含有重组蛋白和保护蛋白的复合物在治疗肺鳞癌中的应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药领域。具体地，本发明涉及含有重组蛋白和保护蛋白的复合物在治疗肺鳞癌中的应用。


背景技术：

2.肺癌在世界范围内都是致死率较高的肿瘤类型，其中肺鳞癌占肺癌诊断病例的30％。肺鳞癌好发于男性，与吸烟密切相关。我国是全球吸烟人数最多的国家，亦是肺鳞癌患者最多的国家。肺鳞癌常在肺部中央发病，确诊时多为晚期，手术难度大，预后效果较差。肺鳞癌通常发生大量驱动基因变异，但目前适用于肺鳞癌的靶向治疗药物很少。因此开发针对肺鳞癌变异驱动基因的新型疗法是急需解决的关键问题。
3.近年来发展了第三代基因组编辑技术，crispr/cas9系统对基因靶点的高效修改使其成为抑制肿瘤细胞驱动基因功能的有力手段。该系统由两个组分构成：rna导向的核酸内切酶cas9和单链导向rna(sgrna)。导向rna结合cas9，并介导cas9与其互补基因组序列的结合和剪切。cas9的剪切产生了双链dna断裂(dsb)，机体会通过非同源末端连接(nhej)或同源重组(hdr)方式修复，从而导致靶序列的破坏或修改。其中通过nhej方式敲除癌基因，可以简便地使其失活，达到抑制癌基因功能的目标。
4.虽然目前已有众多针对罕见病的基因编辑疗法处于临床前或临床试验阶段，例如地中海贫血和脊髓性肌萎缩症等，但针对恶性肿瘤的成功基因编辑疗法仍然很少。最重要的原因是缺乏有效的递送手段。肿瘤细胞的表面蛋白谱与同组织的正常细胞相比已发生显著变化，目前常用的基因治疗载体对肿瘤细胞的感染效率明显下降。另外包括肺鳞癌在内的多种恶性肿瘤灶都位于体内脏器，目前基因治疗载体的局部注射方式无法对全部肿瘤灶形成有效感染和治疗。因此改造基因治疗载体，提高其对目标肿瘤细胞的感染效率和特异性，使其能够以静脉或腹腔注射等系统性方式给药，是成功开发肺鳞癌和其他恶性肿瘤基因编辑疗法的重要前提。
5.目前肿瘤基因治疗临床试验最常用的载体为5型腺病毒载体(adv5)，约占临床试验总数的22％。例如通过adv5载体表达抑癌基因p53，用于治疗头颈部肿瘤。但它的受体免疫球蛋白样细胞黏附分子(cxadr)广泛表达于各种细胞表面，使其对肿瘤细胞缺乏感染特异性。而且adv5载体的免疫原性较强，大部分人体内都已存在igm抗体，会介导病毒中和效应，降低基因治疗的疗效。
6.因此，目前适于基因编辑治疗肺鳞癌的载体仍有待研究。


技术实现要素：

7.本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
8.在本发明的一个方面，本发明提出了一种重组蛋白。根据本发明的实施例，所述重组蛋白包括：上皮细胞黏附分子抗体片段；腺病毒受体免疫球蛋白样细胞黏附分子的胞外区片段；以及t4噬菌体fibritin片段，所述t4噬菌体fibritin片段的两端分别连接上皮细
胞黏附分子抗体片段和腺病毒受体免疫球蛋白样细胞黏附分子的胞外区片段。
9.上皮细胞黏附分子(epcam)是肺鳞癌细胞表面的蛋白，该重组蛋白中含有其抗体片段，从而特异性地识别并结合到肺鳞癌细胞表面。腺病毒受体免疫球蛋白样细胞黏附分子(cxadr)的胞外区片段(ecar)能够与腺病毒载体表面的knob蛋白相结合，从而锚定到腺病毒上。t4噬菌体fibritin片段连接上述两种蛋白片段，可使重组蛋白分子形成三聚化，起到稳定重组蛋白结构的作用。由此，根据本发明实施例的重组蛋白一端与腺病毒相连，另一端特异性识别肺鳞癌细胞，提高感染肺鳞癌细胞效率，从而实现腺病毒基因编辑治疗，为肺鳞癌治疗提供了科学研究和临床应用基础，应用前景好。
10.根据本发明的实施例，上述重组蛋白还可以具有下列附加技术特征：
11.根据本发明的实施例，所述上皮细胞黏附分子抗体片段具有如seq id no：1所示的氨基酸序列。
12.根据本发明的实施例，所述腺病毒受体免疫球蛋白样细胞黏附分子的胞外区片段具有如seq id no：2所示的氨基酸序列。
13.根据本发明的实施例，所述t4噬菌体fibritin片段具有如seq id no：3所示的氨基酸序列。
14.根据本发明的实施例，所述重组蛋白具有如seq id no：4所示的氨基酸序列。
15.在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸可操作地连接有编码上皮细胞黏附分子抗体的片段、编码腺病毒受体免疫球蛋白样细胞黏附分子的胞外区的片段以及编码t4噬菌体fibritin的片段。由此，利用根据本发明实施例的核酸编码的重组蛋白一端与腺病毒相连，另一端特异性识别肺鳞癌细胞，提高感染肺鳞癌细胞效率，从而实现腺病毒基因编辑治疗，为肺鳞癌治疗提供了科学研究和临床应用基础，应用前景好。
16.根据本发明的实施例，所述核酸具有如seq id no：5所示的核苷酸序列。
