管中，加入5mm钢珠，液氮冷冻后置于震动研磨仪中研碎样品；向ep管中直接加入200μl ctab提取缓冲液，颠倒混匀；将混匀的样品于65℃温育15分钟；加入等体积的氯仿，颠倒混匀；室温下12,000rpm离心10分钟，取上清于新管中；向上清中加入等体积的异丙醇沉淀dna，颠倒混匀，室温下12,000rpm离心10分钟；弃上清液，加500μl 75％乙醇洗涤dna，颠倒混匀后，室温下12,000rpm离心10分钟，弃上
清液；室温待其风干后加入去离子水液溶解dna。
[0075]
2.2trizol法提取拟南芥基rna
[0076]
首先，称取约200mg的拟南芥叶片组织于2ml ep管中，加入5mm钢珠，液氮冷冻后置于震动研磨仪中研碎样品；向ep管中直接加入1ml trizol提取缓冲液，颠倒混匀，室温放置5分钟；加入等体积的氯仿，涡旋混匀20秒；4℃12,000rpm离心15分钟，取上清于无rnase的新管中；向上清中加入等体积的异丙醇沉淀rna，颠倒混匀，室温下放置10分钟，4℃12,000rpm离心15min；弃上清液，加500μl 75％乙醇洗涤沉淀，颠倒混匀后，室温下12,000rpm离心1min，弃上清液；室温下放置5分钟后，加入无rnase的去离子水液溶解rna。
[0077]
2.3总rna逆转录
[0078]
使用fastking cdna第一链合成试剂盒(货号：kr113(fastking rt kit)；tiangen公司)逆转录rna，反应体系1如下:
[0079][0080]
彻底混匀后，简短离心，置于42℃孵育3min。立即置于冰上，进行第二步反应，反应体系2如下：
[0081][0082]
充分混匀后，置于42℃，孵育60min。立即置于95℃孵育3min，随后置于冰上保存。
[0083]
2.4拟南芥spl7基因启动子及编码序列片段的扩增
[0084]
根据ncbi数据库(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov)信息获取拟南芥spl7的启动子(1696bp，见序列表中seq id no：13)和编码序列(cds)(2475bp，见序列表中seq id no：3)，并根据该基因序列设计引物，见表2。
[0085]
表2.spl7启动子和编码序列的扩增引物
[0086][0087]
随后采用kod fx高保真dna聚合酶扩增拟南芥spl7的启动子和cds基因片段，反应体系如下：
[0088][0089]
上述pcr反应条件为94℃预变性30s；98℃变性10s，58℃退火30s，68℃延伸3min，30个循环；68℃延伸10min；暂停于4℃。反应完毕后进行dna琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物条带的大小与特异性。
[0090]
2.5双元载体pcambia1381的酶切
[0091]
利用限制性内切酶(thermofisher公司)双酶切体系切开pcambia1381质粒，酶切体系如下：
[0092][0093]
上述酶切反应体系于37℃中温育3h。使用胶回收试剂盒(tiangen公司)回收酶切后的质粒。
[0094]
2.6gibson法连接双元载体pcambia1381和spl7启动子片段
[0095]
使用gibson同源重组酶连接spl7启动子片段和pcambia1381质粒，连接体系如下：
[0096][0097]
上述连接反应体系置于50℃中温育30min，连接产物命名为pcam1381
‑
spl7pro。
[0098]
2.7pcam1381
‑
spl7pro的大肠杆菌转化、鉴定阳性克隆
[0099]
从
‑
80℃冰箱取出大肠杆菌dh5α感受态细胞，置于冰上待其融化，将连接产物pcam1381
‑
spl7pro加入感受态细胞，轻轻混匀后并放置于冰上30min；于42℃金属浴中热激90s；立即置于冰上3min。向菌液中加入600μl无抗lb培养基，于37℃220rpm复苏35min。8000rpm离心1min，留取100μl上清重悬沉淀，均匀涂于含有50mg/ml的卡那霉素的lb平板，于37℃培养箱中培养12～18h。
[0100]
挑取单菌落进行菌落pcr鉴定阳性克隆后测序，测序成功的菌落过夜培养提取质粒，以待下一步使用。
[0101]
2.8双元载体pcambia1381
‑
spl7pro的酶切
[0102]
利用限制性内切酶(thermofisher公司)双酶切体系切开pcambia1381
‑
spl7pro质粒，酶切体系如下：
[0103][0104]
上述酶切反应体系于37℃中温育3h。使用胶回收试剂盒(tiangen公司)回收酶切后的质粒。
[0105]
