一种酪蛋白分级沉淀纯化的方法与流程

1.本发明属于酪蛋白分离纯化领域，具体涉及酪蛋白中α
‑
酪蛋白、β
‑
酪蛋白和k
‑
酪蛋白的分离提取。


背景技术：

2.酪蛋白是哺乳动物乳汁中的一类含磷钙的结合蛋白，其含量丰富，相当于总乳成分的2.75％，含人体必需8种氨基酸，等电点4.6左右，包括α
s1
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、α
s2
‑
、β
‑
、k
‑
酪蛋白四种主要单体，α
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酪蛋白约占酪蛋白总量50％，β
‑
酪蛋白约占酪蛋白总量34％。酪蛋白在牛乳中并不是以单一组分的形式存在，而是相互交联形成类似球状的聚集体，即酪蛋白胶束，酪蛋白各组分在结构和性质上存在显著差异，单个酪蛋白组分在某些功能上更能体现酪蛋白的功能，而分离酪蛋白单体一直是研究关注的焦点。
3.酪蛋白广泛应用于运动员饮食增补剂，因为它分解缓慢，可以持续不断提供蛋白质。它还提供抗分解特性，帮助男女运动员抑制蛋白质分解。当然，酪蛋白不仅仅适合运动员，每个人都需要在饮食中包含足够的蛋白质。
4.α
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酪蛋白又称α
s
‑
酪蛋白，有两个单独的基因产物α
s1
‑
和α
s2
‑
酪蛋白组成。β
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酪蛋白是一种磷酸化蛋白质，可以被降解成多种具有生物活性的肽段，从而会更好地被婴儿吸收，并能促进矿物质在人体内的消化与吸收，对婴幼儿的骨骼和神经系统的发育具有重要的影响。β
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酪蛋白含有人体必须的8种氨基酸，在人体消化过程中，能够引起消化代谢、激素、免疫、神经和营养等多方面的应答，研究表明β
‑
酪蛋白能够大大降低过敏性，具有抗高血压、抗病毒的功能，并能防止活性蛋白变异。
5.现有技术中酪蛋白分离方法工艺复杂，生产效率低，如cn107840883中的色谱法，其主要用于科学研究领域，不适于大规模的工业制备，并且分离所用的缓冲液中会加入有毒的还原剂，一般不用作食品级原料的分离。