17.在本发明的又一方面，本发明提出了一种复合物。根据本发明的实施例，所述复合物包括：前面所述重组蛋白或由前面所述核酸编码的重组蛋白；以及保护蛋白，所述保护蛋白包括：腺病毒表面蛋白hexon抗体片段；以及t4噬菌体fibritin片段，所述t4噬菌体fibritin片段与腺病毒表面蛋白hexon抗体片段相连。如前所述，重组蛋白可以特异性识别并结合肺鳞癌细胞上。该保护蛋白上含有腺病毒表面蛋白hexon抗体片段，能够特异性识别腺病毒表面的hexon蛋白，在特异性感染肺鳞癌细胞的同时，将降低机体对腺病毒的免疫反应，从而使得腺病毒能够更好地发挥基因编辑治疗效果。由此，根据本发明实施例的复合物能够特异性感染肺鳞癌细胞，且降低机体对腺病毒的免疫反应，从而实现基因编辑治疗，为肺鳞癌治疗提供了科学研究和临床应用基础，应用前景好。
18.根据本发明的实施例，所述腺病毒表面蛋白hexon抗体片段具有如seq id no：6所示的氨基酸序列。
19.根据本发明的实施例，所述t4噬菌体fibritin片段具有如seq id no：3所示的氨基酸序列。
20.根据本发明的实施例，所述保护蛋白具有如seq id no：7所示的氨基酸序列，编码所述保护蛋白的核酸具有如seq id no：8所示的核苷酸序列。
21.在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组腺病毒载体。根据本发明的实施例，
所述重组腺病毒载体包括：携带有前面所述重组蛋白或由前面所述核酸编码的重组蛋白的腺病毒载体。由此，根据本发明实施例的重组腺病毒载体能够特异性高效感染肺鳞癌细胞，从而实现基因编辑治疗，为肺鳞癌治疗提供了科学研究和临床应用基础，应用前景好。
22.根据本发明的实施例，所述腺病毒载体进一步携带有保护蛋白，所述保护蛋白包括：腺病毒表面蛋白hexon抗体片段；以及t4噬菌体fibritin片段，所述t4噬菌体fibritin片段与所述腺病毒表面蛋白hexon抗体片段相连。
23.根据本发明的实施例，所述腺病毒表面蛋白hexon抗体片段具有如seq id no：6所示的氨基酸序列。
24.根据本发明的实施例，所述t4噬菌体fibritin片段具有如seq id no：3所示的氨基酸序列。
25.根据本发明的实施例，所述保护蛋白具有如seq id no：7所示的氨基酸序列。
26.根据本发明的实施例，所述重组蛋白和保护蛋白是以前面所述复合物的形式提供的。
27.根据本发明的实施例，所述重组蛋白与所述腺病毒载体表面的knob蛋白结合，所述保护蛋白与所述腺病毒载体表面的hexon蛋白结合。
28.根据本发明的实施例，所述腺病毒载体选自adv5腺病毒，可表达cas9酶、目的基因导向rna、knob蛋白和hexon蛋白。
29.在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述重组腺病毒载体的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述重组蛋白或者前面所述复合物与腺病毒载体共孵育，以便使得所述重组蛋白或复合物与腺病毒载体结合，得到重组腺病毒载体。由此，根据本发明实施例的方法所得到的重组腺病毒载体能够特异性高效感染肺鳞癌细胞，从而实现基因编辑治疗，为肺鳞癌治疗提供了科学研究和临床应用基础，应用前景好。
30.在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述重组蛋白、由前面所述核酸编码的重组蛋白、前面所述复合物或重组腺病毒载体在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，所述药物用于治疗肺鳞癌。如前所述，重组蛋白或复合物能够特异性高效感染肺鳞癌细胞，并可以降低机体对重组腺病毒载体的免疫反应，实现更好地治疗目的。
31.根据本发明的实施例，所述肺鳞癌细胞表达上皮细胞黏附分子。
32.在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前面所述重组蛋白、复合物或重组腺病毒载体；以及药学上可接受的辅料、载体、赋形剂、溶媒或它们的组合。由此，根据本发明实施例的药物组合物能够特异性高效感染肺鳞癌细胞，并可以降低机体对该药物组合物的免疫反应，实现更好地治疗肺鳞癌的目的。
33.本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
34.本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
35.图1显示了本发明一个实施例的重组蛋白对腺病毒在肺鳞癌细胞h520中的感染效
率影响示意图；
36.图2显示了根据本发明一个实施例的重组腺病毒载体结构示意图；
37.图3显示了根据本发明一个实施例的重组蛋白和保护蛋白对腺病毒的感染特异性的比较示意图；