2.9gibson法连接双元载体pcambia1381
‑
spl7pro和spl7编码序列片段
[0106]
使用gibson同源重组酶连接pcambia1381
‑
spl7pro和spl7编码序列片段，连接体系如下：
[0107]
[0108]
上述连接反应体系置于50℃中温育30min，连接产物命名为pcam1381
‑
spl7pro:spl7。
[0109]
2.10pcam1381
‑
spl7pro:spl7的大肠杆菌转化、鉴定阳性克隆
[0110]
从
‑
80℃冰箱取出大肠杆菌dh5α感受态细胞，置于冰上待其融化，将连接产物pcam1381
‑
spl7pro:spl7加入感受态细胞，轻轻混匀后并放置于冰上30min；于42℃金属浴中热激90s；立即置于冰上3min。向菌液中加入600μl无抗lb培养基，于37℃220rpm复苏35min。8000rpm离心1min，留取100μl上清重悬沉淀，均匀涂于含有50mg/ml的卡那霉素的lb平板，于37℃培养箱中培养12～18h。
[0111]
挑取单菌落进行菌落pcr鉴定阳性克隆后测序，测序成功菌落过夜培养，提取质粒(pcam1381
‑
spl7pro:spl7)以待后用。
[0112]
2.11spl7回补材料(spl7pro:spl7/spl7)的基因转化
[0113]
将测序正确的质粒spl7pro:spl7转入农杆菌gv3101，将spl7
‑
ko背景的拟南芥花器官浸泡法农杆菌溶液，获得转基因t0代植株，后代hygromycin抗性筛选获得t1代阳性植株并进行pcr鉴定，繁种至t3代spl7回补材料(记为pspl7:spl7/spl7
‑
ko)，筛选出标记为#1，#6，#7三个spl7基因回补的转基因拟南芥株系，参见图1中c和d。
[0114]
3、spl7基因敲除和基因回补的转基因拟南芥中spl7及aba合成基因aba1，nced3，aao3的表达量检测
[0115]
3.1总rna提取(详见2.2)
[0116]
3.2总rna逆转录(详见2.3)
[0117]
3.3实时定量rt
‑
pcr
[0118]
以上述反转的mrna第一链cdna为模板，使用superreal premix plus荧光定量检测试剂盒(sybr green)(tiangen公司，货号：fp205)进行spl7基因、aba1基因、nced3基因、aao3基因和内参基因actin的表达量检测，所用引物序列如表3所示。
[0119]
表3.基因检测引物序列
[0120][0121]
反应体系如下：
[0122][0123]
上述pcr体系使用quantstudio 3real
‑
time pcr扩增仪(abi公司)进行扩增，如下条件反应：95℃，15min；95℃，10s；60℃，30s；72℃，30s；40个循环；反应最后紧跟一个熔解曲线测定步骤。采用quantstudio 3real
‑
time pcr软件(abi公司)分析实验结果。
[0124]
4、spl7基因敲除和基因回补的转基因拟南芥材料的生长表型和干旱表型的参数测定
[0125]
4.1幼苗生长表型参数测定(图2)
[0126]
将各个基因型(wt,spl7
‑
1,spl7
‑
ko,pspl7:spl7/spl7
‑
ko)的种子点种于ms培养基上，置于percival植物培养箱(cu
‑
36l5)中培养(光照周期：16h光照/8h黑暗；温度周期：22℃/20℃)，5天、7天和11天后分别记录幼苗的叶片面积、根长和鲜重，如图2中a至d所示。
[0127]
4.2成苗生长表型参数测定(图2)
[0128]
将各个基因型(wt,spl7
‑
1,spl7
‑
ko,pspl7:spl7/spl7
‑
ko)的种子点种于ms培养基上，置于percival植物培养箱(cu
‑
36l5)中培养(光照周期：16h光照/8h黑暗；温度周期：22℃/20℃)，2周后移栽至装有蛭石混合土(蛭石:土＝1:1，质量比)的小钵中(每小钵中放置5株幼苗)。置于percival植物培养箱(e
‑
36l)中培养(光照周期：10h光照/14h黑暗；温度周期：22℃/20℃；湿度：50％)。2周后分别记录一个月大植株的叶片面积、根长和鲜重，如图2中e和f所示。
[0129]
4.3抗旱能力测定(图3)
[0130]
将各个基因型(wt,spl7
‑
1,spl7
‑
ko,pspl7:spl7/spl7
‑
ko)的种子点种于ms培养基上，置于percival植物培养箱(cu
‑
36l5)中培养(光照周期：16h光照/8h黑暗；温度周期：22℃/20℃)，2周后移栽至装有蛭石混合土(蛭石:土＝1:1，质量比)的小钵中(每小钵中放置9株幼苗)。置于percival植物培养箱(e