技术实现要素：

6.基于现有技术中存在的不足，本发明提供一种简单易行的分离不同种类酪蛋白的方法，牛乳酪蛋白中α
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酪蛋白和β
‑
酪蛋白含有的磷酸丝氨酸残基的多少决定了两种酪蛋白对钙的敏感性。碱性条件下，α
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酪蛋白对ca
2
的亲和性比β
‑
酪蛋白高；而β
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酪蛋白疏水性强，低温条件下易游离，在低温条件下，β
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酪蛋白可溶，α
‑
酪蛋白不溶。k
‑
酪蛋白是凝乳酶的天然底物，含有少量磷酸基，对钙离子不敏感，是使牛奶保持稳定的乳浊液状态的重要因子。本发明根据酪蛋白中不同物质之间性能差异，采用乙醇分离法、等电点沉淀以及低温离心等方法，得到不同种类的酪蛋白。
7.本发明的主要步骤如下:
8.(1)k
‑
酪蛋白的分离：取一定质量的酪蛋白，加入一定体积质量浓度的乙醇水溶液，充分溶解后离心20分钟取上清液，上清液旋蒸后得到k
‑
酪蛋白组分。
9.(2)α
‑
酪蛋白和β
‑
酪蛋白的分离：将(1)中离心后所得沉淀在20℃下水溶解，调节
ph7.0，在0～4℃下冷却2～6h，调节ph3.5～5.5，离心20分钟后得到α
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酪蛋白沉淀，反复溶解、沉淀，得到高纯度α
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酪蛋白；上清液升至室温，调节ph3.5～5.5，离心后得到β
‑
酪蛋白组分。
10.其中所述步骤(1)中，乙醇水溶液中乙醇质量浓度为20～80％。
11.其中所述步骤(2)中，调节ph所用的酸为盐酸，磷酸，柠檬酸，乳酸，或苹果酸，所用的碱为氢氧化钠或碳酸钠。
12.本方法操作简单易行，流程中涉及的试剂和药品种类少，只需常规设备即可，用时仅约2～3h，获得三种酪蛋白组分回收率高，可达80％，纯度可达到98％以上，适合工业化生产，有利于牛乳酪蛋白的开发利用，具有很好的应用前景。
具体实施方式
13.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
14.实施例1：
15.取一定质量的粗酪蛋白，加入一定体积质量浓度50％的乙醇溶液，充分溶解后离心20分钟取上清液，上清液旋蒸后得到k
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酪蛋白组分；再取所得沉淀，沉淀为α
‑
酪蛋白和β
‑
酪蛋白的混合物，在20℃下水溶解，调节ph至中性，在0℃下进行冷却2h，调节ph3.5，离心8000rpm，20min，离心后的沉淀即为α
‑
酪蛋白组分；上清液升至室温，调节ph3.5，离心8000rpm，20min，取沉淀，洗涤后得到β
‑
酪蛋白组分。最终得到39％的α
‑
酪蛋白组分，23％的β
‑
酪蛋白组分，10％的k
‑
酪蛋白组分，纯度95％以上。
16.实施例2：
17.取一定质量的粗酪蛋白，加入一定体积质量浓度60％的乙醇溶液，充分溶解后离心20分钟取上清液，上清液旋蒸后得到k
‑
酪蛋白组分；再取所得沉淀，沉淀为α
‑
酪蛋白和β
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酪蛋白的混合物，在20℃下水溶解，调节ph至中性，在2℃下进行冷却4h，调节ph3.5，离心8000rpm，20min，离心后的沉淀即为α
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酪蛋白组分；上清液升至室温，调节ph3.5，离心8000rpm，20min，取沉淀，洗涤后得到β
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酪蛋白组分。最终得到43％的α
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酪蛋白组分，25％的β
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酪蛋白组分，8％的k
‑
酪蛋白组分，纯度95％以上。
18.实施例3：
19.取一定质量的粗酪蛋白，加入一定体积质量浓度60％的乙醇溶液，充分溶解后离心20分钟取上清液，上清液旋蒸后得到k
‑
酪蛋白组分；再取所得沉淀，沉淀为α
‑
酪蛋白和β
‑
酪蛋白的混合物，在20℃下水溶解，调节ph至中性，在2℃下进行冷却4h，调节ph4.5，离心8000rpm，20min，离心后的沉淀即为α
‑
酪蛋白组分；上清液升至室温，调节ph4.5，离心8000rpm，20min，取沉淀，洗涤后得到β
‑
酪蛋白组分。最终得到47％的α
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酪蛋白组分，30％的β
‑
酪蛋白组分，11％的k
‑
酪蛋白组分，纯度95％以上。
20.实施例4：
21.取一定质量的粗酪蛋白，加入一定体积质量浓度70％的乙醇溶液，充分溶解后离心20分钟取上清液，上清液旋蒸后得到k
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酪蛋白组分；再取所得沉淀，沉淀为α
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酪蛋白和β
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酪蛋白的混合物，在20℃下水溶解，调节ph至中性，在4℃下进行冷却6h，调节ph4.5，离心
8000rpm，20min，离心后的沉淀即为α
‑
酪蛋白组分；上清液升至室温，调节ph4.5，离心8000rpm，20min，取沉淀，洗涤后得到β
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酪蛋白组分。最终得到41％的α
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酪蛋白组分，26％的β
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酪蛋白组分，15％的k
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酪蛋白组分，纯度95％以上。
22.实施例5：
23.取一定质量的粗酪蛋白，加入一定体积质量浓度70％的乙醇溶液，充分溶解后离心20分钟取上清液，上清液旋蒸后得到k
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酪蛋白组分；再取所得沉淀，沉淀为α
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酪蛋白和β
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酪蛋白的混合物，在20℃下水溶解，调节ph至中性，在4℃下进行冷却6h，调节ph5.5，离心8000rpm，20min，离心后的沉淀即为α
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酪蛋白组分；上清液升至室温，调节ph5.5，离心8000rpm，20min，取沉淀，洗涤后得到β
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酪蛋白组分。最终得到35％的α
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酪蛋白组分，22％的β
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酪蛋白组分，10％的k
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酪蛋白组分，纯度95％以上。
24.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。