38.图4显示了根据本发明一个实施例的保护蛋白对腺病毒免疫反应的影响示意图；
39.图5显示了根据本发明一个实施例的保护蛋白对腺病毒肝毒性影响示意图；
40.图6显示了根据本发明一个实施例的以靶向epcam腺病毒为载体敲除mecom基因抑制肺鳞癌pdx肿瘤生长，其中，a为肺鳞癌pdx模型的肿瘤生长曲线；b为观察终点肿瘤照片；c为病毒注射7天后的mecom基因位点编辑状况；d为病毒注射7天后的mecom基因和下游信号分子rps6的表达和磷酸化状况；e为观察终点小鼠肝、肺、肾组织的he染色。
具体实施方式
41.下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
42.本发明提出了重组蛋白、核酸、复合物、重组腺病毒载体及其制备方法和用途，下面将分别对其进行详细描述。
43.重组蛋白
44.在本发明的一个方面，本发明提出了一种重组蛋白。根据本发明的实施例，所述重组蛋白包括：上皮细胞黏附分子抗体片段；腺病毒受体免疫球蛋白样细胞黏附分子的胞外区片段；以及t4噬菌体fibritin片段，t4噬菌体fibritin片段的两端分别连接上皮细胞黏附分子抗体片段和腺病毒受体免疫球蛋白样细胞黏附分子的胞外区片段。
45.上皮细胞黏附分子(epcam)是肺鳞癌细胞表面的蛋白，该重组蛋白中含有其抗体片段，从而特异性地识别并结合到肺鳞癌细胞表面。腺病毒受体免疫球蛋白样细胞黏附分子(cxadr)的胞外区片段(ecar)能够与腺病毒载体表面的knob蛋白相结合，从而锚定到腺病毒上。t4噬菌体fibritin片段连接上述两种蛋白片段，可使重组蛋白分子形成三聚化，起到稳定重组蛋白结构的作用。由此，根据本发明实施例的重组蛋白一端与腺病毒相连，另一端特异性识别肺鳞癌细胞，提高感染肺鳞癌细胞效率，从而实现腺病毒基因编辑治疗，为肺鳞癌治疗提供了科学研究和临床应用基础，应用前景好。
46.根据本发明的实施例，上皮细胞黏附分子抗体片段具有如seq id no：1所示的氨基酸序列。发明人对人源上皮细胞黏附分子epcam单链抗体(scfv)序列进行密码子优化及合成，发现具有seq id no：1所示氨基酸序列的上皮细胞黏附分子抗体片段可以特异性识别并结合到肺鳞癌细胞表面的上皮细胞黏附分子，从而提高感染效率。
47.ggggsggggsggggsggggselqmtqspsslsasvgdrvtitcrtsqsissylnwyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedsatyycqqsydipytfgqgtkleikggggsggggsggggsevqllesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvavisydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakdmgwgsgwrpyyyygmdvwgqgttvtvssg(seq id no：1)
48.根据本发明的实施例，腺病毒受体免疫球蛋白样细胞黏附分子(cxadr)的胞外区片段(ecar)具有如seq id no：2所示的氨基酸序列。由此，可以特异性地与腺病毒表面的knob蛋白结合。
49.malllcfvllcgvvdfarslsittpeemiekakgetaylpckftlspedqgpldiewlispadnqkvdqviilysgdkiyddyypdlkgrvhftsndlksgdasinvtnlqlsdigtyqckvkkapgvankkihlvvlvkpsgarcyvdgseeigsdfkikcepkegslplqyewqklsdsqkmptswlaemtssvisvknasseysgtysctvrnrvgsdqcllrlnvvppsnkag(seq id no：2)
50.根据本发明的实施例，t4噬菌体fibritin片段具有如seq id no：3所示的氨基酸序列。fibritin片段连接上皮细胞黏附分子epcam抗体和腺病毒受体免疫球蛋白样细胞黏附分子(cxadr)的胞外区(ecar)这两种蛋白片段，可使重组蛋白分子形成三聚化，起到稳定重组蛋白结构的作用。
51.rgltnsikanetniasvtqevntakgnisslqgdvqalqeagyipeaprdgqayvrkdgewvflstflspa(seq id no：3)
52.根据本发明的实施例，重组蛋白具有如seq id no：4所示的氨基酸序列。由此，该重组蛋白一端与腺病毒相连，另一端特异性识别肺鳞癌细胞，提高感染肺鳞癌细胞效率，从而更好地使腺病毒发挥基因编辑治疗目的。