‑
36l)中培养(光照周期：10h光照/14h黑暗；温度周期：22℃/20℃；湿度：50％)。正常培养2周后停止浇水，21天后观察统计仍存活的植株数量(存活率)，并于恢复浇水3天再次观察植株表型，如图3中a和b所示。
[0131]
4.4干旱表型——单个叶片脱水率测定(图4)
[0132]
将各个基因型(wt,spl7
‑
1,spl7
‑
ko,pspl7:spl7/spl7
‑
ko)的种子点种于ms培养基上，置于percival植物培养箱(cu
‑
36l5)中培养(光照周期：16h光照/8h黑暗；温度周期：22℃/20℃)，2周后移栽至装有蛭石混合土(蛭石:土＝1:1，质量比)的小钵中，在植物培养箱中每小钵中放置5株幼苗。置于percival植物培养箱(e
‑
36l)中培养(光照周期：10h光照/
14h黑暗；温度周期：22℃/20℃；湿度：50％)。2周后取下不同基因型植株的莲座叶片，放置在60mm培养皿中，分别称量叶片刚离体时(t0)和离体后不同时间段(t为30，60，90，120，150，180，210，240，270，300min)的重量，计算单个叶片失水率(t0‑
t/t0)。取三组重复，每组每个基因型包含8片离体叶片，如图4中a和c所示。
[0133]
4.5干旱表型——叶片温度测定(图4)
[0134]
将各个基因型(wt,spl7
‑
1,spl7
‑
ko,pspl7:spl7/spl7
‑
ko)的种子点种于ms培养基上，置于percival植物培养箱(cu
‑
36l5)中培养(光照周期：16h光照/8h黑暗；温度周期：22℃/20℃)，2周后移栽至装有蛭石混合土(蛭石:土＝1:1，质量比)的小钵中，在植物培养箱中每小钵中放置9株幼苗。置于percival植物培养箱(e
‑
36l)中培养2周(光照周期：10h光照/14h黑暗；温度周期：22℃/20℃；湿度70％)。随后，将植株转移在低湿度环境(70％)中生长。3天后利用远红外相机(型号：variocam hd；品牌：infratec)检测叶片温度，如图4中b和d所示。
[0135]
4.6干旱表型——aba含量测定(图5)
[0136]
将各个基因型(wt,spl7
‑
1,spl7
‑
ko,pspl7:spl7/spl7
‑
ko)的种子点种于ms培养基上，置于percival植物培养箱(cu
‑
36l5)中培养(光照周期：16h光照/8h黑暗；温度周期：22℃/20℃)，2周后移栽至装有蛭石混合土(蛭石:土＝1:1，质量比)的小钵中(每小钵中放置9株幼苗)。置于percival植物培养箱(e
‑
36l)中培养(光照周期：10h光照/14h黑暗；温度周期：22℃/20℃；湿度：50％)。正常培养2周后停止浇水，15天后利用uplc
‑
ms/ms(武汉绿剑生物有限公司代做)检测植物体内的aba含量，如图5中b和c所示。
[0137]
4.7spl7蛋白的sbp结构域保守性分析(图6)
[0138]
以拟南芥中的spl7蛋白序列作为待查询序列，利用内置搜索工具从phytozome v12数据库(https://phytozome.jgi.doe.gov)中获得14种双子叶植物(琴叶拟南芥：arabidopsis lyrata；鼠耳芥：arabidopsis halleri；山萮菜：eutrema salsugineum；甘蓝：brassica oleracea；白菜：brassica rapa；荠菜：capsella rubella；大豆：glycine max；四季豆：phaseolus vulgaris；三叶草：trifolium pratense；野草莓：fragaria vesca；毛桃：prunus persica；黄瓜：cucumis sativus；番茄：solanum lycopersicum；马铃薯：solanum tuberosum)，8种单子叶植物(玉米：zea mays；高粱：sorghum bicolor；黍：panicum hallii；狗尾草：setaria viridis；谷子：setaria italica；水稻：oryza sativa；二穗短柄草：brachypodium distachyon；短柄草：brachypodium stacei；)，和2种苔藓植物(小立碗藓：physcomitrella patens；地钱：marchantia polymorpha)的spl7同源蛋白序列。使用mega x软件中的muscle程序在默认设置下进行多序列比对分析25种植物中spl7同源蛋白的保守性。
[0139]
比对结果如图6所示，显示spl7蛋白中的sbp结构域在陆生植物(包括双子叶植物，单子叶植物和早期登陆的苔藓植物)中高度保守。