53.malllcfvllcgvvdfarslsittpeemiekakgetaylpckftlspedqgpldiewlispadnqkvdqviilysgdkiyddyypdlkgrvhftsndlksgdasinvtnlqlsdigtyqckvkkapgvankkihlvvlvkpsgarcyvdgseeigsdfkikcepkegslplqyewqklsdsqkmptswlaemtssvisvknasseysgtysctvrnrvgsdqcllrlnvvppsnkagrgltnsikanetniasvtqevntakgnisslqgdvqalqeagyipeaprdgqayvrkdgewvflstflspaggggsggggsggggsggggselqmtqspsslsasvgdrvtitcrtsqsissylnwyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedsatyycqqsydipytfgqgtkleikggggsggggsggggsevqllesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvavisydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakdmgwgsgwrpyyyygmdvwgqgttvtvssg(seq id no：4)
54.核酸
55.在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，该核酸可操作地连接有编码上皮细胞黏附分子抗体的片段、编码腺病毒受体免疫球蛋白样细胞黏附分子的胞外区的片段以及编码t4噬菌体fibritin的片段。由此，利用根据本发明实施例的核酸编码的重组蛋白一端与腺病毒相连，另一端特异性识别肺鳞癌细胞，提高感染肺鳞癌细胞效率，从而实现腺病毒基因编辑治疗，为肺鳞癌治疗提供了科学研究和临床应用基础，应用前景好。
56.根据本发明的实施例，核酸具有如seq id no：5所示的核苷酸序列。
57.atggcgctcctgctgtgcttcgtgctcctgtgcggagtagtggatttcgccagaagtttgagtatcactactcctgaagagatgattgaaaaagccaaaggggaaactgcctatctgccatgcaaatttacgcttagtcccgaagaccagggaccgctggacatcgagtggctgatatcaccagctgataatcagaaggtggatcaagtgattattttatattctggagacaaaatttatgatgactactatccagatctgaaaggccgagtacattttacgagtaatgatctcaaatctggtgatgcatcaataaatgtaacgaatttacaactgtcagatattggcacatatcagtgcaaagtgaaaaaagctcctggtgttgcaaataagaagattcatctggtagttcttgttaagccttcaggtgcgagatgttacgttgatggatctgaagaaattggaagtgactttaagataaaatgtgaaccaaaagaaggttcacttccattacagtatgagtggcaaaaattgtctgactcacagaaaatgcccacttcatggttagcagaaatgacttcatctgttatatctgtaaaaaatgcctcttctgagtactctgggacatacagctgtacagtcagaaacagagtgggctctgatcagtgcctgttgcgtctaaacgttgtccctccttcaaataaagctggacgcggattaaccaattcaataaaagctaacgaaactaacat
tgcatcagttacacaagaagtgaatacagctaaaggcaatatatcttctttacaaggtgatgttcaagctctccaagaagccggttatattcctgaagctccaagagatgggcaagcttacgttcgtaaagatggcgaatgggtattcctttctacctttttatcaccagcaggcggagggggatcaggaggcggagggtcaggaggaggcggaagcggagggggaggcagcgagctgcagatgactcagagcccttcctcactgtctgccagtgtgggcgaccgagtcaccatcacatgccggacctcacagagcattagctcctacctgaactggtatcagcagaaacctggacagccccctaagctgctgatctactgggcaagcaccagagagtccggagtgccagacaggttctccggatctggcagtgggacagattttactctgaccatttctagtctgcagcccgaggactctgctacttactattgccagcagagctacgatatcccttatactttcggacagggcaccaaactggaaattaagggcgggggaggctcaggaggaggagggagcggcggaggaggcagcgaggtgcagctgctggaaagcggaggaggagtggtccagccaggacgatctctgagactgagttgtgccgcttcaggcttcacattttcaagctatggaatgcactgggtgcgacaggcacctggaaagggactggagtgggtggctgtcatcagctacgacggctccaacaaatactatgcagatagcgtgaaggggaggtttaccatttctcgcgataacagtaaaaatacactgtacctgcagatgaatagcctgagggccgaagacactgctgtgtactattgcgctaaggatatgggatgggggtccggatggcgaccatactattactatgggatggacgtgtggggccaggggaccaccgtgaccgtgtcctcagggtaa(seq id no：5)
58.复合物
59.在本发明的又一方面，本发明提出了一种复合物。根据本发明的实施例，该复合物包括：前面所述重组蛋白或由前面所述核酸编码的重组蛋白；以及保护蛋白，保护蛋白包括：腺病毒表面蛋白hexon抗体片段；以及t4噬菌体fibritin片段，t4噬菌体fibritin片段与腺病毒表面蛋白hexon抗体片段相连。如前所述，重组蛋白可以特异性识别并结合肺鳞癌细胞上。保护蛋白上含有腺病毒表面蛋白hexon抗体片段，能够特异性识别腺病毒表面的hexon蛋白，在特异性感染肺鳞癌细胞的同时，将降低机体对腺病毒的免疫反应，从而使得腺病毒能够更好地发挥基因编辑治疗效果。同时，连接上t4噬菌体fibritin片段起到稳定保护蛋白结构的作用。由此，根据本发明实施例的复合物能够特异性感染肺鳞癌细胞，且降低机体对腺病毒的免疫反应，从而实现基因编辑治疗，为肺鳞癌治疗提供了科学研究和临床应用基础，应用前景好。
60.需要说明的是，本发明所描述的复合物中，重组蛋白与保护蛋白之间的位置关系不作严格限定，既可以是无接触的，也可以是有连接关系。
61.根据本发明的实施例，腺病毒表面蛋白hexon抗体(scfv)片段具有如seq id no：6所示的氨基酸序列。由此，可以特异性地识别腺病毒表面的hexon蛋白结合，提高感染肺鳞癌细胞的特异性，且降低机体对腺病毒的免疫反应。
62.mgsshhhhhhssglvprgshqvqlvqsgaedkkpgasvkvsckvsgfslgrygvhwvrqapgqglewmgviwrggttdynakfqgrvtitkddskstvymelsslrsedtavyycarqgsnfplaywgqgtlvtvssggggsggggsggggsdivmtqspsslsasvgdrvtitckasqsvtndaawyqkkpgkapklliyqastrytgvpsrfsgsgygtdftltisslqpedfatyfchqdysspltfgqgtkveikrggggsggggsggggs(seq id no：6)
63.根据本发明的实施例，t4噬菌体fibritin片段具有如seq id no：3所示的氨基酸序列。
64.根据本发明的实施例，保护蛋白具有如seq id no：7所示的氨基酸序列，编码保护蛋白的核酸具有如seq id no：8所示的核苷酸序列。
65.mgsshhhhhhssglvprgshqvqlvqsgaedkkpgasvkvsckvsgfslgrygvhwvrqapgqglewm
gviwrggttdynakfqgrvtitkddskstvymelsslrsedtavyycarqgsnfplaywgqgtlvtvssggggsggggsggggsdivmtqspsslsasvgdrvtitckasqsvtndaawyqkkpgkapklliyqastrytgvpsrfsgsgygtdftltisslqpedfatyfchqdysspltfgqgtkveikrggggsggggsggggsrgltnsikanetniasvtqevntakgnisslqgdvqalqeagyipeaprdgqayvrkdgewvflstflspa(seq id no：7)
66.atgggcagcagccatcatcatcatcatcacagcagcggcctggtgccgcgcggcagccatcaagtacaactcgtacaatccggcgccgaagacaaaaaacccggcgcctccgtaaaagtatcctgcaaagtatcaggattctccctaggccgatacggcgtacactgggtacgacaagcccccggccaaggcctagaatggatgggagtcatctggcgcggcggaaccacagactacaacgccaaattccaaggccgagtaaccatcaccaaagacgactccaaatcaaccgtatacatggaactatcctcactccgctccgaagacaccgccgtatactactgcgcccgacaaggctccaacttccccctagcctactggggccaaggcaccctagtaaccgtatcctcaggcggagggggatcaggaggcggagggtcaggaggaggcggaagcgatatcgtaatgacccaatccccctcctcactctccgcctccgtaggcgaccgagtaaccatcacctgcaaagcctcccaatccgtaaccaacgacgccgcctggtaccaaaaaaaacccggcaaagcccccaaactactaatctaccaagcctccacccgatacaccggcgtaccctcccgattctccggctcaggctacggcaccgacttcacactcaccatctcctcactccaacccgaagacttcgccacctacttctgccaccaagactactcctcacccctaacattcggccaaggaacaaaagtagaaataaaacgcggaggcggagggtcaggaggaggcggaagcggagggggaggcagccgcggattaaccaattcaataaaagctaacgaaactaacattgcatcagttacacaagaagtgaatacagctaaaggcaatatatcttctttacaaggtgatgttcaagctctccaagaagccggttatattcctgaagctccaagagatgggcaagcttacgttcgtaaagatggcgaatgggtattcctttctacctttttatcaccagcatga(seq id no：8)
67.重组腺病毒载体
68.在本发明的又一方面，本发明提出了一种重组腺病毒载体。根据本发明的实施例，该重组腺病毒载体包括：携带有前面所述重组蛋白或由前面所述核酸编码的重组蛋白的腺病毒载体。由此，根据本发明实施例的重组腺病毒载体能够特异性高效感染肺鳞癌细胞，从而实现基因编辑治疗，为肺鳞癌治疗提供了科学研究和临床应用基础，应用前景好。
69.根据本发明的实施例，腺病毒载体进一步携带有保护蛋白。该保护蛋白与前面所述复合物中针对保护蛋白所描述的特征和优点一致，在此不再赘述。
70.需要说明的是，重组腺病毒载体中重组蛋白和保护蛋白的存在形式不作严格限定，既可以单独存在，发挥各自的功能，也可以以复合物(复合蛋白)的形式作为一个整体来提供，具体可以根据实际情况灵活选择，在此不再赘述。
71.根据本发明的实施例，重组蛋白与腺病毒载体表面的knob蛋白结合，保护蛋白与腺病毒载体表面的hexon蛋白结合。重组蛋白可通过ecar片段与腺病毒载体表面的knob蛋白结合，保护蛋白可通过hexon scfv片段与腺病毒载体表面的hexon蛋白结合。
72.根据本发明的实施例，腺病毒载体选自adv5腺病毒，可表达cas9酶、目的基因导向rna、knob蛋白和hexon蛋白。由此，该腺病毒载体可以与重组蛋白和保护蛋白结合，从而特异性高效感染肺鳞癌细胞，并在cas9酶和目的基因导向rna的作用下作用于肺鳞癌细胞中靶序列，从而起到治疗目的。
73.本领域技术人员能够理解的是，前面针对重组蛋白、核酸和复合物所描述的特征和优点，同样适用于该重组腺病毒载体，在此不再赘述。
74.制备重组腺病毒载体的方法
75.在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述重组腺病毒载体的方法。
根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述重组蛋白、重组蛋白和重组腺病毒载体中的所述保护蛋白或者前面所述复合物与腺病毒载体共孵育，以便使得重组蛋白或复合物与腺病毒载体结合，得到重组腺病毒载体。由此，根据本发明实施例的方法所得到的重组腺病毒载体能够特异性高效感染肺鳞癌细胞，从而实现基因编辑治疗，为肺鳞癌治疗提供了科学研究和临床应用基础，应用前景好。
76.本领域技术人员能够理解的是，前面针对重组蛋白和复合物所描述的特征和优点，同样适用于该制备重组腺病毒载体的方法，在此不再赘述。
77.用途
78.在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述重组蛋白、由前面所述核酸编码的重组蛋白、前面所述复合物或重组腺病毒载体在制备药物中的用途。根据本发明的实施例，该药物用于治疗肺鳞癌。如前所述，重组蛋白或复合物能够特异性高效感染肺鳞癌细胞，并可以降低机体对重组腺病毒载体的免疫反应，实现更好地治疗目的。
79.根据本发明的实施例，肺鳞癌细胞表达上皮细胞黏附分子。由此，重组蛋白才可以特异性识别并结合到肺鳞癌细胞上。
80.本领域技术人员能够理解的是，前面针对重组蛋白、核酸和复合物所描述的特征和优点，同样适用于该用途，在此不再赘述。
81.药物组合物
82.在本发明的又一方面，本发明提出了一种药物组合物。根据本发明的实施例，所述药物组合物包括：前面所述重组蛋白、复合物或重组腺病毒载体；以及药学上可接受的辅料、载体、赋形剂、溶媒或它们的组合。由此，根据本发明实施例的药物组合物能够特异性高效感染肺鳞癌细胞，并可以降低机体对该药物组合物的免疫反应，实现更好地治疗肺鳞癌的目的。
83.术语“治疗”用于指获得期望的药理学和/或生理学效果。所述效果就完全或部分预防疾病或其症状而言可以是预防性的，和/或就部分或完全治愈疾病和/或疾病导致的不良作用而言可以是治疗性的。本文使用的“治疗”涵盖哺乳动物、特别是人的疾病，包括：(a)在容易患病但是尚未确诊得病的个体中预防疾病或病症发生；(b)抑制疾病，例如阻滞疾病发展；或(c)缓解疾病，例如减轻与疾病相关的症状。本文使用的“治疗”涵盖将药物或化合物给予个体以治疗、治愈、缓解、改善、减轻或抑制个体的疾病的任何用药，包括但不限于将含本文所述化合物的药物给予有需要的个体。
84.下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
85.实施例1
86.1、3种重组蛋白对腺病毒感染效率的影响
87.表达gfp的5型腺病毒(adv5)分别与3种重组蛋白按比例(1
×
10-7
pmol/vp)混合后室温预孵育2小时，然后感染epcam阳性表达的肺鳞癌细胞系h520。48小时后通过流式细胞仪检测gfp阳性细胞的比例(感染效率)。
88.结果如图1所示，其为2次实验的平均值，*为非配对t检验p<0.05。可以看出，重组
蛋白1对腺病毒的感染效率有最显著的上调。
89.重组蛋白1：具有seq id no：4所示的氨基酸序列。
90.重组蛋白2：具有seq id no：9所示的氨基酸序列。
91.重组蛋白3：具有seq id no：10所示的氨基酸序列。
92.malllcfvllcgvvdfarslsittpeemiekakgetaylpckftlspedqgpldiewlispadnqkvdqviilysgdkiyddyypdlkgrvhftsndlksgdasinvtnlqlsdigtyqckvkkapgvankkihlvvlvkpsgarcyvdgseeigsdfkikcepkegslplqyewqklsdsqkmptswlaemtssvisvknasseysgtysctvrnrvgsdqcllrlnvvppsnkagrgltnsikanetniasvtqevntakgnisslqgdvqalqeagyipeaprdgqayvrkdgewvflstflspaggggsggggsggggsggggselqmtqspsslsasvgdrvtitcrtsqsissylnwyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsesgtnytltisslqpedfatyfcqqsdslpitfgqgtrldiqggggsggggsggggsevqllesgggvvqpgrslrlscaasgftfssygmhwvrqapgkglewvavisydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakdmgwgsgwrpyyyygmdvwgqgttvtvssg(seq id no：9)
93.malllcfvllcgvvdfarslsittpeemiekakgetaylpckftlspedqgpldiewlispadnqkvdqviilysgdkiyddyypdlkgrvhftsndlksgdasinvtnlqlsdigtyqckvkkapgvankkihlvvlvkpsgarcyvdgseeigsdfkikcepkegslplqyewqklsdsqkmptswlaemtssvisvknasseysgtysctvrnrvgsdqcllrlnvvppsnkagrgltnsikanetniasvtqevntakgnisslqgdvqalqeagyipeaprdgqayvrkdgewvflstflspaggggsggggsggggsggggselqmtqspsslsasvgdrvtitcrtsqsissylnwyqqkpgqppklliywastresgvpdrfsgsgsgtdftltisslqpedsatyycqqsydipytfgqgtkleikggggsggggsggggsevqllesggvvvqpggslrlscaasgftfddyamhwvrqapgkglewvavisydgsnkyyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycakkegywgqgtlvtvssg(seq id no：10)
94.2、重组蛋白1和保护蛋白提高腺病毒的感染特异性
95.裸鼠皮下注射肺鳞癌细胞系h520，成瘤后，瘤内或尾静脉注射腺病毒(adv，1
×
10
10
vp)或其与重组蛋白1(3
×
10-5
pmol/vp)和保护蛋白(3
×
10-5
pmol/vp)的复合物(参见图2)。48小时后收集肿瘤、肝、肺和肾组织，通过real-time pcr检测各种组织中腺病毒基因组dna的丰度。
96.如图3所示，其为2次平行实验的平均值，*为非配对t检验p<0.05，腺病毒相对丰度是realtime pcr检测到的各种组织中腺病毒dna和内参基因glucagon dna丰度的比值，i.t.和i.v.分别指瘤内和尾静脉注射病毒。两种蛋白能显著提高腺病毒对肿瘤组织的感染，并降低其对肝、肺、肾组织的感染，尤其是降低对肝脏的感染。直接注射腺病毒静脉时主要感染肝脏，这种非特异性感染是限制该病毒临床应用的一个主要原因，另一个是免疫原性。采用重组蛋白和保护蛋白与腺病毒结合，可以显著提高其对epcam阳性肺鳞癌肿瘤的感染特异性。
97.3、保护蛋白降低腺病毒的免疫反应
98.表达gfp的5型腺病毒(adv5)与靶向epcam的重组蛋白1(1
×
10-7
pmol/vp)和保护蛋白(5
×
10-7
pmol/vp)混合后室温预孵育2小时，然后感染epcam阳性表达的肺鳞癌细胞系h520。48小时后通过流式细胞仪检测gfp阳性细胞的比例。
99.图4结果为2次实验的平均值，*为非配对t检验p<0.05，图4a中相对感染效率是腺病毒和蛋白复合物感染h520细胞后gfp阳性细胞比率与普通腺病毒感染后gfp阳性细胞比率的比值。可以看出，1
×
10-7
pmol/vp的重组蛋白1与adv5混合物，可以显著上调adv对h520
细胞的感染效率。加入5μl肺癌患者血清会引起抗体中和反应，显著抑制重组蛋白与病毒复合物的感染效率。而5
×
10-7
pmol/vp的保护蛋白与重组蛋白和腺病毒形成的复合物可以有效抵抗肺癌患者血清的中和反应，维持adv对h520细胞的感染效率。
100.c57bl6小鼠皮下注射鼠肺癌细胞lewis，成瘤后，瘤内或尾静脉注射腺病毒(adv，1
×
10
10
vp)或其与重组蛋白1(3
×
10-5
pmol/vp)和保护蛋白(3
×
10-5
pmol/vp)的复合物。7天后收集血清，通过elisa检测adv抗体。如图4b所示，单独注射adv或其与重组蛋白的复合物都诱导抗adv抗体的生成，加入保护蛋白能显著降低抗体的生成。
101.4、保护蛋白降低腺病毒的肝毒性
102.c57bl6小鼠皮下注射鼠肺癌细胞lewis，成瘤后，瘤内或尾静脉注射腺病毒(adv,1
×
10
10
vp)或其与重组蛋白1(3
×
10-5
pmol/vp)和保护蛋白(3
×
10-5
pmol/vp)的复合物。7天后收集肝组织，通过he染色和血清转氨酶浓度来检测肝脏损伤程度。如图5a所示，adv及其与重组蛋白的复合物都会引起肝细胞的膨胀和变形，这是肝脏炎症反应的指征。加入保护蛋白能保护肝细胞，避免发生炎症反应。另外，保护蛋白能降低adv引起的血清转氨酶上升(图5b，为2次平行实验的平均值，*为非配对t检验p<0.05)。
103.5、以靶向epcam的腺病毒为载体，在肺鳞癌pdx鼠模型中特异性敲除mecom基因的效果
104.在lusc021pdx鼠模型中尾静脉注射表达sacas9和mecom基因导向rna(grna)的腺病毒(1
×
10
10
vp)、靶向epcam的重组蛋白1(3
×
10-5
pmol/vp)和保护蛋白(3
×
10-5
pmol/vp)的复合物(mecom-ko)，或对照病毒蛋白复合物(nt)。每12天注射一次，观察肿瘤生长状况，共52天，每组4只小鼠。病毒注射7天后取肿瘤组织，通过t7e1和免疫印迹实验检测mecom基因敲除效果。肿瘤生长曲线和第52天的肿瘤大小测量结果显示，与对照病毒组(nt)相比，mecom基因敲除组肿瘤生长均受到显著抑制(图6a和6b，单因素方差分析p<0.05)。t7e1和免疫印迹结果显示靶向epcam的腺病毒蛋白复合物能够在肺鳞癌肿瘤组织中有效编辑mecom基因，下调其基因表达和下游信号分子rps6的表达和磷酸化水平(图6c和6d)。第52天的肝、肺、肾组织he染色显示尾静脉注射的腺病毒蛋白复合物并未引起重要组织损伤(图6e)。这些结果表明以靶向epcam的腺病毒载体对mecom进行基因编辑，能显著抑制肺鳞癌生长，并保证安全性。
105.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
106.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。